Imágenes de alta resolución en vivo del comportamiento de las células en el desarrollo de neuroepitelio

Resumen

Tisular embrionario en tiempo real es un reto durante largos períodos de tiempo. Aquí presentamos un ensayo para el seguimiento de los cambios celulares y subcelulares en la médula espinal de pollo durante largos periodos con alta resolución espacial y temporal. Esta técnica puede ser adaptado para otras regiones del sistema nervioso y embrión en desarrollo.

Resumen

La médula espinal de embriones consta de ciclismo células progenitoras neuronales que dan lugar a un gran porcentaje de las células neuronales y gliales del sistema nervioso central (SNC). Aunque se sabe mucho sobre los mecanismos moleculares que el patrón de la médula espinal y provocan la diferenciación neuronal ^{1, 2,} carecemos de una comprensión profunda de estos primeros eventos en el nivel de comportamiento de las células. Por tanto, es fundamental para estudiar el comportamiento de los progenitores neuronales en tiempo real que sean sometidos a la neurogénesis.

En el pasado, imágenes en tiempo real de tejido embrionario temprano ha visto limitado por la viabilidad celular / tejido en cultivo, así como los efectos fototóxicas de imagen fluorescente. Aquí se presenta un nuevo ensayo para el tejido de imágenes tales durante largos períodos de tiempo, utilizando un ex vivo novela rebanada protocolo de cultivo y de campo amplio microscopía de fluorescencia (Fig. 1). Este enfoque logra a largo plazo de lapso de tiempo de seguimiento de los embriones de pollo sPinal de células progenitoras de la médula con alta resolución espacial y temporal.

Este ensayo puede ser modificado a la imagen de una gama de tejidos embrionarios ^{3, 4} Además de la observación de los comportamientos celulares y subcelulares, el desarrollo de la novela y periodistas altamente sensibles para la actividad de los genes (por ejemplo, la señalización de Notch ⁵⁾ hace que este ensayo una poderosa herramienta con la que comprender cómo se regula la señalización comportamiento de las células durante el desarrollo embrionario.

Protocolo

1. Preparación de los platos

1. Los platos utilizados para el cultivo rebanada son de vidrio de fondo (con un cubreobjetos como la base) (platos Willco). Estos se colocan en el tejido objetivo en un plato de cultivo de tejidos de 6 cm para mantener el fondo de vidrio limpio.
2. En el día antes del experimento, se añaden 2 ml de 0,1% de poli-L-lisina solución al plato de vidrio de fondo y se incuba durante 5 minutos a temperatura ambiente para permitir que el de poli-L-lisina cubrir el fondo de vidrio.
3. Quitar poli-L-lisina solución y enjuagar tres veces en agua desionizada, y luego una vez en 70% de etanol.
4. Dejar secar durante la noche. Los platos también puede ser secado mediante calentamiento suave en un horno de microondas a baja potencia durante 30-45 segundos.

2. La electroporación de embriones

1. Incubar los huevos a 37 ° C a Hamburger-Hamilton (HH) la etapa 10 (~ 36 horas) (o de otra etapa se desea).
2. Antes de comenzar la preparación agujas de vidrio (se utiliza un Flaming / el modelo de Brown p87 extractor microcapilar) y romper la punta de la Needle con una pinza fina bajo un microscopio de disección. El extremo de la aguja debe ser lo suficientemente afilada para perforar el embrión si bien no es tan estrecho que impide la inyección de la solución de ADN.
3. Huevos de ventana y electrodos lugar (5 mm de separación) a cada lado del embrión
4. Inyectar ADN (~ 0,025 a 0,5 mg / l en agua desionizada coloreada con una pequeña cantidad de verde rápido) en el tubo neural.
5. Aplique corriente - 17.12 V tres veces, la longitud de pulso de 50 ms a 950 ms entre pulsos.
6. Usamos bajas concentraciones de ADN y los voltajes bajos de electroporación para lograr la expresión del mosaico de modo que puede seguir las células individuales.
7. Cubra ventana en la cáscara del huevo con cellotape y asegúrese de que está sellado.
8. Permita que los embriones para recuperar durante 3-4 horas o toda la noche a 37 ° C.

3. El colágeno y la rebanada preparación Cultura Medio

1. Prepare la mezcla de colágeno y la rebanada de medio de cultivo alrededor de una hora antes de rebanar.
2. Para 300 t lipo de un colágeno añadir 100 ml de solución al 0,1% de ácido acético y 100 l 5 x L15. Mezclar bien después de cada adición. La solución debe tornarse amarilla.
3. Ahora agregue 15-20 l de bicarbonato de sodio al 7,5% y mezclar bien. La solución debe ser ligeramente rosa, y el volumen de bicarbonato de sodio requerida para este puede variar. Mantenga en hielo y se forman de nuevo cada vez.
4. A 10 ml de medio neurobasal añadir B-27 y suplemento Glutamax, a una concentración de 1 x 10 solución final y gentamicina l.
5. Colocar en medio de una incubadora a 37 ° C tamponada con un 5% de CO _2. Dejar la parte superior del contenedor suelta para permitir que se equilibre con el CO _2.

4. Slice Cultura

1. Eliminar embriones de huevo y se lava en medio L15.
2. Colocar en un plato de cultivo de tejidos con una capa de Sylgard en la parte inferior y el pin a través de los alrededores de extraembrionarios membranas de manera que se tensa.
3. El uso de un micrófonoroknife, embrión de corte lo más recto posible a través de la región de interés. Para la médula espinal, lonchas han de ser entre 1-2 somitas de espesor. Agregar las rebanadas unidas al embrión, mientras que se mire otros embriones para que no perderlos.
4. Preparar una punta de micropipeta 200 l cortando aproximadamente 1 mm de la punta y colocar esto a un P2 o P10. Esta punta se utiliza para transferir las rebanadas de la médula espinal a la placa inferior de vidrio. Una propina de 10 l no es lo suficientemente amplio como para recoger las rebanadas.
5. Cubra el interior de la punta con el colágeno con la pipeta una mezcla de colágeno l preparado con anterioridad. Dejar reposar 1-2 minutos y luego enjuague con medio L15. Esto evitará que el tejido se adhiera a la parte interior de la punta.
6. Separar sector a partir de embriones utilizando un microknife y retirar de la cápsula, utilizando un P2 o P10 equipada con una punta de 200 l, y pone a 1 l. Trate de tomar como medio lo menos posible.
7. Vortex la mezcla de colágeno y caída de 5-8 l de esto en el plato revestido de poli-l-lisina.
8. Immediatamente puesto rebanada de embrión en el colágeno y la posición en el lugar con un par de pinzas finas. Las rebanadas deben colocarse de modo que la cara que se visualiza está a ras con el cubreobjetos. El tejido debe adherirse a la capa de poli-l-lisina en el cubreobjetos.
9. Repita esto hasta que tenga varios cortes en el cubreobjetos. Por lo general, se puede colocar 6-9 rebanadas en un plato.
10. Una vez que todas las rebanadas están en su lugar, cubrir el plato y permitir que el colágeno para establecer durante 20 minutos. Algunos de los primeros colágeno puesto que ya puede haber comenzado a secarse. Para evitar esto añadir una pequeña cantidad de L15 a éstos antes de cubrir.
11. Una vez configurado, añadir con cuidado medio de la cultura 2ml sector que ha sido equilibrada en el 5% de CO ₂ a 37 ° C durante al menos una hora. Se debe tener cuidado de no desconectar el colágeno de la cubreobjetos.
12. Colocar en un 37 ° / 5% de CO ₂ incubadora y permitir rebanadas para recuperar por lo menos 3 horas antes de imágenes. Si no hay humedad, plato lugar en una caja de plexiglás ingenioha poco de pañuelo de papel humedecido en una esquina.

5. Rebanadas de imágenes de embriones

1. Nosotros utilizamos un procesador Core DeltaVision de campo amplio microscopio equipado con una cámara de WeatherStation ambiental a sectores de la imagen. La cámara se mantiene constantemente a 37 ° C, con un aparato de perfusión de CO ₂ para mantener la platina del microscopio a 5% de CO _2/95% aire.
2. Imagen se lleva a cabo normalmente utilizando un 40 x / 1,30 aceite de NA lente de inmersión y las imágenes son capturadas con una HQ2 CoolSnap enfrió cámara CCD.
3. Z-secciones son capturados cada 1,5 micras a través del tejido 45 micras. El tiempo de exposición debe mantenerse tan bajo como sea posible. Normalmente, para exponer 5-50 ms para cada sección Z. Las imágenes se capturan cada 7 minutos y un máximo de nueve cortes se pueden visitar mediante un punto preciso del sistema DeltaVision de visitar la función.

6. Los resultados representativos

Un ejemplo de lapso de tiempo la secuencia de una célula de la médula espinal es progenitorse muestra en la fig. 2a y una película correspondiente. Imágenes se inició en una rebanada de la médula espinal de una de dos días de edad (estadio HH 12) embrión. Esta célula se transfectó con un constructo que expresa GFP-αTubulin. Durante esta primera etapa, las células progenitoras neurales progenitoras sufren predominantemente progenitora-divisiones del modo en que las células se multiplican para generar dos células progenitoras más en bicicleta. La figura. Película 2b y la correspondiente figura 2 muestra una célula transfectadas con GFP-GPI (GPI de anclaje GFP), que marca la membrana celular. Esta célula se somete a una división durante el cual el proceso basal se divide en dos y está igualmente heredado por las células hijas.

Figura 1. Slice protocolo de cultivo para el time-lapse.

Figura 2. B célulaehavior durante el desarrollo normal de la médula espinal. (a) los marcos seleccionados de la película 1. La célula que expresa GFP-tubulina divide con un plano de escisión que es perpendicular a la superficie apical (2 h 20 min), generando dos células hijas que dividen una vez más (24 h 23 min y 25 min h 54). (B) los marcos seleccionados de la película 2. Celulares transfectadas con GFP-IPG se somete a la división celular durante el cual se divide el proceso basal (flechas blancas) y también heredado por las células hijas.

Película 1. Haga clic aquí para ver la película .

Película 2. Haga clic aquí para ver la película .

Discusión

Presentamos aquí una novela de lapso de tiempo de ensayo de imágenes para vigilar el comportamiento de células en cultivo rebanada de embriones de pollo. Este ensayo permite imágenes de alta resolución del tejido vivo para un máximo de 70 horas, aunque los plazos entre las 24-48 horas son más fáciles de capturar. El uso de un objetivo de aceite de NA y los intervalos relativamente cortos entre los puntos de tiempo permite la adquisición de imágenes en alta resolución, así como lo que nos permite monitorear el comportamiento de células, que a menudo se produce rápidamente, y puede ser fácilmente perdido durante el tiempo convencional de imágenes a intervalos utilizando confocal microscopía.

La principal ventaja de este ensayo es la capacidad de las células de la imagen durante largos períodos de tiempo. El uso de gran campo ^{6 en} vez de láser confocal de barrido microscopio ⁷ es fundamental para esto. La microscopía confocal tradicionalmente ha ofrecido una serie de ventajas sobre todo la microscopía de campo, incluyendo la capacidad de tomar secciones ópticas y eliminar la información de atención directa ^{7, pero el uso de un agujero conduce a una pérdida de la luz al detector 8, excluyendo una cantidad significativa de información, y que requiere largos tiempos de exposición. Wide microscopía de campo, por el contrario, utiliza iluminación de campo completo y toda la luz que pasa a través del objetivo se envía al detector. Esto, junto con una alta eficiencia cuántica se enfrió (CCD) de la cámara garantiza imágenes con una elevada relación señal-ruido en comparación con la microscopía confocal 9, con tiempos de exposición muy rápidos. En nuestra aplicación, debemos la imagen durante largos períodos, registro de las pilas en 3D y en última instancia, resolver los pequeños-cerca de difracción de estructuras limitadas. Aunque microscopio confocal evita fuera del foco de luz de cada vez que llega al detector y por lo tanto reduce significativamente fondo en gruesos, densamente-etiquetados muestras 7, 8, sólo se logra una utilizable relación señal-ruido con entrada de luz mucho más grande que amplio microscopía de campo 10. Para sparsel muy sensible a la luzmuestras y marcados como los cortes electroporated de la médula espinal, por lo tanto, toda la microscopía de campo se comporta mejor que la microscopía confocal. Cuando se combina con la restauración de imágenes por deconvolución, que elimina la información de atención y mejora el contraste de campo amplio es entonces particularmente bueno para la detección de objetos pequeños, débiles 11. Si bien no es apropiado para todos los experimentos de imagen del tejido, este enfoque ha sido muy eficaz para nuestra aplicación en directo imágenes de células.}

La elección de la proteína fluorescente es un factor importante que puede influir en la supervivencia celular. Nos parece que los mejores resultados se obtienen a partir de construcciones que utilizan la proteína verde fluorescente (GFP) ¹² como un marcador. Actualmente estamos evaluando una serie de proteínas fluorescentes rojas que pueden ser utilizados eficazmente en combinación con las buenas prácticas agrarias para el canal de doble lapsos de tiempo. Hay una variedad de tales proteínas disponibles ^13. Aunque muchas proteínas son estables como fusiones con una proteína fluorescente, Algunas proteínas pueden volverse inestable por fusión, dando como resultado la viabilidad celular reducida. En tales casos, el uso de construcciones que contienen un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES) es útil para separar la proteína de interés a partir de la proteína fluorescente.

Cuando las rebanadas de imágenes de la médula espinal, se debe tener cuidado para minimizar la exposición a la luz fluorescente. Los oculares del microscopio debe ser utilizado sólo con luz transmitida (campo claro) para localizar y posición de las rebanadas. Imágenes fluorescentes siempre deben ser adquiridas utilizando el software de microscopio utilizando el mínimo tiempo de exposición. Estos deben mantenerse en el intervalo de 5-50 ms y el uso de filtros de densidad neutra se debe experimentar. A pesar de los tiempos de exposición más largos al principio puede producir imágenes más nítidas, los efectos de la exposición fototóxicas luz fluorescente puede conducir a la muerte celular. Los primeros 5-10 micras de tejido que está más cerca del cubreobjetos no debe ser reflejado ya que esta región contiene tejido que pueden haber sufrido daños durante elrebanar.

Aunque los ejemplos presentados aquí son de embriones en la etapa electroporadas HH 10 y fotografiado 6-7 horas más tarde, este método puede ser utilizado para los embriones hasta HH etapa 18. En etapas posteriores, el tejido de la médula espinal es mucho más grande y por lo tanto es difícil de cortar con la mano. En estos casos, la incorporación de los embriones en el bajo punto de fusión de agarosa, y se seccionó con un vibratome puede producir mejores resultados. A pesar de que presentan este ensayo como un método para células de imagen en la médula espinal en desarrollo, este enfoque también ha sido modificado para la imagen de otros tejidos embrionarios, incluyendo la sensorial placodas ^3.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Willco Dish	Willco Wells	GWst-3522
poli-l-lisina	Sigma	P8970	0,1% en Tris
Vidrio borosilicato capilares	Instrumentos de Harvard	GC100-10	Diámetro exterior de 1,0 mm, Diámetro interior 0.58mm
Electrodos (Genetrodes ovo, en forma de L	BTX	10-001850-01	5 mm chapada de oro
ECM 830 cuadrada del generador de impulsos	BTX	45-0002	en electroopration ovo
Fast Green	Sigma	F7258
El colágeno tipo I de rata	Sigma	C3857
Medio L-15 (en polvo)	Sigma		2,76 g / l en agua destilada para solución 5x
De bicarbonato de sodio	Sigma	S8761	7,5% de solución
Medio Neurobasal	Invitrogen	12348-017	sin rojo fenol
Glutamax	Invitrogen	A1286001	Solución de 100x
B-27 suplemento	Invitrogen	17504-044
Gentamicina	Invitrogen	15710049	10 mg / ml
L15 (líquido 1x)	Invitrogen	11415-049
Microknife	Altomed	A10102	15 grados de inclinación
Inoxidable pasadores de acero sin cabeza	Watkins y Doncaster	E6871	Tamaño A1
Sylgard 184 elastómero	VWR	634165S
Core DeltaVision sistema de microscopio	Applied Precision
Coolsnap HQ2 cámara CCD	Fotometría