Monitoreo metástasis tumorales y lesiones osteolíticas con bioluminiscencia y Micro Imágenes de TC

Resumen

Un modelo experimental de ratón de las metástasis óseas se estableció después de la entrega intracardíaca de luciferasa que expresan las células del tumor mamario. El desarrollo de tumores y dio lugar a lesión osteolítica fueron controlados longitudinalmente con bioluminiscencia y micro TC.

Resumen

Después del parto intracardíaca de MDA-MB-231-luc-D3H2LN células a ratones nu / nu, metástasis a distancia desarrollado en los animales inyectados. Imágenes de bioluminiscencia que utilizan el espectro IVIS fue contratado para supervisar la distribución y el desarrollo de las células tumorales siguiendo el procedimiento de entrega, incluyendo la reconstrucción DLIT para medir la señal de tumor y su ubicación.

El desarrollo de las lesiones metastásicas en los tejidos del hueso provoca una actividad osteolítica y lesiones a la tibia y el fémur fueron evaluados longitudinalmente mediante micro CT. Imágenes se realizó con un sistema de Quantum FX micro CT con imágenes rápido y dosis bajas de rayos-X. La baja dosis de radiación permite múltiples sesiones de imagen para llevar a cabo con un acumulado de rayos X de dosis muy por debajo de DL50. Una imagen del ratón dispositivo de transporte fue utilizado para la imagen de forma secuencial a los ratones con dos IVIS Spectrum y FX cuántica lograr el posicionamiento exacto de los animales, tanto en la bioluminiscencia y las imágenes de TC. La óptica y conjuntos de datos de CT se co-registradas en 3-dimentions con la imagen viva de software 4.1. Este enfoque multi-modo permite una estrecha vigilancia del crecimiento tumoral y el desarrollo de forma simultánea con la actividad osteolítica.

Protocolo

Imágenes longitudinales se utiliza en estudios pre-clínicos para seguir el progreso de una enfermedad o medir el efecto de un agente terapéutico. En oncología, los métodos ópticos proporcionan herramientas rigurosas para controlar el crecimiento del tumor y entregar la cuantificación precisa del crecimiento celular o la expresión de genes en cada momento en dicho estudio. Cambios anatómicos se puede medir utilizando una técnica de alta resolución como microCT, pero para la imagen longitudinal una baja dosis de rayos X debe ser utilizado para evitar los artefactos biológicos. Imágenes ópticas y microCT pueden ser co-registro para la prestación de una combinación de datos funcionales y anatómicos asegurar que el máximo de información se extrae de un modelo animal.

1. Preparación de células

1. Caliper ofrece una amplia gama de luciferasa expresando líneas celulares de cáncer de la investigación preclínica en modelos de ratón.
2. MDA-MB-231-luc-D2H2LN es un ser humano línea de células tumorales mamarias expresan el gen de la luciferasa, que puede ser utilizado como un indicador óptico de tumorgenesis en vivo. Esta línea celular se crea a partir de una metástasis de ganglios linfáticos espontánea que se originó a partir de un tumor mamario D3H1 almohadilla de grasa y se sabe que la forma agresiva de metástasis.
3. Las células se proporcionan como una cultura congelada libre de agentes patógenos que rápidamente crece en los medios de comunicación estándar, sin necesidad de marcadores de selección.
4. Para verificar la actividad de la luciferasa antes de la inyección en el animal un frasco de 90% confluentes se cosechan por tripsinización. La actividad luciferasa se mide mediante la supresión de 50.000 células en una placa de microtitulación y la realización de series de dilución.

2. Intracardiaca inyección de células en los animales

1. Antes de la inyección, los animales son anestesiados utilizando el 3% de isoflurano.
2. 1-3 million células se inyectan en el volumen de 50 ul en el ventrículo izquierdo. Suspensión celular contiene 150ug/ml D-luciferina para validar la técnica de inyección.
3. Para confirmar una correcta inyección intracardíaca ratones son expuestas en el sistema de IVIS. Los ratones que muestran la señal de BLI en todo el cuerpo se han inyectado correctamente. Si la señal se localiza en las células no se les inyectó correctamente en el corazón.

3. BLI imágenes para controlar las metástasis

1. El servicio de transporte de imagen compatible con el ratón para la captura de datos, tanto en espectro IVIS y el sistema de QuantumFX microCT.
2. El servicio de transporte ayuda a mantener al animal en la misma posición para la imagen e incorpora señales de fiabilidad en la ayuda automática de co-registro. La cámara está conectada al vaporizador isofluorance para mantener la anestesia.
3. Asistente de imágenes en el software de imagen viva 4.1 se puede utilizar para seleccionar automáticamente el tiempo de exposición, f-stop y hurgar en la basura y garantizar la recogida de datos cuantitativos.
4. Varias imágenes pueden ser adquiridas y comparados en los estudios longitudinales que cubren segundos o meses, dependiendo de la naturaleza del experimento.
5. El día 6 después de la inyección de las células, BLI imágenes con IVIS espectro muestra metástasis óseas en siete de los nueve ratones.

4. Seguimiento longitudinal de las lesiones osteolíticas con micro CT

1. Los ratones que mostraron metástasis ósea visible con clara BLI fueron estudiados en el sistema Quantum FX micro CT.
2. El Quantum FX micro sistema CT proporciona imágenes de alta calidad a una dosis de rayos X lo suficientemente bajo como para permitir cierto longitudinal CT micro en estudios preclínicos.
3. Degradación de los huesos en ambas piernas puede ser longitudinal monitoreados utilizando este sistema en menos de un minuto.
4. Los ratones son anestesiados con isoflurano 3% y pueden ser transferidos directamente desde el sistema Spectrum IVIS.
5. Dos imágenes de 60mm se cosen para captar la opinión de animal.
6. Un campo de visión de 30 mm es ideal para obtener imágenes de la articulación de la rodilla en alta resolución.
7. Un solo escaneo con una resolución lo suficientemente alta como para medir y cuantificar las metástasis óseas sólo tarda 18 segundos y libera una dosis de 13mGy solamente.
8. Los ratones fueron estudiados hasta 8 veces en 36 días con el sistema de micro CT sin afectar el crecimiento del tumor o la salud del animal.
9. El micro de imágenes de TC mostraban que leisions huesos eran visibles en el día 10 y avanzó muy rápidamente, lo que corresponde al aumento de la señal de BLI.

5. 3D co-registro y el análisis de BLI y UCT

1. Una vez que las imágenes han sido capturados en todo el ámbito IVIS y Quantum FX micro datos de la TC sistema puede ser co-registradas en una reconstrucción en 3D.
2. MicroCT imágenes se exportan como archivos DICOM y se cargan en la imagen viva 4,1 herramienta 3D de múltiples modalidades.
3. En el software de imagen viva de ejecutar el programa en tres dimensiones DLIT a reconstruir la señal óptica.
4. La herramienta de referencia en el software se utiliza para co-registro de la señal óptica BLI a la imagen de micro CT.
5. Conjuntos de datos corregistradas pueden ser analizados cuantitativamente para controlar múltiples parámetros en progresión de la enfermedad, aquí estamos el seguimiento del crecimiento del tumor metastásico junto con el desarrollo de la lesión osteolítica en el hueso.

Discusión

Small animal imaging with microCT has been applied to monitoring osteolytic lesions under pathological conditions, such as tumor development (Cowey et al. 2007; Labrinidis et al., 2009). As bioluminescence imaging of luciferase labeled tumors has been widely adopted pre-clinically, co-registration of bioluminescence and microCT images provided a better definition of anatomical location of the bioluminescence signals (Kaijzel et al. 2007). Previous study with a luciferase labeled breast tumor cell line MDA-MB-231-luc-D3H2LN showed metastases to bone and development of osteolytic lesions following intra-cardiac injection (Jenkins et al 2005; Minn et al., 2005). In this study, we explored a longitudinal study of tumor metastases and osteolytic activity with combinatory optical and low-radiation-dose microCT imaging with the systemic MDA-MB-231-luc-D3H2LN metastasis model. We performed sequential imaging with IVIS Spectrum and Quantum FX microCT systems and achieved bioluminescence and CT co-registration with our newly developed Living Image 4.1 software (Heng et al., 2010). Bioluminescence imaging with IVIS provides non-invasive detection of the tumor cells with high sensitivity, allowing the tumors to be detected at early stage. Imaging with Quantum FX allows accurate 3D reconstruction of the bone lesions and detailed anatomical information. Quantum FX system offers low radiation dose imaging, which enables longitudinal monitoring of disease progression. Correlation of bone lesions and tumor metastases was depicted in the co-registered image, and the advantage of multimodality tracking of lesion development longitudinally was clearly demonstrated.