A tiempo real Técnica de Impedancia Eléctrica base para medir la invasión de monocapa de células endoteliales de las células cancerosas

Resumen

En este artículo se describe una In vitro Técnica para las células cancerosas invasoras de vigilancia a través de una monocapa de células endoteliales. Los datos se adquiere en tiempo real como una función de los cambios en la impedancia en la superficie de los electrodos en la parte inferior así.

Resumen

La diseminación metastásica de las células malignas requiere la degradación de la membrana basal, la unión de células tumorales al endotelio vascular, la retracción de las uniones endoteliales y, finalmente, la invasión y la migración de las células tumorales a través de la capa endotelial para entrar en el torrente sanguíneo como un medio de transporte a sitios distantes en el huésped ^1-3. Una vez en el sistema circulatorio, las células cancerosas se adhieren a las paredes capilares y extravasación al tejido circundante para formar tumores metastásicos ^4,5. Los diversos componentes de interacción célula-célula endotelial del tumor pueden replicarse in vitro por impugnar una monocapa de células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) con células de cáncer. Los estudios realizados con electrones y microscopía de contraste de fase sugieren que la secuencia en vitro de eventos bastante representan el vivo proceso metastásico ⁶ in. A continuación, describimos una técnica basada en impedancia eléctrica que controla y cuantifica en tiempo real de los INVASiones de las células endoteliales por células tumorales malignas.

Giaever y Keese descritos por primera vez una técnica para medir las fluctuaciones en la impedancia cuando una población de células de crecer en la superficie de los electrodos ^7,8. El instrumento xCELLigence, fabricado por Roche, utiliza una técnica similar para medir cambios en la impedancia eléctrica como las células se adhieren y propagan en una placa de cultivo cubierto con una matriz de microelectrodos de oro que cubre aproximadamente el 80% de la superficie en el fondo de un pozo. Como las células se adhieren y propagan sobre la superficie del electrodo, que conduce a un aumento de la impedancia eléctrica ^9-12. La impedancia se muestra como un parámetro denominado índice de células-adimensional, que es directamente proporcional a la superficie total de cultivo de tejidos bien que está cubierto por las células. Por lo tanto, el índice de célula puede ser usado para monitorear la adhesión celular, la difusión, la morfología y la densidad de las células.

La invasión de ensayo descrito en este artículo se basa en los cambiosen la impedancia eléctrica en la interfase electrodo / célula, como una población de células malignas invadir a través de una monocapa de HUVEC (Figura 1). La interrupción de las uniones endoteliales, retracción de la monocapa endotelial y la sustitución por las células tumorales conduce a grandes cambios en la impedancia. Estos cambios se correlacionan directamente con la capacidad invasiva de las células tumorales, es decir, la invasión de células altamente agresivos conducen a grandes cambios en la impedancia celular y viceversa. Esta técnica proporciona una doble ventaja sobre los métodos existentes de la medición de la invasión, tales como cámara de Boyden y ensayos de matrigel: 1) la interacción célula-célula endotelial del tumor imita más estrechamente el proceso in vivo, y 2) se obtienen los datos en tiempo real, tiempo y es más fácilmente cuantificable, en comparación con el análisis de punto final para otros métodos.

Protocolo

1. Preparación

1. Todos los pasos deben realizarse en condiciones estériles en una campana de cultivo de tejidos.
2. La estación de xCELLigence se coloca en una incubadora de 37 ° C en presencia de 5% de CO _2.
3. Usa las células HUVEC de paso bajo, preferiblemente no más que el paso 6. Además, asegúrese de que las células no son más del 75% de confluencia en el tiempo de la cosecha.
4. Las células HUVEC se cultivan en medios EGM-2 reconstituidos con kit de EGM-2 bala (Lonza Biosciences) que contiene factores de crecimiento, suplementos y 5% de suero bovino fetal.
5. Todos los rastros de tripsina deben ser retirados de las suspensiones de células haciendo girar las células a 200xg, lavando una vez con PBS, y resuspensión de ellos a densidades celulares indicadas.
6. Escudo xCELLigence E-placa de 16 con 0,1% de gelatina durante 1 hora a 37 ° C o durante la noche a 4 ° C. Lave la placa con PBS y añadir 100μL EGM-2 reconstituido medios. Realizar una lectura en blanco en el sistema para medir xCELLigence fondoimpedancia en ausencia de células.

2. Generación de HUVEC monocapa

1. Coseche un frasco sub-confluente de células HUVEC mediante tripsinización. Resuspender las células en reconstituidas EGM-2 medio a una densidad final de x 10 ⁵ células / ml 2.5.
2. A cada pocillo de un fondo calibrado E-placa que contiene 100μL EGM-2 los medios de comunicación, añadir 100μL de la suspensión de células HUVEC (10 ⁴ células HUVEC 2,5 x).
3. Instale inmediatamente E-Plate en el instrumento xCELLigence.
4. Software xCELLigence programa para realizar lecturas de impedancia en intervalos de 10 minutos.
5. Deje que las células endoteliales crecen para 18-21 horas hasta que formen una monocapa, como se evidencia por un aplanamiento de índice de células (Figura 2).

3. La adición de las células y la normalización de datos invasor.

1. Una vez que una monocapa HUVEC estable se ha formado, la cosecha células tumorales mediante tratamiento con tripsina y se resuspenden a una las casas de finalesdad de 1 x 10 ⁵ células / ml en los medios utilizados para cultivar las células tumorales (tal como RPMI o DMEM que contiene 10% de FBS)
2. Lecturas de impedancia pausa en el software xCELLigence y eliminar E-Placa de la estación.
3. Retire EGM-2 medio por aspiración. Añadir 100μL de la suspensión de células tumorales que contiene 10 células x 1 ^4. En general, una proporción de células tumorales 1:2,5: células endoteliales sembradas, que funciona mejor para el ensayo. Sin embargo, la relación puede ser optimizado para las líneas celulares individuales.
4. Coloque la placa de E-en el sistema de xCELLigence en la incubadora y continuar lecturas de impedancia a intervalos de 10 minutos.
5. La invasión se puede monitorizar en tiempo real, en los próximos 6-12 horas como una caída en el índice de la célula debido a la retracción de las uniones endoteliales y la penetración por invasión de células tumorales.
6. Normalizar los resultados al momento de la adición de invasión de las células tumorales. El software permite la normalización xCELLigence a cualquier punto del tiempo y los resultadosse puede ver directamente en la ventana del programa.

4. Los resultados representativos:

Un ejemplo de monocapa HUVEC invasión por las células metastásicas y no metastásico se muestra en la Figura 3. K7M2 es una línea celular de osteosarcoma metastásico. Estas células expresan altos niveles de la proteína del citoesqueleto ezrina enlazador, que representa las propiedades invasivas de esta línea celular ^13,14. Cuando las células HUVEC se estimularon con células K7M2, hay una caída en la resistencia eléctrica dentro de las 6 horas. Esta caída en la resistencia eléctrica representa la invasión de la monocapa HUVEC por las células tumorales invasoras. La línea de células K12, por otra parte, expresa niveles mucho más bajos de ezrina y es por consiguiente menos metastásico ^13. Desafiante la monocapa HUVEC con K12 células da como resultado una menos fuerte caída en la resistencia a medida que las células son incapaces de adherirse o invadir a través de la monocapa HUVEC (Figura 3).

Figura 1. Diagrama esquemático de proceso de flujo de trabajo para la invasión de las células endoteliales por células tumorales. Las células HUVEC se sembraron en E-placas recubiertas de gelatina y se dejaron formar una monocapa confluente. Las células malignas se añaden una vez que se ha formado una monocapa y la invasión se monitoriza en tiempo real, como el índice de la célula cambia debido a la invasión de la monocapa endotelial.

Figura 2. Formación monocapa HUVEC. Los cambios en el índice de células como las células HUVEC se unen a y se extienden sobre electrodos de oro recubiertas de gelatina. La formación de una monocapa confluente está representado por una estabilización de índice de células después de 18 horas.

Figura 3. La invasión de las células HUVEC por las células de osteosarcoma K7M2 y K12. Una fuerte disminución de la cell-índice se produce dentro de unas pocas horas de la introducción de las células altamente metastásicas K7M2. Células K12, por otro lado, son menos metastásico y son incapaces de penetrar en la monocapa endotelial tan eficientemente como las células K7M2. Esto está representado por una disminución menos pronunciada en el índice de la célula cuando la monocapa HUVEC se desafió con células K12. De control representa la impedancia de la monocapa HUVEC en ausencia de células cancerosas. Los experimentos se realizaron por triplicado.

Discusión

El ensayo de invasión de células HUVEC en tiempo real es un método simple pero potente, para la supervisión invasión. Se proporciona resultados en tiempo real, lo cual es una ventaja significativa sobre otras técnicas tradicionales que se basan en el análisis de punto final. El ensayo puede ser modificado para fármacos de ensayo, anticuerpos, ligandos y proteínas como inhibidores o estimuladores de la metástasis. El efecto de diferentes agentes en células endoteliales / cáncer de diafonía puede evaluarse también. Cuando la introducción de agentes exógenos, tales como factores de crecimiento y drogas en los medios de cultivo, es importante para asegurarse de que no afectan a la integridad de la monocapa HUVEC. La interrupción de la monocapa HUVEC se puede probar mediante la introducción del agente exógeno en ausencia de células invasoras, y asegurar que no hay ningún cambio en el índice de la célula. Por lo tanto, los controles apropiados deben ser incluidos como parte del diseño experimental.

Líneas celulares diferentes demuestran diferentes curvas de células de índice, ya que forman un confmonocapa luent. La forma de la curva, así como la célula-índice máximo alcanzado, es de tipo celular específico. Células HUVEC muestran una característica transitoria aplanamiento de índice de células 4-6 horas después de la siembra, seguido por otro de estabilización en un índice mayor de células después de 16-18 horas. Por lo tanto, es importante dejar que las células forman una monocapa confluente durante al menos 18 horas antes de la adición de las células tumorales.

Dado que el índice de células es dependiente sobre el medio ambiente iónico en la interfase electrodo / célula, varios factores tales como la morfología celular y la calidad de las adherencias célula-célula influyen en el índice de células, además de la zona del fondo del pozo cubierto. Por lo tanto, la disminución en el índice de células, que se produce tras la invasión de células tumorales, es una función de varios factores, que incluyen la retracción de las uniones endoteliales y la posterior invasión de células tumorales.

El instrumento xCELLigence se fabrica en tres configuraciones diferentes: analizador de células en tiempo real(RTCA) SP, RTCA MP y DP RTCA. El instrumento RTCA SP tiene un 96-así placa de E-mientras que el instrumento RTCA MP con capacidad para seis de 96 pocillos E-platos simultáneamente. Esto permite la selección de alto rendimiento de fármacos y compuestos. Los experimentos descritos en este artículo se realizaron con el instrumento DP RTCA, con capacidad para tres de 16 y E-platos. Cada estación de soporte E-placa puede funcionar de forma independiente, lo que permite que varios usuarios ejecutar experimentos de forma simultánea. El instrumento DP RTCA también se puede utilizar para estudiar la migración utilizando placas de CIM. Estas son placas de 16 pocillos con cámaras superior e inferior separadas por un tereftalato de polietileno (PET) de membrana con un tamaño medio de poro de 8um. Los sensores electrónicos se encuentran en la parte inferior de la membrana porosa de la cámara superior. La cámara inferior sirve como un depósito para quimioatrayente para las células en la cámara superior. Sin embargo, una ventaja importante de la invasión de ensayo HUVEC sobre las placas de CIM es que la invasión de células tumorales en la antigua is no restringido por el tamaño de poro, como la invasión de células endoteliales depende de la diafonía entre las células tumorales y endoteliales.

El ensayo de invasión de células HUVEC también se puede realizar en ECIS Z instrumento, fabricado por Applied Biofísica (Troy, NY). El Z instrumento ECIS utiliza una tecnología similar a la del instrumento xCELLigence, con las diferencias en las configuraciones de matriz y el electrodo. Hemos llevado a cabo con éxito los ensayos de invasión HUVEC utilizando los arrays ECIS 8 pocillos. Es importante tener en cuenta que el área de superficie de pocillos de fondo es mayor en las matrices de ECIS, lo que requiere un mayor número de células endoteliales y tumorales a ser chapado: 2,5 x 10 ⁵ células y 1 x 10 ⁵ respectivamente.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
xCELLigence RTCA DP station	Roche Group	05469759001
RTCA control unit	Roche Group	05454417001	Notebook with preinstalled RTCA software
E-Plate 16	Roche Group	05469830001
HUVEC cells	Lonza Inc.	CC-2517
EGM-2 media	Lonza Inc.	CC-3156
EGM-2 bullet kit	Lonza Inc.	CC-4176
0.1% Gelatin in sterile H2O	EMD Millipore	MCPROTO045