La presurización impulsivo de las células neuronales para el Estudio de lesión cerebral traumática

Resumen

Un nuevo experimento impulsivo presurización celular se ha desarrollado utilizando un dispositivo de bar Kolsky para investigar los mecanismos moleculares / celulares de la explosión inducida por la lesión cerebral traumática.

Resumen

Un nuevo experimento impulsivo presurización celular se ha desarrollado utilizando un dispositivo de bar Kolsky para investigar explosión inducida por lesiones cerebrales traumáticas (TBI). Se demuestra en este artículo cómo explosión de vídeo TBI relevantes para la presurización impulsivo se aplica a las células neuronales in vitro. Esto se logra mediante el uso de un buen control de presión de pulso creado por un equipo especializado Kolsky bar, con la historia completa de presión dentro de la cámara de presurización celular registrado. Presurizado células neuronales son inspeccionados inmediatamente después de la presurización, o se incubaron para examinar los efectos a largo plazo de la presurización de impulsivo en neurite / axonal, la expresión génica neuronal, apoptosis, etc Hemos observado que la presurización impulsivo en alrededor de 2 MPa induce la pérdida de relación distinta de neuritas a las células sin presión. Nuestra técnica ofrece un nuevo método para investigar los mecanismos moleculares / celulares de la explosión TBI, a través de la presurización impulsivo de las células del cerebro en una magnitud de presión bien controlada y la duración.

Protocolo

1. Cultivo de células neuronales

1. Las células del cerebro, incluyendo las células neuronales, los astrocitos, y sus compañeros de la cultura-puede ser utilizado como un modelo de celular. Como una demostración de viabilidad, la presurización impulsivo de la línea celular las células neuronales se presenta.
2. SH-SY5Y células de neuroblastoma humano (ATCC CRL-2266) se cultivaron en cubreobjetos de vidrio 18 mm de diámetro. Las células se sembraron a una densidad de 3 × 10 ³ células / cm ^{2 a través de} los medios de cultivo compuesto por DMEM suplementado con suero fetal bovino al 10% y el 1% de penicilina-estreptomicina. Diapositivas de células cultivadas de vidrio se mantienen en un 5% de CO ₂ humidificado incubadora a 37 ° C.
3. Para obtener la diferenciación de las células neuronales de la SH-SY5Y células, las células se tratan con los medios de comunicación más suplementado con 10 mM de ácido retinoico (RA) durante 7 días con los medios de comunicación cambian cada dos días. El día 7, las células están listos para ser presurizada.

2. Equipos de presurización: Kolsky Bar

1. La barra de Kolsky, desarrollado por Kolsky ¹ en 1949, se ha utilizado para medir las propiedades mecánicas de un material a una velocidad de carga muy alta. El aparato consiste en dos barras con una muestra de puesta en contacto entre las barras. Una onda de tensión, creado en la barra incidente, se propaga a la muestra, donde la ola se divide en una onda reflejada y transmitida. El estrés en la muestra es proporcional a la onda transmitida. En este estudio, utilizamos una cámara de presurización de células que se coloca entre las dos barras de la Kolsky set-up.
2. Las dos barras de aleación de aluminio (de largo cada uno de 6 m) están suspendidos por cojinetes de bronce alineados, y uno en la cámara de presurización de células in vitro se encuentra entre las barras. La barra de arriba es la barra incidente con una masa de 130 libras sujeta en un extremo. Una abrazadera de la fricción se coloca en una posición que le dará la duración del pulso deseado. Al participar de la abrazadera y el endurecimiento de un gato tijera entre la masa y un soporte de carga, la sección de pinza de masa de la barra incidente es pre-comprimido al nivel deseado. Obligar a un tornillo con muescas que bloquea la pinza a una ruptura repentina con un sistema hidráulico libera la compresión pre-almacenar rápidamente y por lo tanto genera un pulso de presión. Esta se propaga a través de la barra incidente, impulsa el pistón cámara de prueba, y presuriza el líquido y células dentro de la cámara de forma impulsiva. La presurización de la cámara a su vez inicia un pulso de presión que se propaga en el bar de abajo de transmisión. Las tensiones asociadas con los pulsos de presión en las barras se miden con indicadores compuestos de alta resistencia a la deformación emocionados de 45 voltios. Las señales de calibre se registran con un osciloscopio digital con una frecuencia de 1 MHz como una historia de carga.
3. En la cámara de presurización de células in vitro se compone de un cilindro-pistón. El cilindro cuenta con 2,6 cm de diámetro interior y 3,8 cm de diámetro exterior, y tiene un pequeño agujero roscado en la base de la cavidad. El orificio sirve como un aire y la salida el exceso de líquido durante la instalación de células de la muestra. El pistón es de 7,5 cm de largo y está hecha de la materia misma barra. El pistón se envuelve con dos o tres capas de (teflón) cinta de plomero que sirven como sello de baja fricción. La tapa es de 32 mm de largo y tiene dos pequeños tornillos de acero inoxidable que aseguran el cubreobjetos de vidrio (en el que las células son cultivadas) durante la carga.

3. La presurización impulsivo de las células neuronales

1. Todas las partes de la cámara de presurización se esterilizan utilizando el autoclave y se mantienen bajo la luz ultravioleta. El montaje de la cámara se lleva a cabo dentro de la campana de cultivo celular. El tornillo de purga en la cámara es ligeramente involucrados en la toma de aire en la base de la cavidad. Pre-caliente (37 ° C) medio fresco de crecimiento es una pipeta en la cámara sin hacer burbujas. Entonces, un portaobjetos de vidrio cultivo celular se recoge, y se coloca en la tapa del pistón (las células que enfrentan fuera). La celebración de pequeños tornillos se aprietan hacia abajo en la diapositiva para mantenerlo en su lugar. El pistón con una lámina de vidrio cultivo celular se introduce un poco en la cavidad de la cámara y el montaje se inclina con el respiradero está en el punto más alto. El tornillo de purga se elimina y el émbolo se empuja en la primera cavidad forzar las burbujas de aire, el exceso de líquido. Una referencia de marca o de una plantilla se utiliza como una guía para asegurar la misma cultura volumen de los medios para cada prueba. La dimensión axial de los medios de comunicación en la cámara es de unos 6 mm. Desinfectar el tornillo de purga y reemplazarlo para que el agua cámara hermética. La cámara no debería filtrarse bajo esta carga estática, si lo hace, la envoltura de teflón debe ser sustituida o reforzada.
2. En este punto, el sistema de barras Kolsky se restablece. La gran masa se mueve hacia atrás a la posición original y un perno de bloqueo nueva reemplaza a la usada (rota) una. Participar el perno de cierre nuevo con el sistema hidráulico de alrededor de 200 psi. Use el gato tijera para comprimir la sección de pre-carga de la barra incidente hasta un poco de presión más alta que el valor deseado, y luego otra vez que fuera a participar de la fricción total deltornillo de gato. La adquisición de datos está ahora armado.
3. La cámara de presurización celular ensamblado se instala en el sistema. Se coloca en un bloque V con el apoyo de pequeño gato tijera de laboratorio y en línea con las dos barras. Grasa cada interfaz con una capa de grasa de la luz y frote la superficie de embestir juntos para eliminar los vacíos de aire en el medio.
4. La prueba está listo para proceder. El tornillo de bloqueo del cabezal se ve obligado a romper rápidamente el bombeo por el conductor pinza hidráulica. La pinza se separarán y la adquisición de datos debe mostrar los resultados. La historia de presurización celular se determina a partir de las mediciones del indicador de barra de transmisión. Si la barra de transmisión utilizado es el tiempo suficiente, esto sólo debería ser a partir de la primera perturbación al punto en que las mediciones muestran una presión negativa. La duración del pulso transmitido puede ser inferior a la del pulso incidente si una burbuja se encuentra atrapada. La magnitud no puede llegar a que el pulso incidente, pero debería haber una meseta bastante largo antes de la descarga. De lo contrario, ya sea una gran burbuja de aire en la cámara sellada o un desajuste entre la asamblea y un bar podría haber ocurrido.
5. La cámara de presurización de células se retira y desmontar el interior de la campana de cultivos celulares. El tornillo de purga se elimina y el pistón se desprendió de la cámara. La lámina de vidrio cultivo celular se toma del extremo del pistón.

4. Evaluar el comportamiento celular a presión

1. Después de la presurización, las células pueden ser inspeccionados inmediatamente o se incubaron para su posterior examen. Con una adecuada operación de los procesos de asepsia, a largo plazo después de la incubación es posible.
2. Las células a presión puede ser examinada por todas las técnicas de biología molecular y celular. Específicamente para la presurización de las células neuronales, para investigar la fisiología celular y molecular de las condiciones de TBI, los ensayos de evaluación de la presión inducida por los cambios en el crecimiento de las neuritas, cambiar los microtúbulos del citoesqueleto, la expresión génica neuronal, apoptosis, etc, se puede realizar. Como muestras de control de células, las células que se cultivan los mismos, mantienen en el interior de la cámara de presurización para el mismo período de tiempo, pero no a presión se utilizan (llamado así, el control de la cámara).
3. Para evaluar los cambios en el crecimiento de las neuritas, las células de control de presión y la cámara se examinan con el microscopio óptico inmediatamente después de la presurización y 1 y 24 horas de post-incubación. Un ejemplo de las imágenes de las células neuronales se muestran en la sección "Resultados Representante" (Figura 2). El cambio de longitud neurite se puede cuantificar mediante tinción de actina de inmunofluorescencia y análisis de imágenes. Las células se fijan con una solución de paraformaldehído al 4% w / v, se aclara con un 0,05% v / v de Tween-20 tampón de lavado, y permeabilized con un 0,1% v / v Triton X-100 solución. Después de bloquear con una solución al 1% w / v de albúmina sérica bovina, las células se incubaron con isotiocianato tetrametilrodamina (TRITC)-conjugado phalloidin. Imágenes de inmunofluorescencia de las células son tomadas con un microscopio de fluorescencia y las longitudes de los axones de las células a presión y el control se cuantificó mediante el software ImageJ (NIH).
4. Las neuritas pueden ser identificados como los axones o dendritas. Para evaluar los cambios morfológicos en los axones o dendritas, los experimentos descritos anteriormente pueden ser repetidos por el uso de anticuerpos para detectar cada estructura, es decir, neurofilamentos (NF) de anticuerpos de los axones y la proteína asociada a los microtúbulos (MAP2) de anticuerpos de las dendritas.
5. Los microtúbulos son uno de los principales componentes del citoesqueleto de las neuronas, y el daño a los microtúbulos se ha utilizado como un marcador de lesión neuronal. ² microtúbulos se puede visualizar immunofluorescently el uso del anticuerpo β-tubulina. Las células se fijan después de 0 y 24 horas de post-presurización, teñidas con anticuerpos β-tubulina, y observada por el microscopio de fluorescencia.
6. Para evaluar el efecto de la presurización impulsiva sobre la expresión genética neuronal y apoptosis, el ARN total se extrae de las células de presión y control. La expresión génica puede ser examinada mediante la realización de RT-PCR cuantitativa en tiempo real o RT-PCR, similar a los protocolos publicados. ³

5. Los resultados representativos:

Figura 1. Un ejemplo de perfil de presión aplicado a las celdas dentro de la cámara de presurización. El aparato de barra Kolsky éxito genera nivel 2 MPa, para un pulso único de presurización tipo impulsivo, con una duración de alrededor de 0,7 ms.

Figura 2. Un ejemplo de la respuesta neuronal a la presurización impulsivo. SH-SY5Y células expuestas a la presurización impulsivo a 2 MPa muestran distintas neurita / axón ruptura en relación con las células de control de la cámara.

6. Dificultades y soluciones

1. Cámara de sellado es uno de los principales obstáculos a superar. Es porund que los discos de ancho, con juntas tóricas tiene un problema de la especulación y el aumento de la fricción. Con el fin de eliminar los efectos de fricción, así como prevenir la especulación, un simple método de grabación de pistón con cinta de teflón fontanero se utiliza. Esto resuelve los problemas y produce el nivel deseado de presión y la duración.
2. Comportamiento a presión de las células neuronales, especialmente cuando se evalúa mecanismo secundario TBI o efectos a más largo plazo, deben ser examinados después de un largo post-tiempo de incubación. La cámara de la celda que contiene está expuesta a condiciones potencialmente no estéril mientras se mueve a la barra de Kolsky, presionar y mover de nuevo a la capilla de cultivo celular. Con la pre-esterilización de las piezas de cámara y un funcionamiento adecuado en el montaje / desmontaje de la diapositiva cultivo celular y la cámara interior de la campana de cultivo de células, a largo plazo después de la incubación es posible hasta varias semanas.
3. La reproducibilidad de los datos es un parámetro importante en el celular experimentos de estimulación mecánica. De nuestro dispositivo, la reproducibilidad de la respuesta de las células neuronales se determina cómo el perfil deseado de presurización impulsivo, en el nivel de presión y la duración, se obtuvo reiteradamente. Ya que registrar el perfil de presión obtenidos para cada uno de presurización, los datos de respuesta de las células del perfil de presión no deseados se pueden excluir manualmente después.
4. Los pasos de presurización todo, incluido el montaje de cámara, transferencia y montaje en la barra de Kolsky, presurización, traslado de regreso, y la cámara de desmontaje, en menos de 10 min. La diapositiva de células cultivadas siguiente se puede presurizar inmediatamente después de la presurización anterior. Por lo tanto, un número suficiente de ensayos de presurización se puede completar de manera eficiente. Nuestra puesta a punto utiliza 18 mm cubreobjetos de vidrio de diámetro. Uno de los experimentos de presurización no proporciona suficientes proteínas para inmunotransferencia debido al tamaño de sustrato (y también en parte porque algunas de las células a presión están muertos). Alrededor de tres experimentos de presurización repetidos proporcionar la cantidad de proteínas necesarias para inmunotransferencia. Una vez más, la reproducibilidad se comprueba cada vez con el perfil de presión.

Discusión

Muchas técnicas experimentales in vitro se hayan realizado para estudiar el daño de las células cerebrales en las condiciones de TBI. Estos incluyen la neurona / astrocito estiramiento, inducida por el flujo esfuerzo cortante, bajar de peso, laceración lápiz láser transección, litotricia, etc ^4,5 Se ha asumido que la corta duración de sobrepresión es un factor dominante física para la LCT. Especialmente ^6,7 , la onda expansiva de la explosión TBI tiene una duración de pulso de una orden de milisegundos. ⁴ Basado en esta hipótesis y la observación, la cámara de barómetro capaz de presurización transitorio ha sido desarrollado y utilizado para evaluar el comportamiento de las células cerebrales en condiciones de TBI. Por ejemplo, en el líquido de la cámara de percusión barotrauma un impulso de presión con 20-30 ms de duración larga y un pico de presión de hasta 0,5 MPa se utilizó para examinar el comportamiento humano de células gliales en la LCT. ⁶ Recientemente, VandeVord et al. ⁷ metal usado bola de cámara sorprendente barómetro para examinar el comportamiento celular de astrocitos en TBI pero la bola de metal en huelga produce pulsos de presión múltiple. En este estudio, hemos desarrollado un dispositivo de presurización de la célula nueva que genera un solo pulso de presurización de tipo impulsivo. El dispositivo fue desarrollado sobre la base de la barra de Kolsky puesta en marcha, que ha sido utilizada como un aparato de ensayo de materiales en la ⁸ y los estudios de otros. El ^1,9 bar Kolsky la capacidad de ensayo de materiales en la tasa de carga muy alta se ha modificado para poder aplicar un solo pulso de sobrepresión tipo en las células cultivadas dentro de la cámara de presurización (Figura 1). Con éxito puede controlar la magnitud y la duración de la sobrepresión impulsivo. Como una respuesta de células representativas, hemos demostrado que la presión en MPa 2 SH-SY5Y células neuronales pantalla neuritas importante y la pérdida axonal en comparación con las células sin presión cámara de control.

En conclusión, hemos desarrollado un novedoso aparato impulsivo presurización de células utilizando un dispositivo especialmente diseñado Kolsky bar y demostró su potencial uso en la investigación de la respuesta neuronal en condiciones de TBI. También tomamos nota de que esta técnica es muy versátil en el que cualquier tipo de células pueden estar expuestos a las presiones impulsivas en varios niveles y la duración. Por lo tanto, el dispositivo se puede utilizar para investigar el impulsivo presión inducida por el comportamiento mecanotransducción celular, no sólo por causar lesiones a las células, sino también para estimular las células de manera positiva en su función y determinar el destino.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
SH-SY5Y (ATCC, CRL-2266) human neuroblastoma cells
18 mm diameter glass coverslips
Cell culture media: DMEM, 10% fetal bovine serum, 1% penicillin-streptomycin
Retinoic acid (10 μM) for inducing neurogenesis
Kolsky bar impulsive pressurization device
Piston-cylinder cell pressurization chamber
Stainless steel screws for securing cell cultured coverslip on the piston
Grease for interfaces between cell chamber and Kolsky bar
General molecular biology supplies for assessing cell response to pressurization (fixative, antibody, fluorescent dye, PCR supplies, etc.)