Descifrar Caminos axonal de los grupos definidos genéticamente las neuronas en el tubo neural del polluelo Utilizando In ovo La electroporación

Resumen

Este video muestra la forma de visualizar las vías axonales de grupos genéticamente definidos de neuronas en la médula espinal de embriones de pollo que utilizan In ovo Electroporación de los genes reportero bajo el control de determinados elementos potenciadores.

Resumen

El empleo de elementos potenciadores para dirigir la expresión de genes reporteros en las neuronas es un paradigma ampliamente utilizado para el seguimiento de la proyección axonal. Para el seguimiento de la proyección axonal de interneuronas espinales en los vertebrados, la línea germinal objetivo genes reportero de etiquetado sobre simetría bilateral. Por lo tanto, es difícil distinguir entre la ipsi y contra-lateral se proyecta axones. Electroporación unilateral en el tubo neural de pollo proporciona un medio útil para limitar la expresión de un gen a un lado del sistema nervioso central, y de seguir la proyección axonal en ambos lados

Protocolo

I. La electroporación

Manejo de huevo

1. Coloque los huevos en una incubadora humidificada conjunto a 37-38 ° C, preferible una incubadora con una bandeja oscilante.
2. Embrión se electroporated después de 66 horas de la incubación, cuando han llegado a Hamburgo y Hamilton (HH) la etapa 18-20. En esta etapa se encuentra la cabeza en ángulo recto con el tronco (condición llamada flexión cervical) y un vasto conjunto de los vasos sanguíneos extra-embrionarias, como la anterior, las venas posterior, vitelina derecha y la izquierda debe ser visto. Este es un momento óptimo para el potenciador que dependen de expresión específica ^1,3,4. Es importante controlar la temperatura y la humedad de la incubadora, con el fin de obtener embriones viables y sincronizada.
3. Después de 66 horas de incubación, se elimina los huevos de la incubadora. Coloque los huevos en posición horizontal. Esperar 5-10 minutos. El embrión se encuentra en el polo superior del huevo.

Preparativos

1. Prepare la solución de Hank con penicilina / estreptomicina (P / S) (1:100).
2. Tire de capilares de vidrio (0,5 mm de diámetro) para microcapilares.
3. Coloque los electrodos (tungsteno) en micromanipulador y conectar los electrodos al generador de pulsos (ECM 830).
4. Ajuste el generador de impulsos con los siguientes parámetros: voltaje de 30V, el número de pulsos - 3, la longitud del pulso de 50 ms.
5. Prepare una pipeta de boca, una aguja de la jeringa y una cinta.
6. Preparar una mezcla deseada de ADN (2-5μg/μl) y añadir un colorante Fast Green.

Ventanas y electroporación

1. Usando una jeringa, retire 6.5 ml de albúmina de cada huevo.
2. Con una tijera pequeña y abierta una ventana oval en la parte superior del huevo.
3. Húmedo del embrión con 0,5-1ml de Hank + P / S solución.
4. Use una pipeta de boca, para cargar el vaso con la mezcla de ADN microcapilar.
5. Lugar al embrión con la cola hacia usted. En esta etapa, la médula espinal del embrión se ve claramente. Por lo tanto, las técnicas de contraste no son necesarios. La médula espinal es sellado en ambos extremos, la cabeza y la cola, pero si su microcapilar es lo suficientemente delgada, usted será capaz de perforar un pequeño agujero y penetrar en el tubo neural en un ángulo bajo. A microcapilar de diámetro adecuado se debe cargar con facilidad con el ADN, penetrar en el tubo sin dañarlo y liberar el ADN con una exhalación normal.
6. Inyectar el ADN usando una pipeta de boca. El tinte verde que se extendió desde la punta de la cola hasta las vesículas del cerebro en desarrollo.
7. Coloque los electrodos en paralelo con el tubo neural, lo más cerca posible, sin tocar el tubo de sí mismo y el pulso. En el momento del impulso, los electrodos deben ser cubiertos con un líquido para permitir que la conductividad eléctrica. Por lo general, la cantidad de Hank añadido a la mendicidad es suficiente. Si no añadir una gota de sólo Hank antes del pulso.
8. Retire con cuidado los electrodos y el sello de la ventana con una cinta. Es importante para sellar el huevo por completo para evitar la desecación del embrión durante el período de incubación siguientes.
9. Vuelva a colocar el huevo en la incubadora.

II. La médula espinal a libro abierto preparación

Desprendimiento de la médula espinal del embrión

1. Extraer el embrión eletroporated, en E6, desde el huevo y colocarlo en una placa de Petri con silicona que contiene PBS.
2. Cortar las membranas y estirar el embrión en su parte ventral con alfileres para sostenerlo.
3. El uso de un fuerte de tungsteno microcapilar hacer una incisión longitudinal a lo largo de la placa del techo, de la parte posterior del cerebro hasta la cola.
4. Crea un adicional de dos incisiones longitudinales a ambos lados de la médula espinal, al separar los ganglios de la raíz dorsal (GRD) de distancia de la médula espinal.
5. Separe la placa de piso de los tejidos a partir de la cola a la parte posterior del cerebro, dejando intacta la médula espinal.
6. Corte de la médula espinal en un corte transversal en la parte posterior del cerebro usando tijeras finas y separarla del cuerpo.

Fijación

1. Corre la médula espinal aislada en una nueva placa de Petri con silicona que contiene PBS, el uso de clavos para sujetarlo, desde el cerebro posterior a la cola para producir una preparación planos de montaje.
2. Vierta la PBS de la antena y reemplazarla con paraformaldehído al 4% en tampón fosfato salino.
3. Incube a temperatura ambiente durante 1 hora.

Inmunohistoquímica

1. La transferencia de la médula espinal fija en un vial con anticuerpo primario en PBS.
2. Incubar con agitación suave durante la noche a 4 ° C.
3. Lavar el anticuerpo X5 veces con PBS, cada lavado durante 1 hora con agitación suave.
4. Añadir el anticuerpo secundario y se incuba con agitación suave durante la noche a 4 ° C.
5. Lavar el anticuerpo X5 veces con PBS, cadalavar durante 1 hora con agitación suave.

Libro abierto para el montaje de imágenes

1. Frotis de grasa o de silicona en forma de rectángulo en una diapositiva y por goteo en PBS.
2. Lugar de la médula espinal se extendía en el centro del rectángulo con pinzas y extraer el líquido a su alrededor con una pipeta Pasteur.
3. Colocar 1-2 gotas de medio de montaje en la médula espinal y los cubren con cubreobjetos. Calabaza para evitar burbujas de aire.
4. Mantenga las diapositivas en la oscuridad de 4 ° C.
5. Inspeccione la médula espinal mediante microscopía confocal.

Discusión

Electroporación de ADN plásmido en el embrión de pollo se desarrolla como una técnica de gran alcance para la expresión ectópica en vivo. La combinación de potenciadores específicos, y la electroporación de pollo proporciona una herramienta rápida y eficaz para descifrar las vías axonal de un grupo definido genéticamente las neuronas ^1,3,5. Utilizando el cre / loxP y los sistemas de amplificación GAL4/UAS puede aumentar los niveles y duración de la expresión. El panorama resultante es el de una...