Selección de Plasmodium falciparum Los parásitos de cytoadhesion a las células cerebrales endoteliales humanas

Resumen

Un In vitro Modelo para el secuestro de la malaria cerebral se describe ¹. Plasmodium falciparum Los glóbulos rojos infectados son seleccionados para unirse al inmortalizado células del cerebro humano endoteliales microvasculares. Los parásitos seleccionados muestran un fenotipo distinto. El proceso de selección pueden ser aplicados utilizando diversos P. falciparum Cepas y líneas de células endoteliales.

Resumen

La mayoría de las muertes por malaria humana es causada por el Plasmodium estadio en sangre los parásitos P. falciparum. La malaria cerebral, la complicación más mortal de la enfermedad, se caracteriza por una acumulación de Plasmodium falciparum los glóbulos rojos infectados (iRBC) en la etapa de trofozoíto pigmentadas en la microvasculatura del cerebro ^2-4. Esta obstrucción microvascular (secuestro) conduce a la acidosis, la hipoxia y perjudiciales citoquinas inflamatorias (revisado en ^5). El secuestro también se encuentra en la mayoría de los tejidos microvascular del cuerpo humano ^{2, 3.} El mecanismo por el cual iRBC adhieren a las paredes de los vasos sanguíneos aún es poco conocido.

La línea inmortalizada Humanos microvascular cerebral de células endoteliales (HBEC-5i) ha sido utilizado como un modelo in vitro de la barrera sangre-cerebro ^6. Sin embargo, el Plasmodium falciparum iRBC adjuntar sólo poco a HBEC-5i in vitro, a diferencia de la densa sequestrationes que se produce en los casos de malaria cerebral. Por lo tanto, desarrolló un ensayo panorámico para seleccionar (enriquecer) varias P. falciparum cepas para la adhesión a HBEC-5i para obtener poblaciones de alto vinculante parásitos, más representativo de lo que ocurre in vivo.

Una muestra de un cultivo de parásitos (mezcla de iRBC y no infectados RBC) en la fase de trofozoito pigmentadas se lava y se incubaron en una capa de HBEC-5i cultivadas en una placa de Petri. Después de la incubación, el plato está cuidadosamente lavados de uRBC iRBC y no consolidados. Fresco uRBC se añaden a la iRBC pocas condiciones para HBEC-5i y se incubaron durante la noche. Como los parásitos esquizonte etapa explosión, merozoitos reinvade RBC y los parásitos en el estadio de anillo se cosechan al día siguiente. Los parásitos se cultivan hasta que se obtiene material suficiente (generalmente de 2 a 4 semanas) y una nueva ronda de selección se puede realizar. Dependiendo de la P. falciparum cepa, de 4 a 7 rondas de selección son necesarios para obtener una poblacióndonde la mayoría de los parásitos se unen a HBEC-5i. El fenotipo de la unión se pierde progresivamente a las pocas semanas, lo que indica un cambio en la expresión del gen del antígeno de superficie variante, por lo tanto la selección regular de HBEC-5i es necesaria para mantener el fenotipo.

En resumen, hemos desarrollado un ensayo de selección de la representación P. falciparum parásitos más "adhesivo malaria cerebral" fenotipo. Hemos sido capaces de seleccionar 3 de cada 4 P. falciparum cepas de HBEC-5i. Este ensayo también ha sido utilizado con éxito para seleccionar los parásitos de la unión a las células endoteliales humanas dérmicas y pulmonares. Es importante destacar que este método puede ser usado para seleccionar tejidos específicos poblaciones de parásitos a fin de identificar ligandos candidato parásito para la unión al endotelio cerebral. Por otra parte, este ensayo puede ser utilizado para detectar el supuesto secuestro de medicamentos ^anti-7.

Protocolo

Recomendaciones generales

Microvascular cerebro humano las células endoteliales (HBEC-5i) la cultura se ha descrito anteriormente en ^{6, 8.} P. los parásitos P. falciparum fueron cultivadas como en ^9. Ambos HBEC-5i y P. falciparum parásito culturas deben mantenerse en condiciones estériles en todo momento. Todos los reactivos deben ser pre-calentado a 37 ° C. Se recomienda comprobar regularmente la contaminación por micoplasma ¹⁰ por PCR (Minevera Biolabs, las instrucciones del fabricante siguiente). El protocolo se resume en la figura 1.

1. De las células endoteliales cultivo de rutina

1. Preparar los reactivos necesarios.

Medio para preparar	Reactivos	Cantidad
"Incompleta DMEM"	DMEM-F12 de Ham	500 ml
Ynbsp;	L-glutamina 200 mM	5 ml
	Penicilina / estreptomicina 100X	5 ml
	NaOH 1M	1,3 ml (ajustar el pH a 7.4)
"DMEM completo"	"Incompleta DMEM"	450 ml
	Suero bovino fetal inactivado por calor	50ml
	De las células endoteliales suplemento de crecimiento	5 ml

2. Cultura HBEC-5i en un respiradero de 25cm ² frasco con 10 ml de medio DMEM completo en una incubadora a 37 ° C con 5% de CO _2.
3. Las células de paso cuando se hacen confluentes. Eliminar el medio de edad por succión y lavar dos veces con medio DMEM incompleto o cultivo de tejidos de grado PBS (Ca ^{2 +} y Mg ^{2 +} libre) pre-calentado a 37 ° C.
4. Añadir 1 ml de pre-calentado TratePSIN-EDTA (0,025% de tripsina, 0,5 mM EDTA) en forma de remolino para cubrir la totalidad del frasco y se incuba durante ~ 2 min a 37 ° C.
5. Revisar bajo microscopio invertido al menos el 90% de las células se han separado. Si es necesario, suavemente golpee el fondo del frasco para desprender las células adherentes. Añadir 10 ml de medio DMEM completo para bloquear las células tripsina y la transferencia en un tubo cónico de 15 ml. Centrifugar durante 4 min a 300 g, a temperatura ambiente (TA).
6. Descartar el sobrenadante y resuspender el precipitado con 10 ml de medio DMEM completo. Pipeta la solución de arriba y abajo para volver a suspender completamente las células.
7. Agregar 1 o 2 ml de la suspensión de células en un frasco de cultivo nuevo y añadir 8 ml de medio fresco para mantener la cultura. Evaluar el crecimiento de la cultura todos los días bajo un microscopio invertido y el cambio medio de cada 2 o 3 días antes de que se vuelve amarillo.

2. Preparación de las células endoteliales para una selección

1. Dos días antes del día de la selectio n, añade fibronectina diluido en PBS estéril (2 mg / cm ²⁾ en una (o más) 60 mm placa de Petri. Incubar la placa durante 5 a 20 min a 37 ° C, extraer la solución de fibronectina, que pueden ser almacenadas a 4 ° C durante un mes y volver a utilizarse una vez.
2. Las células de paso como se describe en las secciones 1.3. a 1,5. Asumiendo el 100% de células confluentes se separaron y se resuspendieron en 10 ml de medio DMEM completo (sección 1.6., Volver a suspender con un volumen equivalente de medio si la confluencia es menor, por ejemplo, volver a suspender con 8 ml si la confluencia fue del 80%), añadir 1,5 ml de la suspensión las células a la placa recubierta de fibronectina Petri y otro 1,5 ml de medio DMEM completo.
3. Coloque el plato de Petri sembradas en la incubadora. Nota: Lo ideal sería que la confluencia será de alrededor de 90% en el momento de la selección de dos días más tarde.
4. Opcional. Para activar HBEC-5i, agregue el TNF (Factor de Necrosis Tumoral) de citoquinas a una concentración final de 50μg/ml 24 horas antes de la selección.

e_title "> 3. Plasmodium falciparum cultivo de rutina

1. Preparar los reactivos necesarios (ver tabla aquí debajo). Prepare los glóbulos rojos (GR) por la separación de sangre total (grupo O +) por el paso a través de un filtro de los leucocitos (véase "Métodos de Investigación de Paludismo", la publicación ¹¹ de la malaria en general el cultivo de parásitos). Lavar dos veces al RBC por centrifugación a 400 g durante 5 minutos y resuspender con 10 ml de RPMI incompleto. Mantenga lava RBC a 4 ° C en medio incompleto el 50% de hematocrito.

Medio para preparar	Reactivos	Cantidad
"Incompleta RPMI"	RPMI 1640 (con bicarbonato)	500 ml
	Hepes 1M	12.5ml
	Glucosa al 20%	5 ml
	L-glutamina 200 mM	5 ml
	Gentamicina 50mg/ml	250μl
	NaOH 1M	0,7 ml (ajustar el pH a 7.2)
"RPMI completo"	"Incompleta RPMI"	450 ml
	Humano agrupado (no inmunes) de suero	50ml

2. Cultivo de P. falciparum infectados RBC con medio RPMI completo en el 2% de hematocrito y se incuba a 37 ° C con el 3% de CO _2, 1% O _2, y 96% N _2. Realizar frotis de Giemsa ¹¹ todos los días para evaluar el grado de desarrollo de los parásitos (Figura 2).
3. Regularmente (aproximadamente una vez por semana) sincronizar la cultura por el tratamiento de sorbitol ^12. El día antes de la selección del ensayo, el objetivo de una cultura de anillo etapa en 5% de parasitemia o más (lo ideal es por lo menos 10%).

4. Selección de P. falciparum de cytoadhesion a las células endoteliales

1. En el día de la prueba, el cultivo de parásitos deben estar en fase de trofozoito pigmentados (Figura 2) (idealmente parasitemia 10%), mientras que HBEC-5i la cultura debe ser de 50 a 100% de confluencia (idealmente 90%). 30μl volumen celular de cultivo de parásitos que se necesita por HBEC-5i placa de Petri.
2. Lavar dos veces los parásitos por centrifugación (500 g por 5 min) 1,5 ml de cultivo de parásitos. Desechar el sobrenadante y resuspender con 10 ml de recién hecho, caliente, medio DMEM incompleto. Repetir el lavado por segunda vez. Resuspender el 30μl volumen celular con 1,5 ml de incompleta con BSA al 1% DMEM.
3. Lavar el plato recubierto HBEC-5i Petri doble aspiración de mediano y agregar 3 ml de DMEM incompleto.
4. Añadir la solución de los parásitos al plato HBEC-5i y se incuba a 37 ° C durante 75 min. Resuspender los parásitos en dos ocasiones (después de 30 y 60 minutos) durante la incubaciónmoviendo suavemente el plato en las cuatro direcciones, así como las agujas del reloj y en sentido contrario.
5. Después de la incubación, lavar el plato cinco veces por medio de aspiración, utilizando una pipeta de plástico Pasteur para añadir 3 ml de medio DMEM incompleto cálido y suave balanceo. Si los platos se están usando, guárdelas en una superficie caliente, como un frasco lleno de agua a 37 ° C.
6. Revise el plato bajo un microscopio invertido. Si muchos no infectada RBC son todavía visibles, hacer más lavados como se describió anteriormente. Manejar la placa de Petri con mucho cuidado para evitar cualquier riesgo de contaminación.
7. Quitar medio del plato y añadir 3 ml de agua tibia medio RPMI completo con un volumen de 40μl hematocrito de uRBC fresco.
8. Coloque el plato en una cámara hermética de incubación, gas, durante 3 minutos y colocar la cámara en una incubadora a 37 ° C durante la noche.
9. Al día siguiente, la cosecha de los parásitos mediante el lavado con medio RPMI incompleto, de un modo similar al descrito en la sección 4.4. pero con más fuerza. Keep todos los medio de comunicación utilizado (que contiene resuspendido RBC) en un tubo cónico de 15 ml. Revisar bajo microscopio invertido que todos los glóbulos rojos se han eliminado de la antena.
10. Se precipitan los parásitos, descartar el sobrenadante, resuspender en 5 ml de medio RPMI completo y colocar la mezcla en un frasco de cultivo normal.

5. Resultados representante

Parásitos no seleccionados muestran un bajo nivel de la unión a HBEC-5i (Figura 3). Así, después de la primera ronda de selección, muy pocos parásitos serán cosechados y puede tomar hasta un mes de cultivo para llegar a una parasitemia suficiente para la segunda ronda de selección. Después de cada ronda de selección, los parásitos más y más se unen a las células endoteliales y las selecciones se pueden repetir a intervalos de tiempo más corto. Después de 4-5 rondas de selección, de alta vinculante poblaciones de parásitos se obtienen (Figura 3).

En nuestras manos, la unión de HB3-HBEC a HBEC-5i o TNF activa HBEC-5i fue de simnivel de ILAR (datos no mostrados).

El protocolo descrito aquí se ha probado con 4 P. falciparum cepas: HB3, IT/FCR3, 3D7 y Dd2 (Tabla 1). Sólo este último no se ha demostrado capaz de unirse a HBEC-5i, incluso después de 5 rondas de selección.

HB3 parásitos también fueron seleccionados para cytoadherence a dérmicos humanos y pulmonar células endoteliales microvasculares (HDMEC y HPMEC). Después de cuatro rondas de selección, utilizando el método descrito aquí, una población de alto vinculante se obtuvo en ambos HDMEC y HPMEC (Figura 4).

Figura 1. Descripción general del proceso de selección.

Figura 2. Etapas de desarrollo de P. falciparum infectados glóbulos rojos. Frotis de Giemsa visualizaron bajo microscopio con un aumento de 1000X.

Figura 3. Un ejemplo típico de los parásitos unión a HBEC-5i. (A) La capa azul es HBEC-5i fija con glutaraldehído y se tiñeron con Giemsa, visualizaron bajo microscopio con un aumento de 1000X. Fotografías fueron tomadas después de uRBC y iRBC consolidados fueron arrasadas. El panel izquierdo muestra una sola P. falciparum HB3 (no seleccionado) parásito obligado a HBEC-5i. En el panel derecho de los parásitos HB3-HBEC había sido seleccionado por 5 rondas. (B) Los datos representan el promedio de dos experimentos independientes, cada uno realizado por duplicado. El número de parásitos obligados por las células endoteliales se había contado.

Tabla 1. Resumen de Plasmodium falciparum cepas que se han seleccionado con éxito por la unión a HBEC-5i. Tenga en cuenta que HB3 también fue seleccionado en el TNF-activa HBCE-5i. Después de 5 rondas de selección, la cepa Dd2 no mostró ningún aumento en la unión a HBEC-5i en comparación con el no seleccionado-Dd2.

Figura 4. La unión de P. falciparum HB3 parásitos dérmicos (HDMEC) y pulmonar (HPMEC) las células endoteliales, antes y después de cuatro rondas de selección. pesar de que el medio de cultivo para HDMEC y HPMEC difiere ligeramente (ver instrucciones del proveedor), el protocolo utilizado para la selección es idéntico al igual que con HBEC-5i. Las imágenes tomadas con una ampliación de 400X.

Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
DMEM-F12 de Ham	Sigma	D6421	Por medio DMEM completo
L-glutamina 200 mM	GIBCO	25030	Por medio DMEM y RPMI completo
Penicilina / estreptomicina 100X (10.000 unidades / ml y 10mg/ml)	ScienCell	0503	Por medio DMEM completo
Suero bovino fetal inactivado por calor	ScienCell	0025	Por medio DMEM completo
Tripsina-EDTA (0,025% de tripsina, 0,5 mM EDTA)	ScienCell	0103
De las células endoteliales suplemento de crecimiento	ScienCell	1052	Por medio DMEM completo
El cultivo de tejidos tratados 60 mm X 15 mm cajas de Petri	BD	353002
La fibronectina humana	Millipore	FC010	El uso de 2 mg / cm 2
TNF	I +D Systems	210-TA	opcional, el uso de 50 mg / ml
RPMI 1640	Lonza	BE12-167F	Por medio RPMI completo
Gentamicina 50mg/ml	Lonza	17-518Z	Por medio RPMI completo
Hepes 1M	Lonza	Be17-737E	Por medio RPMI completo
HDMEC	ScienCell	2000	La línea celular primaria
HPMEC	ScienCell	3000	La línea celular primaria
HBEC-5i			Se obtiene de Francisco Candal (fcandal@cdc.gov)

Tabla 2. Materiales

Discusión

El sello distintivo de la malaria cerebral es la retención de P. falciparum iRBC dentro del cerebro microvasculatura ^{2, 3.} Sin embargo, en cultivos in vitro de P. falciparum sólo poco a cytoadhere HBEC-5i, un modelo para el endotelio microvascular cerebro humano. Aquí hemos desarrollado un ensayo sencillo para enriquecer a una población de la unión a HBEC-5i, uno más "in-vivo como" fenotipo. Tres de cada 4 P. cepas de P. falciparum se han seleccionado con éxito utilizando este método. Además, HB3 también fue seleccionado en HDMEC y HPMEC, lo que indica que este protocolo se puede utilizar para los parásitos y diversos tipos de células endoteliales.

Diferentes hipótesis pueden explicar la falta de unión con la cepa Dd2. La más probable es que el hecho de que esta línea parásito sin botón, lo que impide la profunda cytoadherence ^{13, 14.}

Se recomienda el cultivo de parásitos seleccionados junto a la selección de proproceso para proporcionar un control de comparación. Esto permitirá, por ejemplo, comparar el transcriptoma de los parásitos vinculantes y no vinculantes, con la esperanza de descubrir los candidatos parásito ligando.

TNF es una citocina encontrado a un alto nivel en los pacientes con paludismo cerebral y ha sido mostrar a inducir la expresión de proteínas de la superficie muchos de HBEC-5i (Claessens et al, en preparación y ^{8, 15, 16).} En este caso, la cantidad de iRBC obligado fue similar en condiciones normales HBEC-5i en comparación con el activo HBEC-5i.

Este "modelo de secuestro", también se puede utilizar para estudiar la interacción molecular entre el iRBC y las células endoteliales, así como el efecto de la supuesta cytoadherence anti-drogas. En este caso, se recomienda placas HBEC-5i en pequeños pozos, tales como la "cámara de diapositivas de 8 pocillos" (BD 354 628) o "CultureWell" (Sigma C7735-20EA).