Crecimiento de Mycobacterium tuberculosis Las biopelículas

Resumen

Mycobacterium tuberculosis forma biofilms de drogas tolerantes cuando se cultivan en ciertas condiciones. Aquí se describen los métodos para el cultivo de M. biopelículas la tuberculosis y la determinación de la frecuencia de las drogas persisters tolerantes. Estos protocolos serán útiles para futuros estudios sobre los mecanismos de tolerancia a las drogas en M. la tuberculosis.

Resumen

Mycobacterium tuberculosis, el agente etiológico de la tuberculosis humana, tiene una extraordinaria capacidad para sobrevivir a las tensiones ambientales, incluidos los antibióticos. A pesar de la tolerancia al estrés de M. la tuberculosis es uno de los probables contribuyentes a la quimioterapia de largo de 6 meses de la tuberculosis ^1, los mecanismos moleculares que subyacen a este fenotipo característico del patógeno siguen sin estar claros. Muchas de las especies microbianas han evolucionado para sobrevivir en ambientes estresantes auto-montaje en el altamente organizado, de superficie unida, y las estructuras matriciales encapsulados denominadas biofilms ^2-4. El crecimiento de las comunidades parece ser una estrategia de supervivencia preferente de los microbios, y se logra a través de los componentes genéticos que regulan la fijación de superficie, la comunicación intercelular, y la síntesis de sustancias poliméricas extracelulares (EPS) ^5,6. La tolerancia al estrés ambiental es probablemente facilitado por EPS, y tal vez por el physiolola adaptación lógica de bacilos individuo a microambientes heterogéneos dentro de la compleja arquitectura de las biopelículas ^7.

En una serie de trabajos recientes se estableció que el señor la tuberculosis y Mycobacterium smegmatis tienen una fuerte tendencia a crecer en estructuras multicelulares organizados, llamados biofilms, que pueden tolerar más de 50 veces la concentración mínima inhibitoria de los medicamentos antituberculosos isoniazida y la rifampicina ^10.08. M. la tuberculosis, sin embargo, curiosamente requiere condiciones específicas para formar biofilms maduros, en particular, relación 9:1 de espacio de cabeza: los medios de comunicación, así como el escaso intercambio de aire con la atmósfera ^9. Requisitos de las condiciones ambientales especializados, posiblemente, podría estar relacionado con el hecho de que M. la tuberculosis es un patógeno humano obliga y por lo tanto se ha adaptado a los ambientes del tejido. En esta publicación se demuestra métodos para el cultivo de M. tuberculosisbiopelículas en una botella y un formato de placa de 12 pocillos, que es conveniente para los estudios bacteriológicos, así como genéticos. Hemos descrito el protocolo para una cepa atenuada de M. la tuberculosis, el mc ² 7000, con la supresión de los dos loci, PANCD y la RD1, que son fundamentales para el crecimiento in vivo del patógeno ^9. Esta cepa puede ser utilizado con seguridad en una contención BSL-2 para la comprensión de la biología básica del patógeno de la tuberculosis evitando así la exigencia de una costosa instalación de BSL-3. El método puede ser extendido, con las modificaciones apropiadas en los medios de comunicación, para crecer biofilm de otras especies de micobacterias cultivables.

En general, un protocolo uniforme de las biopelículas de cultivo de micobacterias ayudará a los investigadores interesados ​​en estudiar las características básicas de las micobacterias resistentes. Además, un método claro y conciso de las biopelículas de crecimiento de micobacterias también ayudará a la inv clínica y farmacéuticaestigators para probar la eficacia de un fármaco potencial.

Protocolo

1. Biopelículas de crecimiento de M. la tuberculosis en una botella de 250 ml con tapa rosca

1. Preparación de medios de comunicación: Disolver 0,5 g de KH ₂ PO _4, 0,5 g de MgSO _4, 4 g de L-asparagina, 2 g de ácido cítrico, 0,05 g de citrato férrico amónico, 60 ml de glicerol en 900 ml de agua. Ajustar el pH a 7,0 con NaOH. Autoclave, enfriar y justo antes de iniciar el experimento, añadir estéril ZnSO ₄ a una concentración final de 0,1% w / v Desde 7000 mc ² es un auxótrofo pantotenato de esta cepa también requiere que el ácido pantoténico en 10μg/mL de la concentración final.

Nota: Esta es una composición estándar de los medios de comunicación Sauton utilizados para M. tuberculosis. Sin embargo, si se requiere otros medios especializados también se puede utilizar para otras especies de micobacterias.

2. Preparación de inóculo: Crecer M. la tuberculosis en 7H9OADC con 0,05% de Tween-80 durante una semana, o ₆₀₀ OD de 0,7 a 1,0. La culture puede ser utilizado directamente como inóculo a una dilución 1:100.
3. Dispense 25 ml de medios de Sauton a una botella de 250 ml tapado de rosca de poliestireno (Corning). Añadir 250μl del inóculo en el medio, la tapa de la botella muy bien y colocarla sin problemas en un humidificado incubadora a 37 ° C durante 3 semanas. Observar la botella una vez cada día para asegurar que no hay contaminación.
4. Al final de la tercera semana, aflojar el tapón de la botella para permitir un mayor crecimiento de M. la tuberculosis en la interfaz. Si el tapón no se afloja en esta etapa a continuación, la concentración de oxígeno insuficiente en el contenedor retardar el crecimiento adicional de las bacterias.

2. Crecimiento de M. biopelículas de tuberculosis en placas de 12 pocillos

1. Preparar los medios de comunicación y el inóculo de 7.000 mc ^2, como se describe en las secciones A1 y ​​A2.
2. Mezclar 60 ml de medios de comunicación con 600μl de inóculo. Dispense 4,5 millonesL de la mezcla en cada pocillo de la placa. Cubrir la placa con la tapa. Envuelva la placa varias veces con Parafilm. Se incuba la placa sin perturbaciones en incubador humidificado a 37 ° C durante 5 semanas.

3. Determinar la frecuencia de las drogas persisters tolerantes en M. la tuberculosis biopelículas

1. Crecer M. biopelículas de tuberculosis en un formato de 12, así como se describe en la sección B. Esto tomará un total de alrededor de 5 semanas.
2. Una vez que las biopelículas son madurados (después de 5 semanas de incubación) debe inyectar la elección del antibiótico a la concentración deseada en los medios de comunicación por debajo de las biopelículas utilizando un micropunta en una pipeta.

Nota: El volumen de los medios de debajo de las unas películas reduce a aproximadamente 3,0 ml. Así que los investigadores en consecuencia debe calcular la cantidad de droga.

3. Agitar la placa suavemente de modo que el antibiótico se difunde a fondo en el medio. Para obtener resultados estadísticamente significativos, se inyectan antibióticos de laótico en cuatro pocillos. En paralelo, inyectar el mismo volumen de disolvente en el que se disolvió el antibiótico en otros cuatro pocillos, y dejar los últimos cuatro pocillos de la placa sin tocar. Cubrir la placa con la tapa y poner nuevas capas de parafina alrededor de la placa. Coloque de nuevo en la incubadora por un período de tiempo deseado.
4. Al final de la incubación, abrir la placa y añadir Tween-80 a la concentración final de 0,1% (volumen / volumen) en cada uno de los pocillos. Agitar la placa suavemente durante toda la dispersión uniforme del detergente. Se incuba la placa a temperatura ambiente durante 15 minutos. Mezclar el contenido de cada pocillo con pipeta varias veces para que el contenido entero puede ser uniformemente transferidos a un tubo cónico de 15 ml.
5. Centrifugar el contenido del tubo en 4000rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente. Resuspender el sedimento en 5 ml de tampón de lavado fresco (PBS con 10% de glicerol y 0,05% de Tween-80). Repetir las lavado tres veces. Resuspender el precipitado en 5 ml de tampón de lavado. Manténgalo en el eje de balancín para la overnight a 4 ° C.

Nota: A pesar de la baja temperatura se desarrolló originalmente para M. smegmatis (para minimizar su crecimiento durante la dispersión) y se utiliza para M. tuberculosis, así, las especies de crecimiento lento puede ser más probable es que sacudió a temperatura ambiente sin ningún tipo de impacto en el resultado. Mecedora a temperatura ambiente, puede ser necesario si se trabaja en las instalaciones BSL-3.

6. Preparar una jeringa estéril equipado con micropunta (2-200μl) mediante la reducción de su extremo más ancho al tamaño adecuado, ajustándolo a la jeringa y envolviéndolo con parafilm. Pasar todo el contenido del tubo a través de la jeringa con punta equipada y recoger en tubos de 15 ml unos frescos. Repita este paso de 5 a 6 veces hasta que se observa una suspensión bastante homogénea.
7. Preparar diluciones seriadas de la suspensión y la placa de las diluciones en la placa 7H11OADC para determinar el número de colonias viables en cada pocillo. Las placas se incuban durante tres semanas a 37 ° C incubadora. Determinar la frecuenciascy de persisters en la población biopelícula mediante el cálculo de la relación del número de colonias obtenidas en tratado con antibióticos a los obtenidos en disolventes placas tratadas.

4. Los resultados representativos

Cuando se cultiva en una botella, el crecimiento de M. la tuberculosis se puede ver en la base de la botella por el final de la primera semana. Al final de la segunda semana, el crecimiento irregular de bacterias en la interfase aire-medio puede verse, aunque el crecimiento en la interfase aire-medio es constantemente visible al final de la tercera semana (fig. 1A). En este momento la fijación de las bacterias a la pared del recipiente también se observa. A partir de este punto, el crecimiento del cultivo se produce principalmente en la interfase aire-medio. El líquido debajo de la superficie de crecimiento es clara. Típicamente, la estructura madura para el final de la quinta semana (Fig. 1B). Si incubación es prolongado, las estructuras comenzará a hundirse hasta el fondo del recipiente. Curiosamente,apriete de la tapa hasta el final de la tercera semana es un paso importante en el proceso, y por razones desconocidas una botella con tapón suelto significativamente retarda la iniciación del crecimiento en la interfaz ^9.

En el formato de 12-así, una biopelícula robusta en la interfase aire-medio se ve en cada uno de los pocillos al final de cinco semanas (Fig. 2A). Si las placas no están protegidos por completo entonces, el crecimiento diferencial de la biopelícula que se observa. En el peor de los casos, la evaporación significativa de los medios pueden detener el crecimiento de las bacterias (Fig. 2B). Así, la envoltura de la placa es necesario tanto para evitar la evaporación, así como para proporcionar el medio ambiente para la formación de biopelículas (véase el párrafo anterior).

El número de bacilos viables en las biopelículas determinados con esta técnica es muy reproducible. Respuesta de M. tuberculosis biopelículas varía con la naturaleza de los antibióticos. Para un antibiótico bactericida como la rifampicina, la pérdida de viabilidad sigue una bipha sic tendencia ^9. Una rápida disminución de la viabilidad durante las primeras tres a cuatro días, seguido de una fase persistente en el que un pequeño porcentaje de la población permanecen completamente recalcitrante a los antibióticos, independientemente de la concentración del antibiótico o el tiempo de exposición. La Figura 3 muestra el número de bacilos viables en las biopelículas maduras después de una exposición 7-días a 50μg/mL (50 veces más alta que la CIM) de rifampicina.

Figura 1. Aparición temprana de M. bacilos de la tuberculosis de la interfase aire-los medios de comunicación de las bacterias después de 3 semanas de incubación.

Figura 1B. Madurado biopelículas de M. tuberculosis en la interfase aire-medio después de cinco semanas de incubación.

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Figura 2A. De 5 semanas de edad las biopelículas de M. la tuberculosis crece en 12 y en formato.

Figura 2B. Un intento fallido para crecer M. tuberculosis en las biopelículas de 12 pocillos, sin parafina.

Figura 3. Un gráfico representativo que muestra la frecuencia de persisters drogas tolerantes en M. tuberculosis biopelículas crecido en 12-así formato y expuestos a 50μg/mL de rifampicina durante siete días.

Discusión

La tuberculosis (TB), causada por la infección de Mycobacterium tuberculosis, sigue siendo una gran amenaza para la salud pública mundial. Casi un tercio de la población mundial se estima que se forma asintomática infectada por el patógeno, cerca de 9 millones de nuevos casos aparecen en la clínica todos los años con síntomas de tuberculosis activa y alrededor de 1,7 millones de personas mueren de la infección todos los años ^11. El enorme peso de la enfermedad es principalmente aportados po...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Incubator	VWR international	Model # 1923/25
Polystyrene culture bottles	Fisher Scientific	03-374-300
12-well tissue culture plate	VWR international	62406-165
50-mL conical tubes	VWR international	89039-660
Rocker	Thermo Fisher Scientific, Inc.	57019-662
Chromatographic refrigerator	VWR international	55702-520
petri dish	VWR international	25384-342
KH2PO4 (monobasic)	EMD Millipore	PX1565-1
MgSO4	Fisher Scientific	M65-500
L-asparagine	Sigma-Aldrich	A4284-100G
citric acid	Sigma-Aldrich	C1857-100G
ferric ammonium citrate	Sigma-Aldrich	F5879-100G
glycerol	EMD Millipore	GX0185-5
NaOH	Sigma-Aldrich	S8045-500G
ZnSO4	Sigma-Aldrich	Z4750-500G
D-pantothenic acid	Sigma-Aldrich	P2250-25G
Difco Middlebrook 7H9 Broth	BD Biosciences	271310
Middlebrook OADC Enrichment	BBL	212351
Tween-80	Fisher Scientific	T164-500
250mL storage bottle	Corning	430281
12 well plates	Falcon BD	353043
rifampicin	Sigma-Aldrich	R3501-1G
methanol	JT Baker	9070-05
10mlLsyringe	BD Biosciences	301604
1-200μL pipet tips	VWR international	89079-458
parafilm M	VWR international	PM-996
15mL centrifuge tube	Greiner Bio-One	188-285
Difco Mycobacteria 7H11 Agar	BD Biosciences	283810
NaCl	Fisher Scientific	BP358-1
KCl	Sigma-Aldrich	P9333-500G
Na2HPO4 (dibasic)	Sigma-Aldrich	S0876-500G