El análisis de la migración de células troncales neurales Crest utilizando una versión modificada del ensayo Zigmond Cámara

Resumen

Un enfoque para analizar la migración de las células explantados (células troncales de la cresta neural) se describe. Este método es barato, amable y capaz de distinguir la quimiotaxis de los dos quimiocinesis y otras influencias en la polaridad migratorias, como las derivadas de las interacciones célula-célula en el tronco principal cultivo de células neuronales de la cresta.

Resumen

Las células de la cresta neural (CCN) son una población transitoria de células presentes en el desarrollo de vertebrados que emigrar del tubo neural dorsal (NT) tras someterse a un ^1,2 transición epitelio-mesenquimal. Después de la EMT, los países contribuyentes netos migrar grandes distancias a lo largo de las vías estereotipados hasta alcanzar sus objetivos. NCC diferenciarse en una amplia gama de tipos de células incluyendo neuronas, células gliales, los melanocitos, células cromafines y ^1-3. La capacidad de los países contribuyentes netos para alcanzar y reconocer a sus lugares de destino adecuado es fundamental para la formación adecuada de todas las estructuras que contienen tronco NCC componentes derivados ^3. Elucidar los mecanismos de orientación para el tronco NCC migración ha sido por lo tanto, una cuestión de gran importancia. Numerosas moléculas se ha demostrado que guía la migración NCC ^4. Por ejemplo, los países contribuyentes netos tronco se sabe que son repelidos por las señales negativas como la orientación semaforina, efrina, y ligandos de hendidura ^5-8. Sin embargo, nohasta hace poco cualquier quimiotácticos de los países contribuyentes netos tronco se han identificado ^9.

Convencionales métodos in vitro para estudiar el comportamiento quimiotáctico de células adherentes mejor trabajar con inmortalizado, las células homogéneamente distribuidos, pero son más difíciles de aplicar a ciertos cultivos primarios de células madre que inicialmente carecen de una distribución homogénea y diferenciar rápidamente (por ejemplo, los países contribuyentes netos). Un enfoque para homogeneizar la distribución de los países contribuyentes netos del tronco de los estudios de quimiotaxis es aislar a los países contribuyentes netos tronco de cultivos primarios de explantes NT, a continuación, levante y replate a ser casi el 100% confluente. Sin embargo, este enfoque requiere de placas grandes cantidades de tiempo y esfuerzo para explante número suficiente de células, es duro, y distribuye los países contribuyentes netos del tronco de una manera diferente a la que se encuentra en condiciones in vivo.

Aquí, se presenta un enfoque in vitro que es capaz de evaluar la quimiotaxis y otras respuestas migratorias de los países contribuyentes netos tronco sin requiringa la distribución de células homogéneas. Esta técnica utiliza imágenes a intervalos de tiempo de la primaria, imperturbable NCC tronco dentro de una cámara modificada Zigmond (una cámara estándar de Zigmond se describe en otro ^10). Mediante la exposición de los países contribuyentes netos del tronco en la periferia de la cultura a un gradiente de chemotactant que es perpendicular a su direccionalidad predijo naturales, las alteraciones en la polaridad migratorios inducidos por el gradiente de chemotactant aplicada puede ser detectado. Esta técnica es de bajo costo, requiere el cultivo de sólo dos explantes por tratamiento NT replicar, evita la elevación de células duras (por ejemplo, tripsina), las hojas de los países contribuyentes netos tronco en una distribución más similar a las condiciones in vivo, reduce la cantidad de tiempo que transcurre entre la explantación y la experimentación (lo que probablemente reduce el riesgo de diferenciación), y permite lapso de tiempo la evaluación de numerosas características migratorias.

Protocolo

1. Día 1: El aislamiento de los tubos neurales del tronco de la cultura durante la noche en cubreobjetos

1. Huevos se incuban chica de 56 horas a 38 ° C. Retire los huevos de incubación, rociar ligeramente con el 70% de etanol, y luego dejar que se sequen. Rompa los huevos se abren en una bandeja de vidrio UV-esterilizados.
2. Extracto de cada embrión de su yema y colocarlo en chica de Ringer. Para ello, el primer corte en torno a las islas de sangre con tijeras curvas, y luego, con una pinza roma, elegir el embrión por la membrana extraembrionarias y colocarlo en una placa de Petri estéril de plástico que contiene la solución de Ringer chica.
3. Aislar el tronco de cada embrión por el recorte el exceso de membranas extraembrionarias, así como los niveles axial del cráneo, vagal, y sacra usando una aguja de tungsteno (Fig. 1). Primero, seleccione un 9 embriones que se encuentran entre las etapas HH15-17 ^11. Para los estadios HH15 y superiores, los ejes del cerebro anterior y posterior del cerebro forman un ángulo agudo y por lo tanto, la cabeza parece inclinación caudal. EnHH17 etapa, la yema de cola está presente y se inclina ventral, pero no contiene todavía somitas. Con una aguja de tungsteno, recorte membranas extraembrionarias a alrededor de 2 mm a partir del embrión y corte los tejidos embrionarios anteriores a somite 10. También eliminar todos los tejidos embrionarios caudal de partida de todo el somite quinto más reciente formación.
4. Coloque los troncos aislados de embriones en Dispasa (0,24 U / ml DMEM) y se incuba durante 1 hora a 15 minutos a 37 ° C y 5% CO _2. Una vez que los troncos de comenzar la incubación, empiece a preparar 6 cubreobjetos (CS) para el cultivo de explantes de NT (medidas 1.5 a 1.8).
5. Enjuague 6 CS en el 70% de etanol (diluido en agua destilada, ultrapura), y luego dejar que se sequen. Con un marcador de laboratorio, dibujar un círculo en el centro de cada CS, que es de aproximadamente 1 cm de diámetro (el círculo más adelante le ayudará a identificar en una capa de fibronectina se ha aplicado). En la misma cara de cada CS, escriba la palabra "ser" (o alguna otra palabra o forma asimétrica) fuera del círculo dibujado (esto ayudará you identificar si la cara marcada de la CS es hacia arriba o hacia abajo).
6. Coloque cada CS en un aparte 40 x 10 mm plato estéril con la superficie marcada hacia abajo y permitir que el plato que se siente libre debajo de una lámpara germicida UV durante 10 minutos.
7. Aplicar 60 l fibronectina (FN, 10 mg / ml DMEM) a la superficie sin marcas de la CS, mientras que asegurarse de que toda el área dentro del círculo de 1 cm está recubierto. Coloque los platos a incubar a 37 ° C durante 30 minutos y luego, con cuidado aspirar el fibronectina de cada CS.
8. Añadir 250 l "cultura" medio [DMEM con L-glutamina (2 mM), penicilina (100U/ml), estreptomicina (100 mcg / ml), y el 8% de suero fetal bovino (FBS)] a la zona de FN-revestido de el CS. Colocar las cápsulas que contienen cada uno de CS a 37 ° C y 5% de CO ₂ hasta que el NT han sido aislados.
9. La transferencia de todos los troncos de embriones se incuban a un plato de 5 cm de vidrio de Petri con medio L15 y comenzar la disección de cada NT usando unas pinzas finas y una aguja de tungsteno (Fig. 1). Carefully corte a lo largo de la frontera de la NT y somitas con una aguja de tungsteno afilada ser prudentes para no dañar el NT. A menudo es más fácil para empezar a aislar cada NT desde el extremo caudal, la mayor parte de la cajuela.
10. Seleccione 6 de la recta más larga y NT a la cultura durante la noche (NT entre unos 8 y 15 somitas largas se recomienda). Con una punta de micropipeta preparadas con medio de cultivo, la transferencia de cada uno de los seis NT a su propio preparado previamente CS (1.5 a través de los pasos 1,8). Asegúrese de que el NT no se quede flotando en la superficie. Si el NT es flotante, por goteo en medio de ella hasta que se hunda con micropipeta.
11. Lugar de cada plato a 37 º C CO ₂ y el 5% durante la noche. Preste atención a cada uno de NT se encuentra dentro del área de FN-revestido de sus respectivos CS inmediatamente antes de colocar el plato en la incubadora (utilizando el círculo dibujado en el paso 1.5 como referencia). Una micropipeta se puede utilizar para ajustar mejor la posición de cada NT si es necesario.
12. A cabo enpor lo menos 2 ml de medio de cultivo (sin suero) en un tubo de centrífuga estéril 15 ml y se incuba durante la noche a 37 ° C y 5% CO _2. Deje la tapa ligeramente desenrosca para permitir que el pH del medio para ajustar la noche a la mañana. Pre-incubación medio es importante para ayudar a prevenir la formación de burbujas en la cámara, que puede interrumpir la creación de un gradiente molecular. Como "preincubaron" medio se debe utilizar en todos los pasos futuros. Cuando no se utilizan, este medio debe estar incubando a 37 ° C.

2. Día 2: Carga de la cámara modificada Zigmond y time-lapse análisis de la migración celular

1. De los 6 NT cultivadas, seleccione las 3 culturas más adecuado para el análisis. En general, las culturas NCC que tienen al menos uno de los bordes largos, rectos deben ser seleccionados (Fig. 2A). Los 3 mejores cultivos se utiliza para cargar y modificar película en 3 cámaras Zigmond lo largo del día, cada uno con un tratamiento diferente. De las tres culturas, elija uno de Loading de la primera cámara y volver a los otros a la incubadora para su uso posterior.
2. El uso de un hisopo de algodón, aplique una capa fina y uniforme de vaselina alrededor de los embalses y el puente de una cámara modificada Zigmond.
3. Con una aguja de tungsteno, retire suavemente el Nuevo Testamento de la CS, dejando alrededor de los NCC adheridos a la superficie de la CS. Marcar el plato con un lápiz para recordar la orientación de la recta borde de la cultura NCC.
4. Ponga unas gotas de medio de incuba en el puente. Levante el CS con unas pinzas finas, aplique el borde del CS contra una Kimwipe para eliminar la mayor parte del medio de cultivo de edad, e inmediatamente después colocar el CS de la cámara modificada Zigmond lo que la regla de la cultura para ser filmado se centra en la longitud del puente y casi perpendicular al puente fronterizo con depósito (Fig. 2A, B).
5. Utilizando un microscopio invertido, mover la recta frontera NCC a estar en el lado del puente más cercano a thdepósito electrónico que contendrá los chemotactant sospecha (Fig. 2B, para los controles de esto corresponderá a cualquier depósito está cargado segundo). Además, con más precisión alinear el borde recto de la cultura a ser perpendicular al puente fronterizo con depósito.
6. Con cuidado, pero firmemente presione el CS en la jalea de petróleo presentes en la cámara Zigmond, asegurándose de que está completamente sellado a la cámara, y luego coloque adicionales vaselina en el borde de la CS para garantizar aún más que será hermético. Un ajuste preciso del ángulo de la frontera NCC de nuevo para corregir cualquier movimiento durante el proceso de sellado.
7. Cargar el depósito que no contienen la sospecha chemotactant primero (Fig. 2B). Hacerlo mediante la carga de una jeringa de 1 ml (25 G x 1,5 pulgadas aguja), con cerca de 300 l medio preincubados y se inyecta el medio en el depósito hasta que se llena (teniendo cuidado de no generar burbujas en el depósito). Conecte el depósito por ambos lados con un suficient cantidad de vaselina antes de cargar el depósito de al lado.
8. Repita el paso 2.7, pero esta vez utilizando un medio que contiene el preincubaron chemotactant candidato. Es de suma importancia cuando se genera un gradiente molecular a través de la cultura a la carga siempre el depósito que contiene la molécula a ensayar después de cargar el depósito que carecen de la molécula de la prueba.
9. Coloque la cámara de carga Zigmond a 37 ° C y se incuba durante 1 h antes de la filmación. La imagen de la recta frontera de la cultura NCC durante 3 horas a 90 s, mientras que los intervalos de incubación de aproximadamente 37 ° C (Fig. 2A, B). Antes de crear cualquier película, asegúrese de alinear la cámara de modo que el borde de las imágenes que se obtengan y se alinean con tocar el borde del puente que bordea el embalse de última carga (Fig. 2B, panel superior, cuadro de líneas discontinuas representan ideales posición para la imagen). Esto facilitará el análisis posterior de software mediante la estandarización de la direccionalidad de la pendiente molecular aplicada y thdistancia e del depósito filmado en cada película producida.
10. Para los controles, repita los pasos del 2,2-2,9 por cada uno de los otros dos culturas NCC seleccionado (en el paso 2.1), pero llenar cada tanque con un medio apropiado. Para un tipo de control de llenado ambos depósitos con el medio preincubados no contiene la molécula para ser probado. Para un tratamiento de control en segundo lugar, el puente principal con unas gotas de medio preincubaron que contiene el chemotactant sospechosos antes de montar el CS. Entonces, la carga de los depósitos con el mismo medio que contiene el chemotactant sospecha.
11. Utilice ImageJ (NIH) de seguimiento manual (rsb.info.nih.gov / ij / plugins / pista / track.html) y la quimiotaxis y migración v1.01 (www.ibidi.de / aplicaciones / ap_chemo.html) plugins para realizar un seguimiento la migración de los países contribuyentes netos periféricos a lo largo de la frontera hacia la cultura de la just imágenes y analizar diversos parámetros de las trayectorias migratorias obtenidos (Fig. 2B-C).

3. Los resultados representativos:

Una muestra de la trayectoria de células a partir de una película en la que los países contribuyentes netos muchos tronco fueron sensibles a un quimioatrayente candidato usando la técnica anterior se muestra (Fig. 2D). La mayoría de las células en este ejemplo de una respuesta positiva muestra un movimiento neto el gradiente quimiotáctico (como se muestra en rojo). Datos de trayectoria puede ser utilizada para analizar otras propiedades de la migración celular, así.

Con el fin de evaluar visualmente un gradiente aplicado en cámara modificada Zigmond, un Alexa Fluor 488 IgM conjugado (MW ~ 900 kDa) fue cargado en el segundo depósito de una cámara modificada Zigmond (aproximadamente 40 mg / ml de H ₂ O). Un gradiente fue establecido por una hora y todavía un poco la actualidad, después de 26 h, pero muy disminuido en un 50 h (Fig. 3). Si la molécula a la prueba es menor, entonces la aplicación del gradiente will degradan más rápidamente que lo que se muestra.

Figura 1. Explantación de NT nivel del tronco, para el cultivo durante la noche en cubreobjetos recubiertos de fibronectina. Debido a que el tronco delaminate NCC de la dorsal NT ubicado junto a somitas 8-28, este segmento de la NT está aislada por microdisección y se cultivan durante la noche en un CS recubiertos de fibronectina para permitir la emigración de los países contribuyentes netos de la explante NT. NT aislados que se encuentran entre 8-15 somitas largas y rectas relativamente son las más adecuadas para el cultivo durante la noche, ya que tienden a producir cultivos de NCC con más fronteras recta. Regiones del tubo neural que dan origen a otros niveles de la cresta neural axial se muestran en una fuente más pequeña. s, somite.

Figura 2. Método para evaluar la migración de los países contribuyentes netos tronco explantadosutilizando una cámara modificada Zigmond. (A) alargado tronco culturas NCC se preparan mediante el cultivo de una noche de NT y culturas resultante NCC con al menos una frontera larga y recta son seleccionados para la experimentación. La frontera más larga recta de una cultura seleccionado se coloca perpendicular a la frontera-puente embalse, y por lo tanto, paralelo al vector del gradiente de futuro aplicada. (B) Después de ajustar con el ajuste de la posición de la cultura de NCC en la cámara Zigmond y sellado el cubreobjetos a la cámara, la cámara se carga. Cuando se prueba la quimiotaxis, el embalse que no contendrá el chemotactant sospecha (-) se carga primero y sellado. Entonces, el otro depósito se carga con la sospecha de chemotactant (+) y se sella. NCC periféricos a lo largo de la frontera previamente seleccionados puede ser fotografiado y seguido usando el plugin Manual de seguimiento para ImageJ (panel inferior). (C) Numerosas características migratorias en respuestapara el gradiente aplicado puede ser evaluada sobre la base de datos de seguimiento. Por ejemplo, un índice de quimiotaxis puede ser el resultado de dividir el desplazamiento de una célula a lo largo del eje x de la distancia total que ha emigrado. (D) Un ejemplo de una respuesta atractiva se muestra en un gráfico la trayectoria de células generadas inicialmente por la quimiotaxis y la migración herramienta plug-in para ImageJ. El punto de partida de cada trayectoria está en el origen (0,0). Tenga en cuenta cuántas células migran hacia el centro source.The quimioatrayente de la masa de todas las células en su posición final (cruz azul, todas las células con igual ponderación) es también más cercano a la fuente quimiotáctica. NCC, las células de la cresta neural, las pistas rojas, las células que emigraron hacia el depósito cargado con una sospecha de chemoattractant; pistas Negro, las células que emigraron; (+), la mayor concentración chemotactant; (-), baja concentración chemotactant.

Figura 3. Perfiles de intensidad a través del puente de una cámara modificada Zigmond en diferentes momentos después de la adición de un Alexa Fluor 488 conjugado IgM. La cámara se ha cargado de forma similar a la descrita en el protocolo con las principales excepciones que el agua preincubaron (en lugar de medio preincubados) se utiliza para diluir el anticuerpo a 40 mg / ml, y pequeñas bolsas de aire se presentan en los extremos del puente (lejos de la corte, donde los perfiles de intensidad por encima de donde se toma). Inicialmente, no estaba presente gradiente en la mayor parte del puente. Por un gradiente de hectáreas se estableció y se mantuvo presente a través de a 26 h. Por 50 h la presencia de la pendiente era incompatible en las diferentes áreas del puente, y cuando está presente, la inclinación de la pendiente era muy disminuido. Todos los perfiles se generaron a partir de una porción idéntica a través del puente (de un puente fronterizo depósito a otro) utilizando el software AxioVision 4.6. Tenga en cuenta que aún cuando el airebolsillos estaban presentes, la pendiente no se interrumpió. Alta, de alta intensidad, de baja intensidad y baja; eje X, distancia a través de todo el ancho del puente (2 mm), (+), el depósito cargado con el conjugado de Alexa Fluor 488 IgM (-), el depósito no se ha cargado con el conjugado.

Figura 4. Modificado Zigmond las especificaciones de la cámara. Se muestra un diagrama de la cámara modificada Zigmond se usa aquí, junto con sus especificaciones dimensionales (± 0,2 mm). Las medidas pueden ser moderadamente ajustado con el fin de ajustarse a las preferencias individuales.

Protocolo Suplementario: Fabricación de una cámara modificada Zigmond

Por favor refiérase a la Figura 4 como referencia para el protocolo siguiente:

1. Compra de una hoja de 3 / 16 "de espesor de acrílico pulido (4,45 mm de espesor real).
2. Utilizando una sierra de mesa, cortar los espacios en blanco de gran tamaño a la cámaradimensiones aproximada de 33,25 mm x 64,57 mm. Esto permite a los 3.175 mm de material adicional para el mecanizado.
3. Set en blanco la cámara en un tornillo de banco. Con una fresadora y un 6,35 mm (1 / 4 ") poco la fresa, el acabado de mecanizado de los lados de la cámara a sus dimensiones exactas: 30,07 mm x 61,39 mm.
4. La posición de la cámara en blanco en la máquina de fresado y localizar el centro del blanco a lo largo de los dos ejes X e Y con un palpador de aristas, y luego a cero la ubicación del centro.
5. Adquirir la altura de la cámara (eje Z) al tocar la fresa final a la superficie superior y el cero de la altura.
6. El uso de un 3,91 mm (0,154 ") poco la fresa, compensar el poco 3,03 mm a lo largo del eje X (dirección positiva) para el primer depósito. Comience mecanizado en la cámara hasta una profundidad de 2,84 mm mientras que se mueve a lo largo del eje y (sentido positivo) de 7,62 mm (0,300 ") y luego atravesar a 7,62 mm (0,300") en la dirección opuesta (negativa) en dirección a un depósito completo longitud de 15,24 mm (0,600 "). Compensarel bit a 3,03 mm (0,119 ") a lo largo del eje X (sentido negativo) y repetir el mismo proceso para el segundo depósito.
7. Posición de la cámara en su extremo y un agujero con un 1,09 mm (0,043 pulgadas) broca en el extremo de cada depósito (4 en total) que conecta el extremo del depósito al lado de la cámara de carga media durante la experimentación.
8. Sumerja la cámara bien en agua tibia y jabón para ayudar a eliminar todos los contaminantes químicos.
9. Remojo y enjuague la cámara bien en agua doblemente destilada para eliminar todo el jabón. Las cámaras están ahora listos para su uso como se describió anteriormente.

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Discusión

La realización de investigaciones sobre la quimiotaxis de los países contribuyentes netos tronco ha demostrado ser un reto para una serie de razones. NCC tronco constituyen una población heterogénea de células madre que va a diferenciar si se cultivan a largo plazo, por lo tanto, los países contribuyentes netos tronco ha de ser obtenida de la explantación de la primaria del tronco a nivel de NT. Los métodos convencionales para estudiar la respuesta quimiotáctica de las poblaciones de células distribuidas homog...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios (opcional)
DMEM	Omega Científico	DM-22
Solución de penicilina estreptomicina	Omega Científico	PS-20	Concentración de 100X
L-glutamina	Omega Científico	GS-60	Concentración de 100X
El suero fetal bovino	Omega Científico	FB-11	Lote # 105247 (o cualquier otro que sea comparable)
Modificado Zigmond cámara	Hecho en casa	N / A	Volumen de embalse: 160 ~ ea l, para obtener especificaciones adicionales, ver fig. 4 y el protocolo adicional de fabricación
Placa de cultivo celular	Denville	T6040	40 x 10 mm
Fibronectina	BD	354008	Foto 10 veces más preparada mediante la dilución de 1 mg FN en 1 ml de H 2 O y 9 ml DMEM
Cubreobjetos	Pescador	12-548-B	Precleaned, 22 x 22 mm
L15	Thermo Scientific	SH30525.02
Jalea de petróleo	Comodidades	011110794642	100%
Tubo de centrífuga	Biologix	10-9152	15 ml
Dispasa	Sistemas de Celdas de	4Z0-850	Concentración de 10X
Jeringa	BD	309602	1 ml
Aguja	BD	305127	25 G x 1,5 pulgadas
Alexa Fluor 488-IgM	Yonvitrogen	A21042	Archivo es de 2 mg / ml, 7 moles tinte / mol IgM
Pinza de disección	FST	Misc.	Dumont n º 5 o el 55, con punta recta, acero inoxidable o titanio
Aguja de tungsteno	N / A	N / A	Hecho en casa, coloca en un soporte de pasador
Blunt Forceps	Tiemann	160-18	Se utiliza para transferir los embriones al Ringer de yema de huevo