Capa de hielo: Un método para el cultivo Arabidopsis Y plantas de tomate en las placas de 96 pocillos de alto rendimiento para genotipado

Resumen

El método de capa de hielo permite cultivar plantas en placas de 96 pocillos y no destructiva del tejido de la cosecha de raíz de cada planta. ADN extraído de este tejido de la raíz puede ser utilizado para las reacciones de genotipado. Hemos encontrado que la capa de hielo que funciona bien para Arabidopsis thaliana, Tomate y semillas de arroz.

Resumen

Cada vez es más común para los científicos de plantas para desarrollar proyectos que requieren el genotipado de un gran número de plantas. El primer paso en cualquier proyecto de genotipado es recoger una muestra de tejido de cada planta individual. El enfoque tradicional para esta tarea es una muestra de las plantas-en-un-tiempo. Si se desea cientos genotipo o de miles de personas, sin embargo, con esta estrategia da como resultado un importante cuello de botella en la tubería de genotipado. El método de capa de hielo que se describe aquí, proporciona una solución de alto rendimiento para este reto al permitir que un científico para recoger tejidos de varios miles de plántulas en un solo día ^1,2. Este nivel de rendimiento es posible gracias al hecho de que el tejido se extrae de plantas de 96 a-un-tiempo, en lugar de uno-a-un-tiempo.

El método de capa de hielo ofrece una plataforma integrada para la realización de crecimiento de las plántulas, la cosecha de tejidos, y la extracción de ADN. La base de la capa de hielo es el crecimiento de seedliNGS en un par apilado de placas de 96 pocillos. Los pozos de la placa superior contiene los enchufes de los medios de cultivo de agar en el que las plántulas individuales germinar. Las raíces crecen hacia abajo a través de los medios de agar, la salida de la placa superior a través de un agujero, y pasar a una placa inferior que contiene agua. Para la cosecha de tejidos para la extracción de ADN, el agua en la placa inferior que contiene tejido de la raíz se congela rápidamente, mientras que las plantas de semillero en la placa superior permanecer a temperatura ambiente. La placa superior es entonces despegar de la placa inferior, dando una placa con 96 muestras de raíces de tejido congelado en el hielo y una placa con 96 plantas viables. La técnica es llamada "capa de hielo", ya que utiliza el hielo para capturar el tejido de la raíz. La placa de 96 pocillos que contienen las semillas se puede envueltas en papel y transferida a baja temperatura. Este proceso se suspende un mayor crecimiento de las plántulas, pero no afecta su viabilidad. Una vez que el análisis del genotipo se ha completado, las plantas con el genotipo deseado puede ser transferido de la p-96, asía finales de suelo para la propagación. Hemos demostrado la utilidad del método de capa de hielo con Arabidopsis thaliana, tomate y semillas de arroz. Esperamos que el método debería ser aplicable también a otras especies de plantas con semillas pequeñas como para caber en los pocillos de placas de 96 pocillos.

Protocolo

1. Preparar Hielo-Placas de plántulas con medios de cultivo Agar

Los medios de comunicación fundido de crecimiento (0,5 X Murashige y Skoog (MS) mezcla de sal basal, 2 mM de ácido Morpholinoethanesulfonic (MES), el 0,6% de agar (w / v), pH 5,7) se distribuye en placas de plántulas en autoclave mediante un dispensador de microplacas microrrelleno. Un litro de los medios de comunicación que se necesita por cada 18 placas de las plántulas.

1. Preparar medios de cultivo en un litro botellas de vidrio con tapas de rosca superior y autoclave durante 20 minutos.
2. Autoclave de un litro de agua destilada en una botella de vidrio con tapa de rosca. Al mismo tiempo, también autoclave platos vacíos plántulas envuelto en papel de aluminio.
3. La transferencia de los medios de comunicación en autoclave y el agua a una incubadora a 65 ° C. Esta temperatura se mantendrá el crecimiento de los medios de comunicación en un estado fundido.
4. Después del autoclave, retire las placas de plántulas a partir de papel de aluminio y coloque en campana de flujo laminar que se seque. Las placas deben estar completamente secas antes de proceder a fin de que la cinta de embalaje adhesivo puedesellar completamente los agujeros en el fondo de los pozos de las placas.
5. Limpie el banco del laboratorio, con un 95% de etanol para desinfectar.
6. Remoje claro tapas de plástico para las placas de las plántulas en el 95% de etanol para desinfectar. Retire las tapas de etanol y secar al aire en campana de flujo laminar. No autoclave las tapas de plástico para esterilizarlos, ya que se derriten en la autoclave.
7. Aplique cinta de embalaje de la parte inferior de cada placa de plántulas y con firmeza el sello con la herramienta de rodillos.
8. Coloque las botellas de medio de cultivo líquido y agua esterilizada en un baño de agua regulado a 65 ° C.
9. Coloque una botella que contiene 70% de etanol a temperatura ambiente a la máquina de microrrelleno y ejecutar el ciclo de purga dos veces para desinfectar las tuberías de la máquina de microrrelleno.
10. Coloque la botella con agua estéril a la máquina de microrrelleno. Ejecutar el ciclo de purga seis veces para calentar las tuberías y eliminar el etanol a partir del sistema. La botella de agua debe permanecer en la 65 ° C baño a lo largo de este procedimiento.
11. Después de completar la purga con agua estéril, inmediatamente colocar la botella de medio de cultivo líquido a la máquina de microrrelleno. Ejecutar el ciclo de purga dos veces para limpiar el agua destilada de la tubería. La botella de medio de cultivo debe permanecer en la 65 ° C baño de todo este procedimiento.
12. Prescindir de 450 microlitros de medio de crecimiento en los pocillos de cada placa de las plántulas. Trabaje con rapidez para que los medios de cultivo no se solidifica en las tuberías de la máquina de microrrelleno.
13. Cuando todas las placas de las plántulas se han llenado, inmediatamente colocar la botella de 65 ° C el agua estéril para la máquina de microrrelleno y ejecutar el ciclo de purga 12 veces para limpiar las tuberías. La botella de agua debe permanecer en la 65 ° C baño de todo este procedimiento.
14. Si una máquina microrrelleno no está disponible, placas de plántulas también pueden ser preparados por mano de pipeteo agar fundido en las placas de sellado con una pipeta multicanal.
15. Inspeccionar los pozos de cada t plántulas placaso asegurar que los medios de crecimiento no ha salido de ningún pozo. Mano pipeta adicional medio de crecimiento líquido en los pozos individuales según sea necesario.
16. Cubra cada plato con una tapa de plástico transparente, y permitir que los medios de comunicación para consolidar el crecimiento en las placas de las plántulas a temperatura ambiente. Placas de pila y envolver en papel de aluminio para el almacenamiento a 4 ° C. Placas tienda al revés para evitar la acumulación de agua en los pozos durante el almacenamiento.

2. Siembre las semillas en placas de plántulas capa de hielo y plántulas Germinar

Con anterioridad hemos descrito un método semi-automático para dispensar semillas de Arabidopsis en placas de plántulas utilizando un dispositivo de carga de semillas (2). Aunque este dispositivo puede ser útil para algunos lotes de semilla, hemos encontrado que la variabilidad en el tamaño de la semilla que muestra los diferentes lotes de semillas de Arabidopsis límites de la utilidad general de este dispositivo. Estamos en el proceso de desarrollo de un método alternativo de distribución automatizado de semillas, but en la actualidad hemos encontrado que la estrategia más eficaz para distribuir semillas en las placas de las plántulas es necesario realizar este paso con la mano como se describe a continuación.

1. Espolvorear las semillas secas en papel de filtro Whatman.
2. Prescindir de etanol al 95% en las semillas para que todas las semillas están cubiertas con etanol. Este tratamiento superficial esterilizar las semillas.
3. Permita que las semillas se sequen al aire.
4. La transferencia de semillas individuales en los pocillos de las placas de las plántulas utilizando una versión modificada de vidrio desechables pipeta Pasteur. El extremo de la pipeta Pasteur está sellado por la punta en llamas. La punta de vidrio resultante se humedece por un suave contacto con los medios de agar, que permite una sola semilla para ser fácilmente recogidos y trasladados a la superficie del agar en los pocillos de la placa de las plántulas. Una versión de dos cabezas de esta herramienta de recubrimiento de la semilla también puede ser utilizado para aumentar el rendimiento.
5. Cubra cada plato con una tapa de plántulas de plástico transparente y sellado con cinta quirúrgica microporos. Envuelva las placas apiladascon papel de aluminio y las semillas de Arabidopsis almacenar a 4 ° C durante cuatro días para estratificar las semillas y sincronizar la germinación. Semillas de tomate se debe almacenar en la oscuridad a 12 ° C durante cuatro días.
6. Coloque las placas de las plántulas bajo una luz fluorescente de 18 ° a 20 ° C para iniciar la germinación.

3. Las placas de transferencia de plántulas de fuente de hielo-Cap

Después de las placas de las plántulas han estado bajo la luz durante cuatro días, la transferencia de las placas de las plántulas a la fuente de hielo Cap. De Arabidopsis, las plántulas normalmente se dejan en la fuente de capa de hielo de 10 a 14 días.

1. Montar la fuente de hielo-Cap mediante la colocación de una bandeja de horno en la parte superior de la estructura del rack a medida que se ha colocado dentro de una caja de plástico. Utilice las tuercas de nivelación para ajustar el nivel de la bandeja de horno. Colocar una bomba sumergible en la caja de almacenamiento y conectar la manguera de salida de la bomba al lado de la bandeja de horno con un resorte clamp. Montar la fuente de hielo-Cap en un estante en el cuarto de crecimiento de las plantas o cámara de crecimiento a fin de que la superficie de la fuente de hielo-Cap recibe iluminación fluorescente directa.
2. Llene la fuente de hielo-Cap con una mezcla de 3 partes de agua destilada a una parte de agua del grifo. El agua debe ser añadido a la fuente hasta que la bomba sumergible está varios centímetros por debajo del nivel del agua. Marque el nivel final del agua en la caja de plástico con cinta de laboratorio y un marcador.
3. Preparar las placas de raíz mediante la adición de una pelota de 3/32-inch diámetro de acero inoxidable a cada pocillo de una placa de raíz.
4. Las bolas de acero inoxidable se pueden añadir a los platos de raíz con un encargo a ^un dispositivo dispensador de bolas. Este dispositivo se realiza mediante la colocación de una sola hoja de papel de aluminio sobre la superficie de una placa de 96 pocillos PCR y el uso de un marcador para marcar la ubicación de los centros de cada bien en la superficie de la lámina. Esta hoja de papel de marca se coloca en la parte superior de un adicional de 6 hojas de papel de aluminio parail y envuelto alrededor de la superficie lisa de una tapa de una caja de punta de la pipeta utilizada. Un instrumento afilado, como un pincho de madera se utiliza para crear una chuleta con capacidad suficiente para una sola bola de metal en cada una de las 96 posiciones. Para llenar este dispositivo dispensador de bolas, un exceso de bolas de metal se vierte sobre el dispositivo y se agita suavemente para eliminar el exceso de balones. El disco de la raíz se coloca sobre la parte superior del dispositivo de distribución, que se volcó a la caída de una bola en cada pocillo de la placa de la raíz.
5. Añadir 340 microlitros de una mezcla de 3 partes de agua destilada a una parte de agua del grifo a cada pocillo de la placa de la raíz usando la máquina de microrrelleno. Asegúrese de que las bolas de acero se han añadido a las placas de raíz antes de dispensar el agua.
6. Pelar la película adhesiva de la parte inferior de las placas de las plántulas y retirar las tapas de plástico transparente de las placas. Coloque cada placa de plántulas en un disco de la raíz que contiene una bola de metal y el agua y asegurar los dos platos juntos con dos hai elásticar bandas.
7. Coloque la capa de hielo apilados placas en la fuente de hielo-Cap. Las tapas de plástico transparente no se debe utilizar cuando las placas se encuentran en la fuente de hielo-Cap. Asegúrese de que el bien A-01 de la placa de las plántulas se alinea con la A-01 y del disco de la raíz.
8. El apilado de plántulas / Platos de raíz se deben dejar en la fuente de hielo-Cap hasta que la mayoría de las plántulas han tejido de la raíz que ha penetrado en las placas de la raíz. La temperatura de crecimiento ideal para plantas de Arabidopsis en la fuente de hielo-Cap es ca. 18 ° C. El nivel del agua en la bandeja de horno debe ser tal que el agua pueda fluir en los pocillos de las placas de la raíz, pero no tan profundo que las plantas de semillero en la placa de las plántulas son sumergidas. Si el nivel del agua no es correcto que usted tendrá que conseguir una bandeja de horno diferentes de la profundidad correcta.
9. Agregue el agua destilada periódicamente a la fuente de hielo-Cap para mantener el nivel de agua original. Mediante la adición de agua pura destilada a la fuente que sustituirá a lalíquido perdido debido a la evaporación, sin cambiar la composición mineral del agua en la fuente. El nivel del agua deberá ser comprobado diariamente en la fuente de hielo-Cap.

4. Cosecha de tejido de la raíz

Tejido de la raíz es cosechado por la congelación del agua en el disco de la raíz y el pelado de la placa de plántulas fuera del disco de la raíz.

1. El día antes de la cosecha tejido de la raíz, eliminar la capa de hielo apilados Placas de la Fuente de Hielo, Cap.
2. Inserte tres pinchos de madera entre los pozos de las plántulas y las placas apiladas raíz. El propósito de los pinchos es elevar las puntas de las placas de las plántulas de los pozos de las placas de la raíz en la preparación para el proceso de congelación.
3. Permita que la capa de hielo apilados-Placas con pinchos de madera insertado en reposo durante una noche bajo las luces. Esta incubación permite la evaporación del líquido ligero en las placas de la raíz, lo que facilita la posterior congelación y los procesos de placa de separación.
4. Enel día de la cosecha de tejidos, prepare un baño de congelación. Coloque un bloque de metal de 96 pozos termales en un plato de pyrex con una mezcla de hielo seco y etanol al 95%. Deje que el bloque térmico para equilibrar la temperatura de aprox. 20 minutos. Coloque el plato de Pyrex en la parte superior de algún tipo de material aislante, como un autoclave manopla para que la temperatura baja no dañar la superficie de la mesa del laboratorio.
5. Coloque la capa de hielo apilados placas con los pinchos de madera en el bloque de enfriado térmica e incubar durante 5 minutos. Durante este tiempo el agua en el disco de la raíz se congelan. Las plantas de semillero en la placa de las plántulas no se congelan durante el tratamiento y siguen siendo plenamente viable.
6. Retire la capa de hielo apilados placas del bloque térmico y colocarlos en la mesa del laboratorio a temperatura ambiente. Quitar las bandas elásticas y los pinchos de madera de las placas apiladas. Presione firmemente hacia abajo en la parte superior de la placa de las plántulas de "crack" de las placas. A continuación, pelar cuidadosamente el disco de la raíz y la placa de las plántulas aparte.
7. Deje que el agua en las placas de la raíz que se descongele a temperatura ambiente. Descongelación se puede acelerar mediante la incubación de las placas de la raíz en un bloque térmico a 25 º C.

5. Tienda Plate plántulas a baja temperatura en la oscuridad

Después de la cosecha de tejidos, las placas de las plántulas se pueden almacenar en la oscuridad a temperatura baja que permita mantener la viabilidad de las plántulas, mientras que el análisis del genotipo se lleva a cabo. Las plántulas se pueden almacenar a esas temperaturas durante varias semanas sin afectar la viabilidad.

1. Después de la cosecha de tejidos, sellar la parte inferior de la placa de plántulas con cinta adhesiva.
2. Colocar una tapa de plástico transparente en la parte superior de la placa de las plántulas y seguro con cinta microporosa.
3. Pila de placas de varias plántulas juntas y envolver en papel de aluminio.
4. Para las plántulas de Arabidopsis, colocar las placas a 4 ° C. De las plántulas de tomate, colocar las placas a 12 ° C. Una vez que la genotipificación se haya completado, la SEedlings puede ser removido de la incubación a baja temperatura y se trasplantan a la tierra como se describe a continuación.

6. Extracción de ADN

ADN adecuado para las reacciones de PCR puede ser fácilmente extraído de las muestras de tejido de la raíz. El rendimiento del total de ADN recuperado de muestras de raíces de Arabidopsis tejido es ca. 400 ng de media ^2.

1. Asegúrese de que el agua en las placas de la raíz se ha descongelado completamente antes de realizar el procedimiento de extracción de ADN. Inspeccione las placas para determinar si hay pozos de agua sustancialmente menor que el promedio. Pipeta de la mano de agua destilada en los pozos que requieren más agua.
2. Use la máquina microrrelleno añadir 25 microlitros de una solución de Tris-EDTA (500 mM Tris, pH 8, 50 mM EDTA, pH 8) a cada pocillo de las placas de la raíz.
3. Sellado de los pozos de las placas de raíz utilizando una lámina de sellado térmico y una máquina de termosellado.
4. Coloque las placas raíz sellado en la máquina con la GenoGrinderextremo sellado de las placas hacia abajo. Esta orientación de la placa proporciona un movimiento de cuentas óptimo y evita que los granos se peguen en los pozos. Agitan las placas en el GenoGrinder durante 3 minutos y medio a 1350 golpes por minuto.
5. La transferencia de las placas a una centrifugadora con los operadores de microplacas y girar las placas durante 10 minutos a 3500 rpm a 4 ° C para sedimentar el tejido de la raíz pulverizada.
6. El extracto resultante diluida contiene el ADN genómico que puede ser utilizado directamente en las reacciones de PCR. Por lo general uno se agregue 2 microlitros de esta extracción de ADN a una reacción de PCR.
7. Para el almacenamiento de muestras de ADN, el sello de la microplaca con cinta adhesiva de embalaje y el lugar a menos 20 ° C. Muestras de ADN se pueden almacenar por varios meses sin aparente reducción en la calidad.

7. Transferencia de plántulas con genotipo deseado en el suelo

Una vez que el análisis del genotipo se ha completado, las plantas con el genotipo deseado puede ser transferido de la BiodiversidadPlacas en el suelo.

1. Retire las placas de las plántulas de una cámara frigorífica y preparar macetas con mezcla de suelo saturado de agua.
2. Para eliminar un semillero individuales de la placa de las plántulas, el uso de una pinza que le permite a uno tomar el tapón de agar sin aplastar la plántula. Coge el tapón de agar con la pinza y deslice suavemente el tapón de agar de la placa de las plántulas con cuidado de no dañar las plántulas. Por otra parte, aire a presión se puede utilizar para disparar con cuidado el tapón de agar y plántulas fuera del pozo. Aplicar presión en el pequeño agujero en el fondo del pozo hasta que el tapón sale a la mesa del laboratorio.
3. Prepare un pequeño agujero en el suelo del tamaño del tapón de agar. Coloque el tapón de agar en el suelo y el paquete de la tierra húmeda alrededor del tapón de agar para asegurar la plántula en el suelo. No trate de eliminar cualquiera de los agar de todo el semillero.
4. Coloque las plántulas trasplantadas en una sala de crecimiento bajo condiciones de crecimiento estándar. Cubra la cacerola con una tapa de plástico para ellos dos primeros días después del trasplante. Posteriormente retire la tapa y continuar creciendo las plantas con condiciones estándar.

8. Los resultados representativos:

Un ejemplo de las plántulas de Arabidopsis crecido utilizando el sistema hielo-Cap se muestra en la Figura 4. Estas plántulas había estado en la Fuente de hielo-Cap de dos semanas, cuando se tomó la foto y estaban listos para la cosecha de tejidos. Tejido de la raíz de estas plántulas mismo se muestra en la Figura 4B. La cantidad total de ADN extraído de una muestra de tejido de la raíz de Arabidopsis es típicamente en el rango de 100 ng a 700 ng ^2. Este cálculo del rendimiento se basa en el uso de sólo una parte del extracto de raíz de crudo. Debido a que sólo ca. El 10% del extracto de raíz de crudo se suele utilizar para el proceso de extracción de ADN, es posible obtener ADN genómico mucho más para el análisis de aguas abajo mediante la retención de más del extracto crudo. La cantidad total de ADN genómico obtenido utilizando el hieloCap procedimiento es suficiente para llevar a cabo cientos de reacciones de PCR ^2.

Figura 1: Diagrama de flujo del proceso de capa de hielo. A) Cruzamiento placa que contiene medio de agar de crecimiento en el cual las plántulas germinan. Las raíces penetran el agar y crecer hacia el fondo de la placa. Agujeros en el fondo de los pozos de la placa son sellados con cinta adhesiva. B) La placa de las plántulas se coloca encima de un disco de la raíz que contiene el agua y una bola de metal. Las raíces de la salida de los agujeros en el fondo de los pozos de la placa de las plántulas y crecer en los pocillos de la placa de la raíz. C) Pinchos de madera que se colocan entre la placa de las plántulas y el disco de la raíz el día antes de las placas de hielo apilados Cap se colocan en un bloque térmico en hielo seco / etanol baño. D) Una vez que el agua en el disco de la raíz se ha congelado, la placa de las plántulas se despega de la placa de la raíz, produciendo un disco de la raíz con 96 muestras de tejidoy una planta de semillero Plate con 96 plantas viables. Los pinchos de madera facilitan la separación de las dos placas durante este paso.

Figura 2: Las fotografías de una placa de plántulas y un disco de la raíz. A) Un plantón de placas y un disco de la raíz visto por separado. B) una placa de plántulas apilados en la parte superior de un disco de la raíz. Las bolas de acero utilizadas para la extracción de ADN se puede ver en los pocillos de la placa de la raíz. Bandas elásticas se utilizan para asegurar los dos platos.

Figura 3: La fuente de la capa de hielo. La fuente de la capa de hielo se utiliza para mantener un nivel constante de agua a la altura precisa de las tapas de los pozos de las placas de la raíz. Este sistema de riego continuo garantiza que el agua de los pozos de las placas de raíz no se agotan debido a la evaporación o transpiración. A) Una casa hecha de rackque apoya la bandeja de horno en el que la capa de hielo apilados Placas sentarse. B) Una vista de cerca de uno de los 1 "tuercas que proporciona un medio para ajustar con precisión el nivel de la bandeja de horno, para que una profundidad uniforme de agua se logra a través de la superficie de la fuente. C) Esta imagen muestra todos los las piezas necesarias para construir el casero de rack para una fuente de hielo-Cap. D) La asamblea de hielo Cap Fuente. Una bomba sumergible de la fuente se mueve constantemente el agua del depósito inferior de la bandeja de horno, que se apoya en la parte superior de la hecha en casa rack. Una pinza de resorte se utiliza para conectar la manguera al borde de la bandeja para hornear galletas.

Figura 4: plántulas de Arabidopsis crecido utilizando el proceso de capa de hielo. A) Vista desde arriba mirando hacia abajo en dos pocillos de una placa de plántulas. Cada pozo tiene una plántula de Arabidopsis. B) Vista lateral de dos pozos de una placa de raíz. Las raíces pueden verse torsiónalrededor de la superficie interior de los pozos. Las plantas de semillero en este cuadro había sido en la fuente de hielo-Cap de ca. dos semanas y se encuentran en la etapa de crecimiento donde la recolección de tejido que normalmente se realiza.

Discusión

El método de capa de hielo que aquí se presenta permite a un científico para recoger muestras de tejidos de cientos o incluso miles de plantas individuales en un solo día y eficiente extracción de ADN genómico de las muestras para su uso en reacciones de genotipado. Al dar un científico de la capacidad de determinar el genotipo de miles de plántulas en un período corto de tiempo, el método de capa de hielo tiene el potencial de facilitar una serie de experimentos genéticos que de otro modo no sería práctico para llevar a cabo. Varios ejemplos se proporcionan a continuación.

1. Mapeo genético. A escala fina elaboración de mapas genéticos se puede acelerar si el investigador es capaz de identificar los eventos de recombinación dentro de un intervalo específico a lo largo del cromosoma ^3. Si este intervalo implica una distancia genética muy corto, entonces los eventos de recombinación será relativamente poco frecuente en la población de mapeo segregar. Por esta razón, puede ser necesario a miles de pantalla de las plantas individuales para encontrar el re deseadocombinant personas. Este proceso puede ser acelerado en gran medida a través del uso de la capa de hielo. Incluso en la era del genoma de toda la re-secuenciación, todavía es necesario demostrar directamente que una mutación es directamente responsable de un fenotipo de interés. En estos casos, será necesario separar la mutación de interés lejos de otras mutaciones estrechamente vinculada con el fin de demostrar una mutación candidato es realmente causal. En estas situaciones, capa de hielo podría proporcionar un método eficaz para romper la vinculación entre un par de mutaciones estrechamente vinculados.
2. Multi-mutantes. Se ha vuelto común para los investigadores que estudian la Arabidopsis para combinar los alelos mutantes de varios loci distintos en una sola persona con el fin de superar la redundancia funcional ^4-6. Como ejemplo, considere un caso en el que se desea combinar los alelos mutantes de cuatro lugares diferentes en una sola planta a través del cruce genético. Para este proyecto, será necesario generar unn individuo que es heterocigoto en estos cuatro lugares, como parte del programa de cruce. Cuando esta semilla cuádruple heterocigoto conjuntos, el homocigoto cuádruple se espera que estén presentes en una proporción de uno de cada 256 en la población resultantes de la progenie. La detección de esta persona rara por los métodos tradicionales sería muy laborioso. En comparación, el uso de hielo-Cap para este proyecto proporcionaría el científico con una estrategia eficiente para la identificación de los homocigotos cuádruple raro en una sola generación.
3. iTILLING. Nuestro laboratorio ha descrito recientemente un nuevo enfoque para la detección de la presencia de mutaciones inducidas en los genes de interés en Arabidopsis ^7. Este método es una variación de una técnica establecida llamada labranza que se utiliza para encontrar mutaciones en las poblaciones ordenada de los individuos tratados con un mutágeno químico ^80-10. Hemos llamado a nuestro método iTILLING porque es una versión individualizada de labranza que permite una individual científico para lograr algo que tradicionalmente ha requerido un equipo de investigación grande para completar. Capa de hielo que forma parte integrante del método iTILLING ^7, tal como se describe a continuación.

La idea detrás de iTILLING es para producir una población efímera mutante, lo que contrasta con la población mutante resistente creado para los proyectos tradicionales de labranza. Para iTILLING, las semillas de una población M2 granel se siembran en 50 de 100 bloques de hielo Cap, y se extrae el ADN utilizando el método de capa de hielo. Plántulas de Arabidopsis se colocan a 4 ° C, mientras que la detección de mutaciones se realizó mediante el ADN capa de hielo preparaciones. Plántulas de tomate se almacenan a 12 ° C.. Una vez que las plántulas portadoras de mutaciones deseadas han sido identificados, que se recuperan de las placas de capa de hielo-y trasladados a tierra. iTILLING no está destinada a proporcionar a una población mutante de larga duración para una comunidad de investigación a la pantalla. En cambio, iTILLING proporciona una estrategia mediante la cualuno de los científicos pueden detectar una población de encargo mutante para las mutaciones en un puñado de genes rápida, eficiente ya un costo relativamente bajo.

Hemos encontrado capa de hielo de ser un método eficaz para el crecimiento y el genotipo de Arabidopsis, tomate y arroz. Esperamos que otras especies de plantas también deben ser susceptibles de capa de hielo. Una limitación en la variedad de especies que pueden ser atendidas por capa de hielo del tamaño de las semillas. Sólo las plantas con semillas pequeñas como para caber en los pocillos de una placa de 96 y será compatible con la capa de hielo en su configuración actual.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios (opcional)
GenoGrinder	Spex / CertiPrep, Metuchen, Nueva Jersey	2000 Geno / Grinder	Máquina para sacudir las placas de raíz para la extracción de ADN
ABgene Thermo-Sellador	ABgene EE.UU.	AB-0384	Manual de sellado al calor de la máquina utilizada para las placas de raíz antes de la ruptura del tejido
Centrífuga equipada con soportes de microplacas balanceo	Beckman Coulter	Allegra 25R	Cualquier centrífuga con soportes de microplacas balanceo sería adecuado
Microrrelleno microplacas Dispensador	BioTek www.biotek.com	AF1000A	Dispensador de líquido automatizado para microplacas de relleno
Bialetti marca17x11 cm Hoja comercial para galletas	Objetivo de los grandes almacenes	www.bialetti.com	Esta hoja de cookie en cuestión tiene la profundidad ideal para la capa de hielo
Por encargo del estante de metal	Hardware Store		Véase el texto para una descripción completa
33 litros de plástico caja de almacenamiento	Objetivo de los grandes almacenes	Sterilite Marca	Para fuente de hielo-Cap. Caja de plástico suficientemente grande para contener la hoja de 17x11 pulgadas galletas
30 galones por hora bomba de la fuente	Sunterra	104506	Pequeña bomba sumergible fuente disponible en las tiendas de jardinería
Manguera para bomba de la fuente	Cualquier empresa de suministro de laboratorio		Manguera compatible con la bomba de la fuente
Abrazadera de plástico	Hardware Store		Pinza para sostener la manguera para galletashoja
Claro tapas de plástico de fondo Falcon Microtest plana placas de 96 pocillos de poliestireno	BD Falcon www.bdbiosciences.com	351172	Claro tapas de plástico para cubrir Hielo-Placas de plántulas
3M microporos cinta quirúrgica	Fisher Scientific	19-027-761
3/32-inch bolas de diámetro de acero inoxidable	Hartford Technologies, Rocky Hill, CT	034 a 006-1K	Se utiliza para interrumpir el tejido de la raíz después de la cosecha
3 bandas elásticas pulgadas del cabello	Tienda de comestibles		Se utiliza para fijar disco de la raíz de plántulas Plate
4 pinchos de madera diámetro mm	Tienda de comestibles		Estas brochetas se utilizan normalmente para preparar brochetas
Fisher Scientific Nunc marca de 1 ml, sin placas de filtro frita	Fisher Scientific	278012	Placas de 96 pocillos de plántulas con agujeros en el fondo.
Fisherbrand 96-Bueno Tall-Chimenea PCR Plate	Fisher Scientific	14-230-242	Placas de 96 pocillos de raíz
Agar - cultivo de células de prueba	Sigma-Aldrich	A1296
4-Morpholinoethanesulfonic ácido (MES)	Sigma-Aldrich	M2933
Murashige y Skoog (MS) mezcla de sal basal	Sigma-Aldrich	M-5524
Easy Peel calor de sellado de aluminio	ABgene EE.UU.	AB-0745	El calor la lámina de sellado para el sellado de las placas de raíz antes de la ruptura del tejido
Marca de pato extra de cinta de embalaje ancho, 3.00 "x 54.6 m	OfficeMax www.officemax.com	Artículo no. 21242139	Cinta adhesivapara microplacas de sellado que contiene extractos de ADN para el almacenamiento
Sellado de rodillos	Bio-Rad	MSR-0001	Herramienta de mano móvil para presionar precinto adhesivo en microplacas
De 96 pozos térmicos de metales bloque	Cole-Parmer	36400-66	Se utiliza para congelar las placas de la raíz para la cosecha del tejido
Papel de filtro Whatman	Whatman International	1002 090	Se utiliza para esterilizar la superficie de las semillas
Desechables con una pipeta Pasteur	Fisher Scientific	13 a 678-6A	5 ¾ "desechables pipeta Pasteur utilizados para la transferencia de semillas a las plántulas Plate
Pyrex plato para hornear (20 cm x 30 cm)	Objetivo de los grandes almacenes		Se utiliza para construir un hielo seco / etanol baño.