Pollo Ex ovo Cultura y Ex ovo CAM Ensayo: cómo funciona realmente

Resumen

La chica membrana corioalantoidea (CAM) es un entorno único, apoyo la cultura, naturalmente, inmunodeficientes para estudiar la angiogénesis y la tumorigénesis. Este artículo video demuestra las diferentes etapas de pollo Ex ovo Cultura, aplicación de sustancias potencialmente angiogénicos y la inoculación exitosa de las células tumorales y tejidos en la superficie de la CAM.

Resumen

Los huevos de gallina en la primera fase de cría se encuentran entre in vitro e in vivo en los sistemas y proporcionar un entorno de pruebas vasculares no sólo para estudiar la angiogénesis, sino también para estudiar la génesis tumoral. Después de la membrana corioalantoidea de pollo (CAM) ha desarrollado, la red de vasos sanguíneos se puede acceder fácilmente, manipulado y observado y por lo tanto proporciona un ajuste óptimo para los ensayos de la angiogénesis. Dado que el sistema linfático no se desarrolla completamente hasta las últimas etapas de incubación, el embrión de pollo sirve como anfitrión natural inmunodeficientes capaz de sostener los tejidos injertados y las células sin las restricciones propias de cada especie. Además de fomentar el desarrollo de asignación y xenoinjertos, la sangre CAM red de vasos proporciona un entorno único de apoyo para intravasation de las células tumorales, la difusión, y la detención vascular y un depósito donde las células detenidas extravasado para formar micro focos metastásicos.

Con fines experimentales, en la mayoría de los estudios recientes de la CAM fue expuesto por el corte de una ventana a través de la cáscara del huevo y los experimentos se llevaron a cabo in ovo, dando lugar a importantes limitaciones en la accesibilidad de la CAM y las posibilidades de observación y documentación fotográfica de los efectos. Cuando caparazón culturas del embrión de pollo se utilizaron ^4.1, no se proporcionaron detalles del experimento y, si se ha publicado en todos, las tasas de supervivencia de estas culturas eran bajos. Hemos perfeccionado el método de cultivo ex ovo de embriones de pollo de manera significativa mediante la introducción de una extrusión racionalmente controlado el contenido del huevo. Estas culturas ex ovo mejorar la accesibilidad de la CAM de embriones de pollo y, lo que permite fácil en la documentación vivo de los efectos y facilitar la manipulación experimental del embrión. Esto permite la aplicación con éxito a un gran número de preguntas de carácter científico: (1) Como un ensayo de angiogénesis mejora de ^5,6, (2) un montaje experimental para facilitar las inyecciones en el humor vítreo del ojo del embrión de pollo ^7-9, (3) como un entorno de prueba para la difusión y intravasation de la dispersión de las células tumorales de líneas celulares establecidas inoculados en la CAM ^10-12, (4) como un sistema mejorado para mantener el éxito del trasplante y la cultura de los esbozos de los miembros de pollo y ratones, así como ¹³ (5 ) para el injerto, propagación y re-injerto de tejido de tumores sólidos primarios obtenidos de las biopsias en la superficie de la CAM ^14.

En este artículo se describe el vídeo establecimiento de una cultura refinada chica ex ovo y el ensayo de CAM con tasas de supervivencia superiores al 50%. Además le ofrecemos una demostración paso a paso de la aplicación exitosa de la cultura ovo ex de un gran número de aplicaciones científicas.

Daniel S. Dohle, Susanne D. Pasa, y Gustmann Sebastián contribuyeron igualmente a este estudio.

Protocolo

Todos los equipos y reactivos para comprar estéril o tiene que ser calor o vapor esterilizado o esterilizado con EtOH al 70%.

Los autores afirman que los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las Comunidades Europeas la Directiva del Consejo (86/609/CEE), siguiendo las directrices de los NIH sobre el cuidado y uso de animales en los procedimientos experimentales y los reglamentos establecidos por el Comité Institucional la atención y el empleo Comisión (IACUC) de la Universidad de Duisburg-Essen (Alemania).

Parte 1: La incubación de los huevos

1. Los huevos fertilizados pueden ser almacenados a 13 º C durante un máximo de una semana.
2. Los huevos son incubados durante 72 horas, en posición horizontal en una incubadora con una bandeja de movimiento, la rotación de los huevos 12 veces al día continuamente. La humedad se mantiene a 60 - 62%, temperatura de incubación a 37,5 ° C.
   Nota: Antes de comenzar la incubación, la suciedad, las plumas y los excrementos son cuidadosamente de las cáscaras de huevo mecánicamente por secarla con toallas comunes, en zig-zag gris papel para las manos, que tienen un duro en lugar de una estructura de superficie blanda. Limpieza de los huevos con etanol u otro desinfectante, sin embargo, redujo significativamente la tasa de supervivencia de los embriones, independientemente de que el líquido utilizado.

Parte 2: Ex ovo cultura

1. Después de la incubación durante 72 horas, los huevos son retirados de la incubadora.
   Nota: Los huevos son incubados durante 72 horas debido a que - de acuerdo a nuestras experiencias - por razones desconocidas, pero de acuerdo con Auerbach et al1 etapas de desarrollo anteriores eran mucho más bajas tasas de supervivencia. En etapas posteriores de 72 horas el saco vitelino, que aún no está cubierto por la CAM se vuelve más delgada y tiende a adherirse a la cáscara del huevo líder (i) a pequeñas hemorragias en la zona de adherencia y (ii) la ruptura de la yema del saco membrana. Por lo tanto, el método presentado no es aplicable a los embriones de más de 72 horas.
2. La parte superior de los huevos, cuando el embrión se encuentra, está marcada por el lápiz desde el embrión resiste la rotación hasta cierto punto.
3. El huevo está en posición horizontal con la marca del lápiz en la parte superior y agrietadas en el borde de un 80 mm triangular barra de agitación magnética por la que se orientados perpendicularmente al eje longitudinal del huevo.
   Nota: Para una mejor sensación, no se debe utilizar guantes, pero las manos se deben desinfectar con un 70% EtOH. Es importante que la cáscara del huevo, así como la membrana del huevo se abrió. Fugas de clara de huevo es un signo seguro de que la membrana del huevo se ha perforado.
4. El huevo se mantiene cerca de la parte inferior de la placa de Petri para evitar escapes de clara de huevo.
   Nota: Durante el proceso de apertura inicial, es importante que la clara de huevo en la parte inferior de la placa de Petri todavía está conectado con el resto en el interior del huevo ya que esto da lugar a un vacío en el interior del huevo que contiene la yema de huevo con el embrión en la parte superior dentro de el huevo. El vacío se puede regular, ya sea por la presión del dedo, que controla la entrada de aire en el huevo o el huevo, levantando lo que aumenta la columna de la conexión es decir, la clara de huevo vacío.
5. Ejerciendo una suave presión con el meridiano que atraviesa la grieta y el ecuador del huevo con el pulgar y el dedo medio, es posible regular el vacío. El contenido del huevo puede ser transferida a la placa de Petri en buen estado, si el huevo con la yema de huevo se levanta suavemente y las dos mitades de la cáscara se separan cuidadosamente. El embrión y la yema de los barcos que se encuentran en la parte superior de la yema de un buen estado.
   Nota: Si la marca del lápiz no se mantiene en la parte superior, el embrión puede ser herido cuando agrietamiento de la cáscara. Si los huevos no estén agrietados o con la suficiente atención a los embriones tienen más de 72 horas (ver arriba), el saco vitelino se adhiere a la concha y se rompe con frecuencia. Lo mismo ocurre cuando la humedad de la incubadora es inferior al 60% o los huevos no se giran durante la incubación.
6. Ex ovo culturas se devuelven a la incubadora y se mantiene a 37,5 ° 38,2 ° C y una humedad del 60%. CO ₂ y O ₂ la oferta no es necesario si la incubadora no está cerrada herméticamente (rejilla de ventilación parcialmente abierta!) Y platos de Petri con separadores entre la tapa y el plato se utilizan.
   Nota: Movimiento de los embriones deben mantenerse a un mínimo durante los primeros días de incubación. Demasiada agitación en altas tasas de mortalidad. De incubación de 9 días en adelante, los embriones son menos sensibles a la agitación.
   Embriones muertos deben ser retirados inmediatamente para evitar infecciones.
   Si incubadoras de cultivo de células se utilizan, que están herméticamente cerrados, la oferta de O ₂ es obligatoria para los embriones que no se muera. La humedad es esencial para la CAM no se sequen y si la temperatura de incubación es inferior a 37 ° C, los embriones se desarrollan con demasiada lentitud.

Parte 3: Aplicación de sustancias para los ensayos de la angiogénesis

1. Autoclave papeles doblados filtro (50,5 mm de diámetro) se perforan por una perforadora y se utiliza como material de apoyo (soporte) para las sustancias líquidas aplicadas a la medicina complementaria y alternativa.
   Nota: Casi cada material de soporte (ver tabla abajo) causó la irritación de la CAM, especialmente cuando se aplica antes del día de incubación de 10, ya que cambió la arquitectura CAM barco en desarrollo. Esto también incluye sustancias potencialmente inerte como el papel de hidroxietilcelulosa, esponjas de teflón (PTFE-pledgets), esponjas de colágeno, lámina de colágeno, una gasa estéril (hisopos), se desliza alrededor de la cubierta, y los anillos de silicona, lo que causó todos los resultados positivos falsos. Papel de filtro parecía causar el menor irritación y se utilizó por lo tanto, en nuestros ensayos.
2. Cuando la CAM se ha desarrollado plenamente, hasta 6 muestras diferentes se pueden aplicar y sus efectos se pueden comparar en una sola CAM.
3. Para evitar que se sequen las dosis filtros adicionales (3 mg angiotropina nativo) o de amortiguación (5 l de PBS) se debe volver a aplicarse cada día.
4. Desde el día 3 después de la aplicación, los vasos sanguíneos orientarse hacia las sustancias angiogénicas en los filtros, mientras que el patrón de los vasos sanguíneos que rodean los controles no se ha modificado.
   Nota: La CAM no debe confundirse con la yema de huevo-saco. La CAM es una estructura dinámica de desarrollo, mientras que el saco vitelino es estática con variaciones poco durante el desarrollo. En el desarrollo de tres días de la CAM en desarrollo puede ser reconocido por primera vez en el extremo caudal del embrión como una pequeña vesícula. Entre los días tres y diez días de la vesícula inicial se expande, creando un plegado de dos capas de membrana overgrowing el saco vitelino a un ritmo creciente. El lugar de aplicación debe estar a medio camino entre el embrión y el pliegue de la CAM (frontera) de otra manera el embrión dificulta la observación microscópica de los efectos de la luz transmitida. Por otra parte, el filtro con la sustancia angiogénica se internaliza cuando el CAM sigue creciendo.

Parte 4: La inoculación de las células en la CAM

4.1.Preparation de las células

1. Las células confluentes se transfieren del frasco de cultivo a tubos Falcon por el uso de una pipeta de plástico estéril 25 ml con una pipeta de ayuda.
2. Para estimar el número de células, 15 l de la suspensión celular se transfirió a una cámara de Neubauer y las células se cuentan manualmente con un microscopio.
3. Tubos Falcon se centrifugan durante 3 minutos a 1000 rpm a temperatura ambiente y se descarta el sobrenadante.
4. Para el seguimiento de células vivas, las células se diluyen con PBS a la concentración deseada (en este caso: 2x10 ⁷ células / ml) y se tiñeron con, por ejemplo PKH26 (Sigma), un fluorescente de color rojo vivo la membrana celular kit de etiquetado, según el protocolo del fabricante.
   Las células son resuspendidas en medio de cultivo celular (preferentemente Dulbecco modificada de águila; DMEM) a la concentración deseada para la inyección (10 ⁷ células / ml) o la inoculación (3x10 ⁶ células / ml). Diferentes concentraciones de células se aplican las inyecciones contra la inoculación de acuerdo a las concentraciones ya publicados en la literatura ^15-17 y nuestra experiencia.

4.2 La inoculación de las células en la CAM

1. Anillos (~ 1 mm de espesor) se cortan de una punta de la pipeta de 1 ml o un catéter venoso periférico (CVP) del tubo por el uso de un bisturí y se aplica a la CAM de un ovo chica E6-E14 embrión ex cultivadas.
   Nota: Trate de no "vio" varias veces, pero para cortar la punta de la pipeta o catéter con un corte con un bisturí nuevo, muy fuerte para evitar los bordes afilados de los anillos resultantes. Revise los anillos bajo el microscopio en busca de bordes afilados como resultado de micro-fisuras.
2. Dependiendo del tamaño de los anillos de 20 l de 3x10 ⁶ células / ml con pipeta las células en total en un anillo o como volúmenes divididos en múltiples anillos.
   Nota: En algunos casos trauma de la CAM por raspado suave es un pre-requisito, por ejemplo, para facilitar la inoculación de células de ¹⁷ y pulmonar de los injertos (ver más abajo). Sin embargo, si la traumatización de la CAM no se pretende ni se contraindica, por ejemplo, para los estudios sobre el potencial invasor de las células tumorales, los anillos no deben ser utilizados para la inoculación, pero las células se debe aplicar directamente como la aplicación de anillos o anillos se pueden inducir lesión micro . Si los anillos se utilizan, estos se deben cortar lo más fina posible para minimizar el peso y evitar la sangría de la CAM.

Parte 5: inyección intravítrea de células

1. Una jeringa Hamilton microlitro se enjuaga varias veces con EtOH al 70% y finalmente con PBS estéril.
2. La jeringa micro se llena con la suspensión celular preparada manchados o sin teñir (ver apartado 4.1).
   Nota: El sitio de la inyección debe ser cuidadosamente seleccionado, de no lesionar los vasos sanguíneos de las estructuras adyacentes CAM o del embrión (brain!) por sobre la penetración de la aguja. La inyección se debe realizar bajo un binocular de disección.
3. Bajo el control de microscopio, Con cuidado, pero rápidamente penetran en la CAM y las capas del ojo con la aguja de la jeringa y continuamente se inyectan de 10 a 20 máximo de suspensión de células l (preferentemente diluido en PBS) en el humor vítreo de los ovo embrión de pollo ex cultivadas.
   Nota: Si la CAM no puede ser penetrado con la aguja, puede ser removido en un sitio con pocos vasos sanguíneos o no de él con cuidado separando con dos pinzas.
4. La aguja debe permanecer 02.01 segundos en el ojo para evitar la pérdida de la suspensión de células inyectadas por fugas.

Parte 6: Disección de esbozos de los miembros de pollo

1. Los huevos son retirados de la incubadora después de 3 a 4 días de incubación (E3/E4 = Hamburguesa Hamilton (HH) stage18-23)
2. Los huevos están rotos en el borde de una barra de agitación magnética triangular y se transfieren a una placa de Petri (detalles: véase la Parte 2) y el embrión se diseca la yema de los vasos conectados mediante la reducción de un círculo con unas tijeras de primavera.
3. El embrión se transfiere a una nueva placa de Petri llena de frío, PBS estéril por el uso de una cuchara pequeña de drenaje y lavado por agitación tipo.
4. El embrión se transfiere a una pequeña placa de Petri llena con PBS estéril y libre de las membranas que rodean, cuidadosamente desgarrando con unas pinzas finas.
5. Esbozos de los miembros se separan por pinzas de microcirugía lo más cerca del cuerpo como sea posible, captar y transferir a la CAM de un ovo host de 8 a 10 días de edad, ex pollo cultivadas (ver procedimiento de injerto).

Parte 7: Preparación de esbozos de los miembros del ratón

1. Apareamientos vez embarazadas se establecen y la mañana del día en que se detecta un tapón vaginal en el apareamiento las hembras se designa 0 días de gestación.
2. La mujer embarazada se sacrificaron por dislocación cervical cuando el desarrollo de los embriones llegó el día embrionario (E) 10 a 13 y fija en una tabla de cera.
3. La pared abdominal se humedece con EtOH al 70%, corte a lo largo de la línea media y los colgajos de piel se fijan lateralmente por alfileres.
4. Los dos cuernos del útero se extirpan del abdomen, individual y se transfiere a un recipiente con PBS frío.
5. Los embriones se separan, se transfirió a una placa de Petri y la pared del útero y las membranas embrionarias son retiradas por el uso de fórceps.
6. Esbozos de los miembros son cortados por el uso de tijeras de primavera o separado por unas pinzas finas tan cerca del cuerpo como sea posible, captar y transferir a la CAM de 8 a 10 días de edad in ovo de pollo cultivados ex anfitrión (ver procedimiento de injerto).

Parte 8: Colección de muestras de tumores

1. Biopsias de los tumores se recogen en 2 ml tubos Eppendorf llena con un medio de cultivo de células del tumor-específica (en este medio de Leibovitz) y se mantiene a temperatura ambiente.
2. Biopsias de los tumores se cortan en pedazos por 1-2 mm3 bisturí estéril.
   Nota: Si las muestras de tumor eran demasiado pequeños, es posible que no se adhieren a la CAM, si eran demasiado grandes, la CAM podría estar lesionado y el embrión podría morir.
3. Una pieza de la base de la muestra de biopsia se injerta en la CAM de 8 a 10 días de edad ovo pollo anfitrión cultivadas ex (ver procedimiento de injerto).
   Nota: Toma de material de la superficie de la biopsia aumenta el riesgo de contaminación con el músculo o tejido conectivo.

Parte 9: procedimiento de injerto

1. Para el injerto de yemas de las extremidades o las muestras de tumor, el completamente desarrollado CAM de 8 a 10 días de edad embriones de pollo cultivados ex ovo se utiliza.
2. Los injertos son muy bien situado en la medicina complementaria y alternativa cerca de una bifurcación Y de un vaso sanguíneo.
3. En el sitio de aplicación deseada, la CAM es selectiva traumatizados por fuera raspado suave (pinzas) de la parte superior peridermal de la capa epitelial de matrimonio, dejando la capa basal intacta.
   Nota: es esencial para evitar el sangrado o ruptura de los capilares visibles.
4. El injerto es transferida a la CAM con un mínimo de PBS adjunto. Dependiendo de la prótesis, puede ser colocado una o dos veces en un sitio de la CAM, donde no definitiva injerto se destina a eliminar exceso de PBS y, finalmente, injertados en el sitio de CAM preparado traumatizados.
5. El injerto se sujeta por pinzas finas y capas en la CAM. Dependiendo de la sensibilidad del injerto, la presión de la luz podría ser aplicado (no apto para esbozos de los miembros) para maniobrar el injerto en una hendidura que resulta de la CAM (apropiado para muestras de tumor).
   Nota: Como el sistema inmunológico de pollo se desarrolla en el día embrionario (E) 18, ex ovo culturas xenoinjertos no debe prolongarse más allá del E17 como los embriones de pollo de acogida con frecuencia mueren.
   Es importante tener CAM dispone de sede, respectivamente ovo embriones de pollo cultivados ex, para coincidir con una fuente de tejido de un donante de su elección.

Parte 10: Re-injerto

1. El embrión de pollo de acogida es muerto por decapitación.
2. La CAM conel injerto unido se elimina mediante un corte circular con tijeras con punta y se transfieren a una placa de Petri llena de PBS.
3. CAM excesiva se corta con tijeras el injerto de primavera a excepción del sitio de unión anterior.
4. En el caso de las muestras de tumor más grande, el injerto se corta en mitades o en varios pedazos más pequeños y re-injertados con el filo hacia el CAM de nuevo el segundo host.

Parte 11: Resultados de Representante

Figura 1. Caparazón de pollo cultura
Embriones de pollo de las diferentes etapas de desarrollo cultivadas ex ovo en placas de Petri.

Figura 2. Ex ensayo de angiogénesis in ovo CAM
Fecundados los huevos de gallina se incubaron horizontalmente a 37 ° C y una humedad de 60 - 62% y agrietada en placas de Petri en el día embrionario 4 (E4). Se continuó la incubación en las mismas condiciones. E10, papeles filtro estéril (5,5 mm de diámetro) en capas en la parte superior de la CAM y empapado, ya sea con 5 l de PBS o 3 mg nativos angiotropin6. Capilares mostró la alineación obvia hacia el angiotropina filtro de papel empapado en E14.

Figura 3. Ex ovo el injerto de yemas de las extremidades
Esbozos de los miembros de la chica (E3/E4) y el ratón (E13) se injerta en la CAM de las culturas de pollo sin caparazón. Los vasos sanguíneos de la CAM entró en la yemas de las extremidades después de dos días. El desarrollo de los esbozos de los miembros continuaron en estas culturas ex ovo llegando a una etapa en la falange dos de pollo y la visualización de la reducción de las webs interdigital en esbozos de los miembros murino.

Figura 4. Inoculación ex ovo de la muestra de tumor
Una muestra de la biopsia de carcinoma de vejiga se inoculó en la CAM de un ovo de pollo de 10 días de edad, ex embriones cultivados. Después de dos días en la cultura, el espécimen estaba conectado a la vasculatura CAM y después de 7 días, múltiples vasos sanguíneos que entran el injerto se observaron.

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Discusión

Innovadora o simplemente un protocolo de pollo cultura?

Con el ex protocolos de cultivo de concha menos ^1.4 la tasa de supervivencia total de los embriones de pollo fueron bajos, por ejemplo, ca. 30% ^1. El protocolo ex refinada cultura ovo descrito en este artículo de vídeo, por el contrario, permite que las tasas de supervivencia superiores al 50%. En comparación con los clásicos en las culturas ovo cultura ex ovo de emb...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fertilized Eggs	Animal	Sorries-Trockels Vermehrungszucht GmbH
Mice	Animal	Charles River Laboratories
Incubator Type 3000 with rotating egg tray	Tools	Siemens AG	9503	Maintain at 37°C with relative humidity set above 60%
Egg incubator BSS 160	Tools	Grumbach, Germany	8101	Maintain at 37-387deg;C with relative humidity set above 60%
PBS	Reagent	Sigma-Aldrich		PBS should be cold (> 4°C) and sterile
Dulbecco’s modified eagle’s medium	Reagent	Sigma-Aldrich	D 6429	DMEM culture medium
Leibovitz’s L-15 Medium	Reagent	Invitrogen	31415-029	here: collection medium for tumor samples
Tumor cell -specific medium	Reagent	Sigma-Aldrich		each research group should use the medium they culture their tumors cells in or common culture media, e.g. Leibovitz’s Medium or Dulbecco’s modified eagle’s medium supplemented with 15% fetal bovine serum (FBS), 4mM L-glutamine and 50 μM insulin
70% EtOH	Reagent	Sigma-Aldrich
Magnetic stir bar, triangled 80 mm	Tool	VWR international	442-0391	A triangled magnetic stir bar serves well to crack the eggs shell.
Forceps DUMONT #5	Tool	Fine Science Tools	11252-30	bevelled very fine shanks (0.05 mm x 0.02 mm tip)
Forceps DUMONT #7	Tool	Fine Science Tools	11271-30	curved shanks (0.07 mm x 0.10 mm tip)
Spring scissors, straight, 8cm	Tool	Fine Science Tools	15000-00	fine, small straight blades
Fine Iris scissors, straight	Tool	Fine Science Tools	14094-11	Use to cut our the CAM
Standard scissors, straight, sharp/blunt	Tool	Fine Science Tools	14007-14	Use for decapitation or cervical dislocation
microliter syringe 1702 TLLX, 25 μl	Tool	Hamilton Co	80222	Use for injection into the vitreous
Hamilton 33-G needle (15 mm)	Tool	Fine Science Tools	18073-15	Use for injection into the vitreous
Sterile scalpels	Tool			Use for dissecting tumor samples
Small drain spoon	Tool	Geuder	15758	Use to transfer of small chick embryos
Wax board with fixing pins	Tool	Home made		Use to fix of animals for dissection
Petri dishes 60 x 15 mm	Tool	Greiner Bio-One	628102
Petri dishes 92 x 16 mm	Tool	Sarstedt Ltd	82.1472
Sterile Petri dish 100 x 20 mm	Tool	Greiner Bio-One	664160	extra deep, with spacers for ventilation
Beaker	Tool			300-600 ml
FALCON tubes	Tool	Falcon BD		15 ml and 50 ml
Eppendorf tubes	Tool	Eppendorf		1.5 ml and 2 ml
1ml pipette tips	Tool			Use to cut plastic rings for application of substances / cells
Peripheral venous catheter (PVL)	Tool	Viggo®		Use to cut silicon rings from the tube for application of substances / cells
Pipettes and tips	Tool	Eppendorf
Autoclaved folded Filters 595 1/2, 110 mm diameter	Tool	Schleicher Schuell	311643	Carrier, which caused least irritation of the CAM; used in the paper
PTFE-Pledget, non resorbing, 6,3 x 152.4 x 1.6 mm	Tool	santec-medical	REF 277, LOT 832/511-1	Carrier; caused false positive results
Hxdroxyethylcellulose Tylose H 100000	Reagent			Carrier mixed with Kollidon 17 PF; caused false positive results
Kollidon 17 PF	Reagent	BASF	S30200	mixed with Hydroxyethylcellulose; caused false positive results
Collagen Biomatrix TissuDura	Tool	Baxter Internationl Inc.	REF B2246000999999	Carrier; caused false positive results
Round glass cover slips, 11 mm	Tool	Assistent Germany	1001/0011	Carrier; causes false positive results
Bovine Collagen Sponge	Tool	Wyeth Animal Health		Carrier; caused false positive results
Resodont Absorbable Collagen Membrane	Tool	Resorba Woundcare Germany	LOT 280303	Carrier; caused false positive results
Non-Woven Swabs	Tool	Fink Walter GmbH	REF 328132	Carrier; caused false positive results