Microscopía Confocal de córnea: A Novel una técnica no invasiva para cuantificar pequeñas de fibra de Patología en neuropatías periféricas

Resumen

La microscopía confocal de córnea es una técnica clínica no invasiva que puede ser utilizado para cuantificar los daños fibras C para diagnosticar y estratificar a los pacientes con mayor gravedad neuropático.

Resumen

La cuantificación precisa de la neuropatía periférica es importante para definir a los pacientes de riesgo, anticipar el deterioro, y evaluar nuevas terapias. Los métodos convencionales de evaluar los déficit neurológicos y electrofisiología y pruebas sensoriales cuantitativas cuantifica las alteraciones funcionales para detectar la neuropatía. Sin embargo, los primeros daños parece ser la de las pequeñas fibras y, sin embargo estas pruebas principalmente evaluar la disfunción de fibras grandes y tienen una capacidad limitada para demostrar la regeneración y reparación. Las únicas técnicas que permiten un examen directo del daño de fibras nerviosas amielínicas y reparación biopsia del nervio sural con el microscopio electrónico y la biopsia de la piel-punch. Sin embargo, ambos son procedimientos invasivos y requieren largos procedimientos de laboratorio y una considerable experiencia. La microscopía confocal de córnea es una técnica clínica no invasiva que ofrece imágenes en vivo de las fibras nerviosas corneales. Hemos demostrado el daño nervioso temprano, que precede a la pérdida de fibras nerviosas intraepidérmica en biopsias de piel junto con la estratificación de la gravedad neuropático y el trasplante de páncreas después de la reparación de los pacientes diabéticos. También hemos demostrado el daño nervioso en la neuropatía idiopática pequeña fibra y la enfermedad de Fabry.

Protocolo

Introducción:

La cuantificación precisa de la neuropatía periférica es importante para definir a los pacientes de riesgo, anticipar el deterioro, y evaluar nuevas terapias. Los métodos convencionales de evaluar los déficit neurológicos y electrofisiología y pruebas sensoriales cuantitativas cuantifica las alteraciones funcionales para detectar la neuropatía. Sin embargo, los primeros daños parece ser la de las pequeñas fibras y, sin embargo estas pruebas principalmente evaluar la disfunción de fibras grandes y tienen una capacidad limitada para demostrar la regeneración y reparación. Las únicas técnicas que permiten un examen directo del daño de fibras nerviosas amielínicas y reparación biopsia del nervio sural con el microscopio electrónico y la biopsia de la piel-punch. Sin embargo, ambos son procedimientos invasivos y requieren largos procedimientos de laboratorio y una considerable experiencia. La microscopía confocal de córnea es una técnica clínica no invasiva que ofrece imágenes en vivo de las fibras nerviosas corneales.

HRT III-Módulo Rostock corneal (RCM)

Manual de Operación

1. Preparación de la cámara

El paso inicial en el examen de uso de la TRH es la preparación de la punta del lente del objetivo.

1. Por primera vez en el tubo de objetivo de la cámara de barrido láser, establezca la refracción de 12 dioptrías y luego ajustar la cámara a la posición más baja.
2. Aplique una gran burbuja homogéneo, libre, la caída de tamaño de un guisante, de Viscotears en la punta de la lente.
3. Eliminar un TomoCap de su envase estéril y montarlo sobre la punta de la lente de modo que el gel forma un menisco entre el objetivo y la tapa. Empújelo tanto como sea posible sobre el titular. Tenga cuidado de no tocar la superficie frontal de TomoCap durante el montaje.
   
   Figura 1. Preparación de la punta del lente objetivo (arriba) la aplicación de viscotear gel (abajo) La aplicación de la TomoCap.
4. Mueva la cámara de barrido láser en la medida de lo posible hacia atrás en la montura de la cámara.
5. La superficie interior y exterior de la TomoCap ambos aparecen como un reflejo de láser brillante. La rueda de ajuste plano focal debe ser ajustada hasta que un reflejo luminoso que se observa, lo que indica que el objetivo está enfocado en la parte frontal de la tapa. El valor de la profundidad se muestra en la pantalla la posición de enfoque ahora debe estar entre -150 my 150 m.
6. Restablecer la configuración de profundidad a cero.
   
   Figura 2. Ajuste del plano focal.

2. Preparación del paciente

Los ojos del sujeto están anestesiados utilizando una caída de 0,4% de hidrocloruro de benoxinato y Viscotears se utiliza en la parte frontal del ojo para la lubricación.
El sujeto está sentado cómodamente, con la barbilla en la mentonera y pidió a la prensa su frente con firmeza contra la barra de la frente.

Figura 3. Preparación del paciente

3. La alineación de la cámara

Esto hace que el examen más fácil si usted instruir al paciente para fijar en la luz de fijación externa con el ojo ni está siendo examinada. El tamaño compacto de la cabeza del microscopio significa que el ojo contralateral del sujeto no se oculta, lo que permite el uso de objetivos de distancia.

Figura 4. Lente objetivo del módulo de la córnea.

1. Posición de la cámara CCD de tal manera que su eje óptico es perpendicular al eje óptico de la cámara de barrido láser. La cámara debe estar en el lado derecho del paciente cuando la imagen del ojo derecho y viceversa.
   En esta posición, debería ver la superficie frontal de la TomoCap en el centro de la imagen de la cámara CCD en vivo.
2. Mueva la cámara de barrido láser hacia el paciente hasta que la córnea del paciente está a una distancia de unos 5 a 10 mm de la TomoCap, luego mueva la cámara de barrido láser hacia arriba / abajo y derecha / izquierda con los mandos de negro en la montura de la cámara hasta que el TomoCap se coloca en el centro de la córnea del paciente. En esta etapa se puede comprobar que la luz del láser rojo está en el centro de la córnea y el ajuste fino, observar el reflejo del rayo láser de la córnea, que es visible en la imagen de la cámara CCD. Esta reflexión debe ocurrir exactamente en el polo anterior de la córnea.
   
   Figura 5. Alineación del haz de láser en el polo anterior de la córnea para capturar las imágenes centrales de córnea.
3. Pedir al paciente que abra los ojos de su / su lo más amplia posible. Mueva la cámara de barrido láser lentamente hacia adelante hacia el paciente hasta que los contactos TomoCap la córnea del paciente. Si es necesariopara corregir la posición de la cámara de barrido láser, luego mueva la cámara lejos de la paciente en primer lugar, hacer la corrección, entonces avanzar de nuevo en contacto con la córnea.
   
   Figura 6. Demostración del puente entre la delgada capa de gel TomoCap y la córnea.
4. Un contacto mínimo entre la cámara y la córnea es suficiente. En un ajuste óptimo, un puente entre la delgada capa de gel TomoCap y la córnea se ve en la imagen de la cámara CCD en vivo.

Si pulsa el TomoCap o mover la córnea demasiado cerca de la cámara, entonces usted verá la presión sobre la córnea con un aspecto aplanado en la córnea a través de la imagen de la cámara CCD en vivo. También en las imágenes obtenidas de una línea que muestra la presión aparecerá, por tanto, no ejerza demasiada presión en la córnea. Una vez que se ha establecido contacto, no se mueva la posición de la headrestto evitar el deslizamiento de la córnea en el TomoCap.

Figura 7 (izquierda) Aparición de una straie debido a la aplicación de un exceso de presión en la córnea por el TomoCap;. (Derecha) Una imagen con apariencia normal, sin exceso de presión.

4. Examinar al paciente

Después de que el campo de visión ha sido seleccionado, el HRT III cámara láser se enciende y la ventana de adquisición de la imagen aparece en la pantalla. Usar la imagen CCD a la posición de la TomoCap y la luz láser sobre la córnea del paciente. Examen utilizando el modo seleccionado entonces se puede comenzar.

Figura 8. Modalidad de visualización en el monitor durante la adquisición de las imágenes.

El modo de adquisición

En el modo de sección, una única imagen que se adquiere y almacena cada vez que se pulsa el interruptor de pie. Utilizamos este modo para capturar imágenes de toda la capa corneal, incluyendo la capa de Bowman en el centro de la córnea. Y luego después de la captura de un número suficiente de imágenes, se puede tratar a los otros modos como la secuencia y el volumen.

Figura 9. Display con la elección de los diferentes modos de adquisición de imágenes.

Con el análisis de secuencias, se puede adquirir una secuencia de hasta 100 imágenes con una velocidad de fotogramas ajustable. Usted puede elegir una velocidad de 30 cuadros y un cuadro por segundo (fps) y sobre la base de esta modalidad que le permite adquirir una película con una duración de 3 a 100 segundos.

En el modo de escaneo de volumen, la cámara adquiere una serie de 40 imágenes consecutivas en los planos focales. La profundidad total de 85 micras se pueden escanear con el "campo de visión 400 micras" lente de campo y la distancia focal entre dos imágenes consecutivas será de aproximadamente 2,1 micras.

Después de las exploraciones de unos pocos el plano de enfoque de la lente se puede modificar para medir la profundidad de una capa de células corneales en relación con la superficie de la córnea por lo que el capa de células epiteliales en el enfoque y luego haciendo clic en el botón de reinicio para establecer el valor de la profundidad a 0.

A los efectos del presente estudio, se obtiene imágenes de la córnea central a diferentes profundidades. Por lo tanto, no mover la cámara de barrido láser alrededor de la córnea en horizontal o vertical, apenas nos movemos hacia atrás y hacia adelante y captura de imágenes de todas las profundidades de la capa de Bowman en el punto de la córnea mismo. La distancia entre cada imagen es de aproximadamente 1 micra, por lo tanto, si la profundidad de Bowman es de 10 micras, que contará con 10 imágenes. Sin embargo, para el análisis final, podemos seleccionar las imágenes con una distancia de aproximadamente 3.2 m entre ellos.

Después de completar el examen apague la cámara, haga clic en el botón de encendido de la cámara en la ventana de adquisición. Hacer que el paciente sea consciente de que él o ella no debe frotar sus ojos hasta que la anestesia local ha desaparecido. Como medida de precaución, es posible que desee llevar a cabo un examen con lámpara de hendidura de la córnea del paciente después del examen.

Retire la TomoCap de la cámara y disponer y luego limpiar la lente de un microscopio con un hisopo de algodón humedecido con agua destilada.

5. El análisis de un examen

a. Selección de los marcos

Para revisar y analizar los exámenes actuales, la historia clínica correspondiente (s) se debe seleccionar en la ventana de base de datos. La ventana de visualización de imágenes proporciona una visión general de los exámenes de córnea existentes para el paciente seleccionado. Los exámenes realizados en días diferentes se almacenan en las fichas visita independiente. Los tres tipos diferentes de análisis están representados por tres diferentes iconos de la ficha HRT III visita córnea de la ventana de visualización de imágenes de la Heidelberg ojos Explorer.

Para estudiar la imagen de la córnea, haga doble clic en el icono de imagen adecuada y el "Show" la función se abre la siguiente ventana:

Figura 10. Visualización de todas las imágenes capturadas después de un examen.

Figura 11. Visualización de la imagen seleccionada antes de la exportación con vista de la cámara CCD del ojo para mostrar la alineación correcta.

Para exportar las imágenes adecuadas para su posterior análisis, haga clic en "Exportar" en la barra de herramientas y luego seleccione la carpeta que desea guardar las imágenes.

Se obtiene y la captura de imágenes de todas las capas de la córnea de cada paciente, pero como el foco principal de esta investigación se encuentra en la membrana de Bowman y los nervios de la córnea, sólo las imágenes de esta capa se analizarán. Seleccionamos a 06.05 fotogramas de la capa de Bowman para cada sujeto a diferentes profundidades de la córnea.

Figura 12. Visualización de todas las capas de la córnea de un sujeto sano.

En promedio, 6.5 fotogramas de la capa de Bowman en el centro de la córnea a diferentes profundidades son seleccionados al azar para las mediciones y análisis cuantitativos.

b. El análisis de imágenes

Para el análisis de las imágenes capturadas a partir de la membrana de Bowman de la córnea central con HRT III, que usamos un software especializado que se ha desarrollado dentro de nuestro grupo denominado "Herramientas de análisis de imagen CCM v 0.6".

Cuatro parámetros principales de nervios de la córnea se miden con este software:

• Densidad de las fibras nerviosas (DFN), que se define como el número de los nervios principales / marco.
• Rama del nervio densidad (NBD) el número de ramas principales / marco.
• La longitud de las fibras nerviosas (NFL), que es la longitud total de todos los nervios / marco.
• Tortuosidad de fibra nerviosa (NFT) de los nervios principales / marco.

Para abrir la imagen CCM, ir al archivo> abrir.

• Una vez que se carga la imagen, su tamaño y el tipo se muestra en el cuadro de Información de la imagen en la parte superior izquierda del lado del panel de control.
• La escala predeterminada se muestra en la línea de edición de la Información de la imagen. Si la escala es diferente, modifique el número en la línea de edición.
• Para comenzar a analizar la imagen, seleccionar el parámetro que desea medir el cuadro de métrica en la parte superior del lado derecho del panel de control.
• En el cuadro de resultado en la parte inferior de la página el número de Terranova, NBD se presenta en el número real, de la NFL en mm y la tortuosidad de un coeficiente de tortuosidad (TC).
• Sin embargo, después de exportar los resultados a una hoja de Excel, los resultados serán presentados en no / mm ² para NFD y NBD y mm / mm ² para la NFL.
• Para este propósito después de terminar las mediciones, haga clic en Agregar mediciones, y luego ir a Archivo> Guardar como y abra los resultados guardan con Excel.

Figura 13. Visualización de la imagen del nervio corneal con el rastreo en la herramienta de análisis de uso de "Imagen CCM herramienta de análisis".

6. Los resultados representativos:

Hemos demostrado un progresivo aumento en la degeneración del nervio corneal con la mayor gravedad de la neuropatía diabética y ^un daño a los nervios a principios de la diabetes, que precede a la pérdida de fibras nerviosas intraepidérmica en biopsias de piel ² junto con la estratificación de la gravedad neuropático y la reparación de Trasplante de páncreas después de ³ en pacientes diabéticos. También hemos demostrado el daño nervioso en la neuropatía idiopática pequeña fibra ⁴ y ⁵ la enfermedad de Fabry.

Figura 14. Córnea imágenes de microscopía confocal con la TRH III de la capa de la córnea de Bowman (a) sujetos de control en comparación con (b) los pacientes con neuropatía y daño nervioso severo.

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Discusión

Microscopía confocal la córnea (CCM) es una técnica no invasiva clínico que puede ser utilizado para detectar daños en los nervios principios y cuantificar pequeñas de fibra de patología en las neuropatías periféricas, como la diabetes, la enfermedad de Fabry y la idiopática neuropatías de fibras pequeñas (ISFN). El impacto inmediato clínica de esta técnica representa un enorme salto adelante en términos de nuestra capacidad para diagnosticar, para seguir el progreso y evaluar la respuesta terapéutica en...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
HRT III CCM Machine - The Rostock Cornea Module			Heidelberg Engineering
CCM image analysis software v0.6			University of Manchester