Comparación cuantitativa de Cis-Elemento regulador (CRE) Las actividades de transgénicos Drosophila melanogaster</em

Resumen

La variación fenotípica de rasgos puede ser consecuencia de mutaciones en cis-elemento regulador (CRE) secuencias de patrones genéticos que controlan la expresión. Métodos derivados de su uso en Drosophila melanogaster cuantitativamente se puede comparar los niveles de la distribución espacial y temporal de la expresión génica mediada por la modificación o naturales variantes CRE.

Resumen

Patrones de expresión génica se especifican por cis-elemento regulador (CRE) de secuencias, que también son llamados potenciadores o módulos cis-reguladoras. Un típico CRE cuenta con un arreglo de sitios de unión de varias proteínas del factor de transcripción que le confieren una lógica de regulación especifica cuándo, dónde y en qué nivel del gen regulado (s) se expresa. El conjunto completo de CRE dentro de un genoma animal codifica el programa del organismo para el desarrollo ^1, y empíricos, así como los estudios teóricos indican que las mutaciones en CRE desempeñado un papel destacado en la evolución morfológica ^2-4. Por otra parte, los estudios del genoma humano de asociación amplia indican que la variación genética en CRE contribuir sustancialmente a la variación fenotípica ^5,6. Por lo tanto, la comprensión de la lógica de regulación y de cómo las mutaciones afectan a esa lógica es un objetivo central de la genética.

Transgenes reportero de proporcionar un método eficaz para estudiar la función in vivoción de la CRES. Aquí una secuencia CRE sabe o se sospecha está acoplado al promotor heterólogo y las secuencias codificadoras de un gen que codifica un producto de proteína fácilmente observables. Cuando un reportero transgén se inserta en un organismo huésped, la actividad de la CRE se hace visible en forma de la proteína codificada reportero. P-elemento de transgénesis mediada por la mosca de la fruta especies de Drosophila (D.) melanogaster ⁷ ha sido utilizado durante décadas para introducir transgenes reportero en este organismo modelo, aunque la ubicación genómica de los transgenes es aleatorio. Por lo tanto, la actividad del gen está fuertemente influenciada por la cromatina locales y el medio ambiente del gen, lo que limita las comparaciones CRE a ser cualitativa. En los últimos años, el sistema de integración basado phiC31 fue adaptado para su uso en D. melanogaster para insertar los transgenes en el genoma específico lugares de aterrizaje ^10/08. Esta capacidad ha hecho que la medición cuantitativa del gen y, pertinente en este caso, la actividad de CRE ^11-13 feasible. La producción de moscas de la fruta transgénicas pueden ser subcontratados, incluyendo phiC31 basado en la integración, eliminando la necesidad de adquirir equipos costosos y / o tienen una habilidad especializada en protocolos de inyección transgénica.

A continuación, presentamos un protocolo general para evaluar cuantitativamente la actividad de la CRE, y mostrar cómo este método puede ser usado para medir los efectos de una mutación introducida en la actividad de una CRE y comparar las actividades de la CRES orthologous. Aunque los ejemplos son para un activo CRE durante la metamorfosis mosca de la fruta, el enfoque se puede aplicar a otras etapas de desarrollo, las especies de mosca de la fruta, o de los organismos modelo. En definitiva, un uso más generalizado de este enfoque de la CRE estudio debe avanzar la comprensión de la lógica de regulación y de cómo la lógica puede variar y evolucionar.

Protocolo

Descripción:

Este video muestra un protocolo capaz de medir cuantitativamente las actividades reguladoras de genes para el cis-elemento regulador (CRE) en secuencias de Drosophila (D.) melanogaster. Este protocolo se puede utilizar para comparar las actividades de regulación que posee: de tipo salvaje y mutantes formas CRE, de origen natural alelos CRE encontrado dentro de una especie, o CRE ortólogos entre especies se separaron.

1. Sitio específico de integración de los transgenes reportero en el genoma de Drosophila melanogaster

Reportero A. transgén de la construcción

1. Como primer paso, cualquier CRE evaluado debe ser separado clonado en un vector reportero que contiene un (1) attB bacteriana secuencia del sitio de unión utilizado para el sitio específico de integración de los transgenes ^8.11, (2) sitio de clonación múltiple ascendente de un (3) promotor heterólogo que es seguido por la secuencia (4) que codifica para un fluorescentesproteínas (como EGFP o DsRed).
2. Mientras que cualquier vector puede ser compatible para phiC31 sitio específico mediada la integración mediante la introducción de una secuencia attB en el esqueleto del vector, el vector pS3aG12-14 se puede obtener desde el repositorio addgene plásmido (http://www.addgene.org/pgvec1) pS3aG es una versión personalizada de la transformación de P-basado vector15 en el que uno de los dos aisladores gitana fue reemplazado por un aislante SfIb, que contiene un sitio de clonación múltiple mejorado, y posee una secuencia de bases que contiene un par de 250 sitio de unión attB. CRE de interés se inserta en el sitio de clonación múltiple río arriba de un promotor Hsp70 mínimo y el gen EGFP que codifica una versión mejorada de la proteína verde fluorescente que se localiza en el núcleo.

B. sitios específicos de integración de los transgenes reportero

1. Para un conjunto de CRE, cuyas actividades se van a comparard como parte de los vectores transgén reportero, los vectores se crean por separado integrado en el sitio genómico mismo rellano. Aquí, la proteína del fago phiC31 integrasa cataliza la recombinación unidireccional entre el sitio de la adhesión bacteriana (attB) en el vector transgénico y un fago genómicamente encuentra (attP) sitio de unión ^9. Varios grupos de ^8-11 han hecho una serie de líneas transgénicas que incluyen un sitio attP (los llamados sitios de aterrizaje) y contienen una fuente de genómica ⁸ de phiC31 que expresa esta proteína en las células germinales. Estas poblaciones de moscas se pueden obtener fácilmente a partir de la Bloomington Drosophila Stock Center (http://flystocks.bio.indiana.edu/) .
2. Un protocolo publicado existe detalla cómo crear transgénicos de Drosophila sitio en concreto con la integrasa phiC31 ^16. El equipo y los conocimientos técnicos necesarios para hacer transgénicos de Drosophila lines ya no es necesario que los proveedores de la existencia de varios (Tabla 1) para los cuales este servicio se puede externalizar.
3. El comportamiento de los transgenes pueden variar mucho de un tejido a otro ^11. Así, un solo sitio attP de aterrizaje no es óptima para el análisis de todos los CREs, etapas de desarrollo, y / o tejidos de estudio. Es aconsejable evaluar la actividad de una CRE de interés en varios lugares de destino diferente con el fin de encontrar un sitio donde la actividad de la CRE es representativa de la meta de genes endógenos (s) patrón de expresión.
4. Para obtener las líneas transgénicas, es aconsejable que sean homocigotos para el transgén. La actividad de CRE es generalmente más robustas en los individuos con dos copias del transgén y la medición cuantitativa, es imperativo que las comparaciones se hacen entre los individuos con el mismo número de copias del transgén. Los individuos homocigotos se puede obtener a través del uso de los cromosomas del balanceador. Para los sitios de aterrizaje bien caracterizados, aunque, a menudo es simpler para recoger los machos y las hembras vírgenes, y cruzar los ojos con el fenotipo de color más intenso que confiere el gen de mini-blanco (Fig. 1), como el rescate blanco mutante proporcionada por el vector del transgén integrado es más dramática en los individuos con dos vectores copias.

2. La obtención de muestras de tejidos o de la etapa de desarrollo apropiada

Obtener muestras para el análisis en el momento en el desarrollo cuando el patrón de expresión génica (s) de interés se producen (s) de forma endógena, por lo tanto el momento en que la CRE bajo investigación debe activar la expresión del gen. De Drosophila, esto puede ser embrionarias, larva, pupa o adulto. A continuación se describe un método para organizar las moscas adultas y metamórficas, la última de las cuales se lleva a cabo dentro de la pupa, la larva dura piel que contiene la muestra inmóvil hasta que ecloses como un adulto.

1. Ampliar las líneas transgénicas para asegurar Specimens de la etapa apropiada están disponibles cuando esté listo para analizar la expresión del gen por microscopía confocal. La creación de dos frascos, cada uno con varios (~ 5 - 10) machos y hembras. En días alternos, un golpe a las moscas de uno de los viales a un vial sin usar. Repita esto por una semana. Al cabo de dos semanas, las moscas transgénicas frutos estarán disponibles, que van desde larvas hasta adultos etapas de desarrollo.
2. Puesta en escena moscas adultas: La duración del tiempo dentro de un pupario es de 98 horas para mujeres y 102 horas para los hombres cuando se crían a 25 ° C. Las moscas adultas pueden ser recogidos fácilmente cuando salen de la pupa (llamada eclosión). Este punto de tiempo se puede considerar después de la eclosión 0 horas. Las moscas adultas se pueden criar hasta el punto de tiempo requerido para el análisis. Por ejemplo, una CRE MEL-OE1 que controla la expresión del gen en el desatF oenocytes adultos de D. hembras melanogaster no se activa inmediatamente después de la eclosión, pero la actividad de CRE switches después de un día ^14. Cuando la etapa correcta se obtiene, anestesiar a las moscas y los sitúan en una gota de aceite de halocarbonos en una diapositiva y proceder a la evaluación confocal.
3. Puesta en escena muestras durante la metamorfosis: Al final de la etapa de tercer estadio larval se forma la pupa. Aunque en esta etapa el animal técnicamente sigue siendo una tercera instar de la larva, esta etapa de desarrollo es fácilmente identificable como la muestra no es móvil, la pupa es suave y blanca, y los espiráculos se han vuelto hacia fuera (Fig. 2A). Este punto de tiempo se puede considerar 0 horas después de la formación pupario (hAPF). En esta etapa, los machos se pueden distinguir de las hembras por la presencia de gónadas bilateral situado cerca de la mitad del cuerpo que aparecen como círculos transparentes (en caja en la fig. 2A y que indica la flecha negro en 2A ").

1. Puesta en escena basada en la longitud de la metamorfosis:

A 0 hAPF, las muestras se pueden transferir a un vial de nuevao placa de Petri con un pincel humedecido. Para mantener los especímenes que se seque, agregar un trozo de Kimwipe y humedecer con agua. Transferencia de vial o un plato a una incubadora de 25 ° C hasta que el hAPF deseado.

2. Puesta en escena de las características morfológicas visibles:

A menudo es un inconveniente para analizar las muestras para la actividad de CRE en un punto de tiempo específico después de la recolección de muestras de 0 hAPF. Alternativamente, se puede identificar correctamente organizado muestras en un momento conveniente para el análisis basado en la presencia y posición de los marcadores morfológicos (detallado más abajo) que son visibles a través de la pupa o después de la eliminación pupa (Fig. 2).

2a. Criterios morfológicos para la aproximación de la etapa metamórfica:

• 0 hAPF: Blanco etapa de larva en prepupa deja de moverse, espiráculos anteriores evertido (flecha en la Fig. 2A.) Lateral tráquea visible; suave pupario blanco (Fig. 2A).
• ~ 14 hAPF:Curtido y endurecido pupario, la cabeza del saco evertido; tráquea lateral y las gónadas menos distintas, las piernas y las alas completamente extendidas a lo largo del abdomen, túbulos de Malpighi no es tan prominente y verde (región discontinua en caja de la figura 2B.); Ojos pigmentados (Fig. 2B) .
• ~ 25 hAPF: Dos tubos de Malpighi paralelas prominentes y de color verde (discontinua región en caja en la Fig. 2C)..
• ~ 40 hAPF: Dark cuerpo verde, amarillo, colocado entre los extremos anteriores de los túbulos de Malpighi (rojo punta de flecha en la Fig. 2D)..
• ~ 50 hAPF: cuerpo amarillo colocado en el punto medio de los túbulos de Malpighi (. Región en caja en la Fig. 2E y ampliado en''2E) y los ojos son de color ámbar, si de tipo salvaje para el gen blanco (necesario para el color de ojos rojos) . Color de los ojos que falta en esta etapa cuando el fenotipo mutante blanco es rescatado por el gen de mini-blanco que es parte de la integración del transgén reportero vector (Fig. 2E).
• ~ 70 hAPF:, (. región en caja en la Fig. 2F caja y ampliado en 2F'') microchaetae dorsal torácica y macrochaetae visible (Fig. 2F, flecha) cuerpo de color amarillo colocado en la parte posterior de los túbulos de Malpighi, color de ojos es de color rosa cuando fueron rescatados por el gen mini-blanco (Fig. 2F).
• ~ 80 hAPF: puntas de las alas grises, túbulos de Malpighi anterior situado entre el punto medio del abdomen (. Región en caja en la Fig. 2G y ampliado en 2G "), pliegues entre los segmentos abdominales y las cerdas de los terguitos abdominales son visibles (Fig. 2G y 2G "), y rescató a los ojos de color es rojo brillante (Fig. 2G).
• ~ 90 hAPF: Wings oscuro a negro; túbulos de Malpighi y el cuerpo amarillo oscurecido por el bronceado de tergitos, torácica (flecha) y abdominal cerdas maduras y oscuras (Fig. 2H) y meconio verde aparece en el extremo dorsal posterior del abdomen ( fig. 2H'').

Notas:

1. En late las etapas de la metamorfosis, el sexo de los ejemplares puede ser determinada por la morfología genital (puntas de flecha en la fig. 2I y 2J) o la presencia del sexo oscuro peines en el primer juego de piernas masculinas.
2. Mayor precisión en la estadificación se puede lograr mediante la consideración de otros marcadores morfológicos como hemos descrito anteriormente ^17.

D. Medidas para eliminar muestra de pupa:

1. Usando la cinta de laboratorio adherir un pedazo de cinta de embalaje a una tabla de disección con la parte adhesiva hacia arriba.
2. Moje un pincel y aplicar la humedad de las muestras pupariated. Usando un pincel, la transferencia de las muestras a un Kimwipe.
3. Con unas pinzas o un pincel, las muestras de la transferencia a la cinta de embalaje y se adhieren a la superficie dorsal hacia arriba (lado curvo de pupa).
4. Permiten que las muestras a secar durante unos 15 minutos. Pupario secas son mucho más fáciles de abrir que los que son húmedos. En este punto, las muestras pueden ser groseramente puesta en escena por morfológicasmarcas visibles a través de la pupa.
5. Con unas pinzas, abrir progresivamente hasta el comienzo pupario en el opérculo anterior y avanzar hacia el extremo posterior. Si una disección más fina escala se requiere para aislar un tejido específico se puede hacer en un vidrio de reloj con una solución de PBS. De lo contrario, la transferencia de las pupas de una gota de aceite viscoso Halocarbon HC700 (Sigma-Aldrich) en un portaobjetos de microscopio.
6. Situar las muestras en un portaobjetos, utilizando un microscopio estereoscópico, y utilizando los criterios descritos anteriormente (sección 2a) puede ser escenario de un espécimen determinado ..

3. Evaluación microscópica confocal de la expresión del gen en una muestra de monte se

1. Para toda las muestras de montaje, utilice uno de los objetivos 4x o 10x. Mediante fluorescencia estimulada por la exposición a lámpara de mercurio, o bien por la visualización en campo claro, ajustar la platina del microscopio a la muestra de la posición en el campo de la óptica a continuación, llevar la muestra en el enfoque.
2. Utilizando el microsco confocalpe software, ajustar la longitud de onda de excitación de EGFP (o una longitud de onda adecuada cuando se utiliza otra proteína fluorescente).
3. Para evitar que photobleaching una muestra, comienza con una intensidad del láser de 5-10%. Si la señal es decepcionante, a continuación, aumente la intensidad según sea necesario.
4. Con el fin de mejorar la relación señal a ruido para imágenes confocal, habilitar la configuración de software que las mediciones promedio de píxeles de los análisis replicar, como un promedio de Kalman o línea y media de la pila. En nuestra experiencia, un promedio de Kalman para tres exploraciones mejora la relación señal a ruido sin hacer el tiempo para la recolección de la imagen demasiado tiempo.
5. Para las comparaciones cuantitativas de la actividad de CRE, es esencial que la intensidad de fluorescencia de una muestra no se ha saturado de píxeles. El uso de un z-sección en la fluorescencia aparece más intenso, ajuste la configuración para que unos pocos píxeles se saturan. Esto se puede hacer por cambiar a una tabla de búsqueda de saturación de alerta y el ajuste del voltaje de los canales, la ganancia y el offseta los ámbitos donde unos pocos píxeles se saturan. Por último, con el fin de recoger la señal suficiente de una muestra de que a menudo es necesario ajustar la apertura confocal.
6. Una vez que los ajustes óptimos se determinan, ejecute el z-scan.
7. Cuando haya finalizado la exploración convertir la pila de imágenes en una proyección y guardar esta imagen en el Tagged Image File Format o "TIFF".

Nota:

1. Es fundamental para utilizar la configuración confocal mismo para todas las muestras repetidas y las líneas de reportero transgén que se incluirán en una comparación cuantitativa de las actividades de la CRE.

4. La cuantificación de cis-reguladoras actividad elemento

Mientras que algunos programas de adquisición confocal permite el procesamiento posterior de las imágenes de proyección, se prefiere usar la libre disposición de la imagen J programa de software para evaluar las imágenes confocal ^18. Con Image J ¹⁸ grabados los patrones de expresión de GFPse puede cuantificar como las estadísticas de valores de pixels en un área específica. Aunque las imágenes no tienen que ser en escala de grises que preferimos hacerlo.

1. Con el programa Image J comenzar, abra una imagen TIFF para ser evaluado.
2. Haga clic en el botón de selección a mano alzada y delimitar el área de la muestra en la cuantificación se desea, por ejemplo la región en la Figura 3 en el borde punteado de color amarillo. (Véase la nota a continuación sobre la selección de un área para cuantificar).
3. Para obtener una estadística de valor de píxel, haga clic en la ficha Analizar y seleccione medir. Un cuadro de resultados que mostrará el área, y las puntuaciones de píxeles promedio, mínimo y máximo valor. Registro de la puntuación media de píxeles y repetir para generar estadísticas de pixel de valor para muestras repetidas (véase la Nota B con respecto al número replicar).
4. Se recomienda recoger un valor promedio de píxeles de segunda de una región de control donde la CRE no está activo, por ejemplo la región en la Figura 3 en el borde rojo discontinuo. Este último Value puede ser restado del valor anterior para eliminar los efectos de fondo de la medición para obtener un valor promedio de píxeles ajustado. En nuestra experiencia esto reduce aún más la variación entre muestras repetidas (ver c Nota sobre la selección de tamaño para la región de control).
5. Utilice los valores de la media ajustada de píxeles de muestras repetidas para calcular el promedio de la actividad reguladora para una CRE y el error estándar de la media. Este valor de la actividad reguladora y de medición de error puede ser comparado con otro reportero transgenes en la secuencia de la CRE es diferente (por ejemplo de la Figura 3).

Notas:

1. Imagen de J permite al usuario seleccionar una forma definida y el área de la que será una puntuación media de píxeles determinado. Sin embargo, el tamaño de la muestra varía a menudo se prefiere utilizar la herramienta de selección a mano alzada para especificar el área a ser evaluada para cada muestra.
2. Un mayor número de repeticiones (N) da como resultado una mejor estimación de la media regulala actividad regulatoria para un determinado CRE. Nos encontramos con que un N entre 4 y 8 es suficiente.
3. En nuestra experiencia el tamaño de la zona de control seleccionada tiene poco efecto en el valor medio de píxeles medido para el control de la región. En general, podemos seleccionar un área proporcional al tamaño de la zona de interés.

5. Los resultados representativos:

Una versión de tipo salvaje de una D. melanogaster CRE, llamado elemento dimórficos ^13, las unidades de un alto nivel de expresión de EGFP reportero en el segmento abdominal de la mujer A6 pupas (Fig. 3). Una secuencia de bases de 13 pares dentro de este elemento se encontró que era un sitio de unión para el factor de transcripción DSX, y la importancia in vivo de esta secuencia se puede demostrar mediante la cuantificación de la actividad reguladora de este CRE cuando este sitio de unión se encuentra mutado. Teniendo en cuenta la actividad reguladora de los elementos de tipo salvaje dimórficos a ser de 100 ± 5%, la mutación de este sitio DSX redujo la regactividad ulatory a 28 ± 3%. Comparaciones similares se pueden hacer de las actividades reguladoras de intraespecífica alelos CRE CRE o entre ortólogos de especies separadas. Por ejemplo, considerando los niveles de EGFP en A6 segmento femenino impulsado por el D. melanogaster cepa Cantón S como una actividad reguladora de 100 ± 4%, CRES ortólogos de las especies D. simulans y D. willistoni se encontró que poseen, respectivamente, las actividades de regulación igual a 75 ± 4% y 0 ± 0% (Fig. 3B).

Figura 1. El uso de la intensidad del fenotipo de ojo blanco de rescate para las líneas transgénicas homocigotos. Con el fin de evaluar cuantitativamente los transgenes reportero es importante que cada muestra tiene el genotipo reportero mismo transgén. (A) Un gen mutante blanco fondo genético con una secuencia del sitio de aterrizaje attP se utiliza para el sitio-s ESPECÍFICAS integración del transgén. Individuos transgénicos (B) hemicigotos y (C) homocigotos para la lucha antivectorial integrada generalmente se distinguen por la intensidad del fenotipo de color de los ojos rescatado por el número de copias del gen integrado mini blanco. Líneas homocigóticas se puede establecer mediante el cruce (C) machos y hembras con el fenotipo de los ojos color más oscuro.

Figura 2. El uso de marcadores morfológicos para determinar el grado metamórfico de Drosophila. Durante la metamorfosis de la larva de una mosca de la fruta adultas, las transiciones muestra a través de una serie de morfologías estereotipados que se puede utilizar para determinar el sexo y aproximarse a la etapa de desarrollo. Las muestras de Bosnia y Herzegovina se han eliminado de su pupario. Cajas en los grupos A, E, F, G y H indica el zoom en las regiones, respectivamente, para los grupos A ", E", F ", G" y H ".

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Figura 3. Comparación cuantitativa de las actividades de elementos cis-reguladores. Para todas las muestras EGFP reportero la expresión génica mediada por un elemento dimórficos en particular se evaluó en las mujeres de 80 horas después de la formación de pupa. El número en la parte superior de cada imagen es el nivel de EGFP-expresión de la muestra que se calcula como el valor del píxel significa para el segmento abdominal A6 (indicado para la parte superior de la imagen más a la izquierda en la región en el borde punteado amarillo) menos la media de la pixel de valor para el segmento A4 (corrección de fondo, indicado para la parte superior de la imagen más a la izquierda en la región en el borde rojo discontinuo). Por cada reportero transgén cuatro repeticiones se evaluaron para el cálculo de una media A6 segmento de valor de píxeles. La actividad reguladora se presenta como el% del tipo (A) salvajes o (B) la cepa S Cantón mujeres valor medio pixel ± SEM. (A) las buenas prácticas agrarias expresión para las mujeres que poseen un alelo de tipo salvaje de laElemento dimorfas y una versión mutante, donde se realizó ablación un solo sitio de unión para el factor de transcripción DSX. Este sitio de unión mutante reducción de la actividad de elementos dimórficos a 28 ± 3% de la secuencia de tipo silvestre. (B) Comparación de las actividades reguladoras de las secuencias de ortólogos a la D. melanogaster (cepa Cantón S) dimórficos elemento. Teniendo en cuenta la mediada por la expresión de GFP por un D. melanogaster alelo elemento dimórficos como el 100%, las secuencias de ortólogos de las especies relacionadas con D. simulans y D. willistoni respectivamente poseen actividades de 75 ± 4% y 0 ± 0%.

6. Materiales

Nombre del Material	Tipo	Empresa	Número de catálogo	Comentario
Integración sitio-específica del transgén	Servicio	Mejor Gene	Plan H	Elige un sitio de aterrizaje, líneas de recepción transformante
Halocarbonos petróleo	Reactivo	Sigma-Aldrich	H8898	Se utiliza para montar muestras de imagen confocal
Dumont # 5 Pinzas	Herramienta	Herramientas de Bellas Ciencia	11252-40	De punta fina y durable para la disección
SZ61 Microscopio estereoscópico zoom	Herramienta	Olimpo	Personalizable	Excelente óptica para trabajar con moscas de la fruta
Microscopio Confocal FluoView	Herramienta	Olimpo	Personalizable	Proporciona imágenes de alta resolución confocal

Discusión

elementos reguladores cis-codificar el programa de genómica que especifica los patrones de expresión génica y de ese modo el proceso de desarrollo ^1, y son lugares importantes para ambas mutaciones subyacentes evolución morfológica ^2-4 y la variación fenotípica de los rasgos humanos ^5,6,19. A pesar de esta importancia, la lógica de regulación de CRE siguen siendo poco conocidos. Una razón importante de este déficit la comprensión ha sido la falta de métodos adecuado...