Vídeo-oculografía en ratones

Resumen

Vídeo-oculografía es un método muy cuantitativa para investigar el rendimiento motor ocular, así como el aprendizaje motor. A continuación, describimos la forma de medir vídeo-oculografía en ratones. La aplicación de esta técnica en normal, tratamiento farmacológico o ratones modificados genéticamente es una poderosa herramienta de investigación para explorar la fisiología subyacente de comportamientos motores.

Resumen

Los movimientos oculares son muy importantes con el fin de realizar un seguimiento de un objeto o para estabilizar una imagen en la retina durante el movimiento. Los animales sin una fóvea, tales como el ratón, tienen una capacidad limitada para bloquear sus ojos sobre un objetivo. En contraste con estos movimientos de los ojos dirigidos objetivo, los movimientos oculares compensatorios oculares son fácilmente provocó en los animales afoveate ^1,2,3,4. Los movimientos oculares compensatorios se generan mediante el procesamiento de la información vestibular y optocinético en una señal de comando que conducirá a los músculos del ojo. El procesamiento de la información vestibular y optocinético puede ser investigado por separado y juntos, lo que permite la especificación de un déficit en el sistema motor ocular común. El sistema motor ocular común se puede probar que evoca un reflejo de optocinético (okr), reflejo vestíbulo-ocular (VOR) o una forma visual mejorada reflejo vestíbulo-ocular (VVOR). El okr es un movimiento reflejo que compensa "de campo completo" movimientos de la imagen en la retina, mientras que el VOR es un reflejo de los ojos movimiento que compensa los movimientos de cabeza. El VVOR es un reflejo de movimiento de los ojos que utiliza tanto vestibulares, así como información optocinético para hacer la compensación apropiada. El cerebelo controla y es capaz de ajustar estos movimientos oculares compensatorios. Por lo tanto, oculografía es una herramienta muy poderosa para investigar la relación cerebro-conducta en condiciones normales, así como en condiciones patológicas (fe de ocular vestibular, y / o el origen del cerebelo).

Pruebas del sistema motor ocular común, como paradigma de comportamiento, es interesante por varias razones. Primero, el sistema motor ocular es un sistema bien entendido neuronal ^5. En segundo lugar, el sistema motor ocular es relativamente simple ^6, la cantidad de movimiento de los ojos es posible está limitado por su bola en toma de la arquitectura ("sola articulación") y los tres pares de músculos extraoculares ^7. En tercer lugar, la salida del comportamiento y la entrada sensorial puede medirse fácilmente, lo que hace que este un sistema muy accesible para cuantitativaanálisis ^8. Muchos carecen de pruebas de comportamiento de este alto nivel de poder cuantitativo. Y, por último, tanto el rendimiento, así como la plasticidad del sistema motor ocular común se puede probar, lo que permite la investigación sobre procesos de aprendizaje y de memoria ^9.

Los ratones modificados genéticamente son hoy en día ampliamente disponible y que constituyen una fuente importante para la exploración de las funciones cerebrales en los distintos niveles ^10. Además, pueden ser utilizados como modelos para imitar enfermedades humanas. La aplicación de oculografía de lo normal, tratamiento farmacológico o ratones modificados genéticamente es una poderosa herramienta de investigación para explorar la fisiología básica de los comportamientos motores en condiciones normales y patológicas. A continuación, describimos la forma de medir vídeo-oculografía en ratones ^8.

Protocolo

1. Preparación

Los siguientes experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con el Comité Ético de Duch experimentos con animales.

1. Preparación de los ratones para el vídeo-oculografía. Con el fin de medir movimientos oculares de un ratón, la cabeza del ratón necesita ser inmovilizada. Por lo tanto, una construcción del pedestal se hace en el cráneo del ratón (Figura 1).
   1. Se anestesia el ratón por una mezcla de isoflurano (isofluran 1-1,5%; Rhodia Organique Bellas Ltd, Francia) y el oxígeno en una cámara de gas. El exceso de gas está eliminado. Mantenimiento de la anestesia a través de cono de la nariz. Confirmar profundidad de la anestesia a través de un sujetador del pie.
   2. Mantener la temperatura corporal a 37 ° C con el uso de un termosensor anal y una almohadilla de calor (CHF, Bowdoinham, ME).
   3. Proteger los ojos, cubriéndolos con una pomada para los ojos (Duratears, Alcon, Bélgica). Afeitarse la piel del cráneo dorsal, y limpiar el área quirúrgica con una rotación de monte bajo y betadine o solución de clorhexidina.
   4. Haga una incisión de línea media para exponer la superficie dorsal del cráneo del cráneo. Hacer la superficie limpia y seca.
   5. Aplique una gota de ácido fosfórico (ácido fosfórico en gel grabador 37,5%; Kerr, CA) en la superficie dorsal del cráneo de la calavera de bregma a lambda. Retire el grabador después de 15 segundos y hacer que la superficie craneal limpieza con solución salina y secar de nuevo.
   6. Aplicar en la parte superior de esta superficie grabada del cráneo una gota de OptiBond principal (Kerr, CA) y secar al aire durante 30 segundos.
   7. Ponga una gota de adhesivo OptiBond (Kerr, CA) en la parte superior de la primera OptiBond y curar con la luz durante 1 minuto (480 Maxima unidad visible de fotopolimerización; Henry Schein, EE.UU.).
   8. Cubrir la capa de adhesivo con una capa delgada de Carisma compuesto (Heraeus Kulzer, Alemania). Incluye dos tuercas conectados (diámetro: 3 mm) en el compuesto. Curar la tarde compuesto con la luz. Cuando es necesario, aplique capas adicionales de compuesto y curarlos con la luz.
   9. Anuncioministro de la buprenorfina (0,015 mg / kg, sc) para la analgesia postoperatoria. El animal debe estar de vuelta en sus pies dentro de aproximadamente 5 minutos. Permitir el ratón para recuperar en la jaula de alojamiento a temperatura ambiente durante al menos 3 días después de la cirugía.
2. Vídeo-oculografía configuración para los ratones (Figura 2).
   1. Coloque el ratón en el retenedor y fijar la cabeza a la inmovilización con dos tornillos (Figura 1). El ratón no necesita ser anestesiado para este procedimiento. El tiempo de restricción no debe exceder de 1 hora / día.
   2. Montar el ratón de cabeza y cuerpo inmovilización sobre una plataforma XY, que a su vez está montado sobre la mesa giratoria (diámetro: 60 cm). Utilizando la plataforma XY la cabeza del ratón se puede colocar por encima del centro del plato giratorio. El ratón se puede mover a través de los ejes de cabeceo, guiñada y balanceo. La cabeza del ratón se coloca en el tono correcto de guiñada y el ángulo de balance mediante la alineación de los ojos con la imagen visual del ojo generado por el syste iSCANm. Alternativamente, la construcción del pedestal se puede colocar sobre la cabeza de ratón en un marco estereotáctico ^11.
   3. El plato giratorio está conectado a un AC servo-controlado del motor (AG armónica unidad, los Países Bajos) y la posición de la plataforma giratoria es controlada por un potenciómetro (Bourns inc., CA) unido al eje del plato giratorio.
   4. Una pantalla cilíndrica que rodea (diámetro: 63 cm, altura: 35 cm) con un patrón aleatorio de puntos (cada elemento 2 °) se refiere a la plataforma giratoria, este tambor también está equipado con un adaptador AC servo-controlado del motor (unidad armónica AG, los Países Bajos) . La posición de la pantalla cilíndrica es controlada por un potenciómetro (Bourns inc., CA) unido a su eje y la pantalla puede ser iluminado por una lámpara halógena (20 vatios). Tanto la pantalla circundante y la plataforma giratoria son accionados independientemente.
   5. El movimiento de la mesa giratoria y pantalla rodea está controlado por un ordenador que está conectado a una interfaz de I / O (CED limitada, Cambridge, Reino Unido). Tables señales de la pantalla y alrededor de la posición se filtran (frecuencia de corte: 20 Hz), digitalizado por la interfaz de E / S y se almacenan en este equipo.
   6. El ojo del ratón está iluminado por tres emisores de infrarrojos (600 mW, el ángulo de dispersión: 7 °, el pico de longitud de onda: 880 nm, RS componentes, los Países Bajos). Dos emisores de infrarrojos se fijan a la plataforma giratoria y el emisor tercero está conectado a la cámara. Este emisor tercera produce una reflexión de referencia corneal (RC), que se utiliza durante el procedimiento de calibración y durante las grabaciones movimiento de los ojos.
   7. Una cámara CCD de infrarrojos equipado con un lente de zoom (Zoom 6000, Navitar inc., Nueva York) se une a la plataforma giratoria y se centra en la cabeza del ratón en el centro del plato giratorio. La cámara puede ser desbloqueado y se puede orientada en torno al eje plato más exactamente el 20 ° durante el procedimiento de calibración.
   8. La señal de vídeo es procesada por un sistema de seguimiento del ojo (ETL-200, iSCAN, Burlington, MA). El sistema utiliza un algoritmo iSCANalgoritmo para realizar un seguimiento de los centros de la pupila y el CR de referencia. El sistema puede rastrear la pupila y CR referencia en dirección horizontal y vertical en una frecuencia de muestreo de 120 Hz..
   9. La posición de referencia CR, posición de la pupila y las señales de tamaño de las pupilas son digitalizadas por la interfaz de E / S y se almacenan en el mismo archivo que la mesa y en torno a las señales de posición de la pantalla. El video de alumnos por el sistema de seguimiento induce un retraso de las señales de movimiento de los ojos de unos 27 ms.

2. Calibración y medición de los movimientos de los ojos utilizando vídeo de seguimiento del alumno

El sistema de seguimiento del ojo capta el movimiento de la pupila como un movimiento de traslación. El movimiento de traslación de la pupila rastreados contiene un componente de traslación axial debido a la diferencia entre el centro de rotación del ojo y el centro anatómica del ojo (es decir, el centro de curvatura de la córnea), y un componente de rotación debido a la rotación angular del globo ocular. Al restarING en el CR referencia del movimiento pupila / posición, el componente de traslación no deseado se elimina de la señal, dando lugar a un movimiento de traslación que es sólo debido a la rotación del globo ocular. A pesar de que son a menudo muy pequeña, esta sustracción también elimina las traducciones entre la cabeza y la cámara. El movimiento de traslación residual aislado se convierte en la rotación angular del globo ocular por el método de calibración siguiente ^8,12. Esta calibración se llevó a cabo antes de cualquier experimento de movimiento de los ojos.

1. Ajustar la posición de la cabeza del ratón a la cámara de tal manera que la imagen de vídeo de la pupila está situado en el centro de la pantalla y que la representación de la CR de referencia se encuentra en la línea media vertical del ojo preferiblemente directa por encima de la pupila. Minimizar los movimientos de la CR de referencia debido a las rotaciones angulares de la cámara, que se pueden lograr mediante la colocación del centro de la curvatura de la córnea durante el eje de la cámara / tabla.
2. Girar la cámara varias veces por + / - 10 ° (es decir, 20 grados pico a pico) alrededor del eje vertical de la mesa giratoria. Utilizar las posiciones de la pupila a orugas (P) y el CR referencia registrados en las posiciones extremas de la rotación de la cámara para calcular el radio de rotación de la pupila (Rp; Rp = Δ / sen (20 °); donde Δ = (CR -P), véase la Figura 3A).
3. Debido al hecho de que el valor de Rp depende del tamaño de la pupila, una corrección de tamaño de la pupila necesita ser implementado ¹² (Figura 3B). Repetir el paso 2.2 muchas veces bajo condiciones de iluminación diferentes (es decir, la manipulación del tamaño de la pupila; Figura 3C) con el fin de determinar el tamaño de la pupila - relación Rp y componer una curva de corrección de Rp (Figura 3D). El valor de Rp también depende de la posición del ojo vertical. Cuando el experimento hará que los movimientos verticales de los ojos y luego una corrección de la calibración de las posiciones verticales de los ojos es altamente recomendable13.
4. Determinar la posición angular del ojo (E) midiendo la posición de referencia RC, la posición P y el tamaño de la pupila. La posición de referencia RC se resta de la posición de la pupila generar una posición traslacional alumno libre. Al medir el tamaño de la pupila del valor de Rp puede ser extraído de la curva de corrección Rp y E puede ser calculada mediante la siguiente fórmula: E = arcsen {(Δ1) / Rp} (Figura 4A; donde Δ1 = (P _{2-P 1)} y P ₁ y P ₂ son corregidos por la sustracción de la CR de referencia).
5. Un amplio repertorio de la placa giratoria y / o rotaciones alrededor de la pantalla ahora se puede utilizar para estimular el sistema motor ocular común. Con el fin de realizar oculografía vídeo en la oscuridad, el ojo del ratón necesita ser pretratados con un fármaco miótico para limitar la dilatación de la pupila y permitir el seguimiento de pupila en estas circunstancias. En nuestros experimentos, usamos pilocarpina (4%, los laboratorios de Chauvin, Francia) para limitar la dilatación de la pupila en ella oscuridad.

3. Análisis de Datos

1. Posición de los ojos, las posiciones de mesa y alrededor de las posiciones de la pantalla están todos convertidos en posiciones angulares (véase la Figura 4B y la fórmula en el punto 2.4). Las señales de los ojos son corregidos por su retraso de 27 ms inducida por el procesamiento de imágenes del sistema de seguimiento de alumnos.
2. Posiciones angulares de los ojos, mesa y pantalla circundante se diferencian y se filtró con un Butterworth de paso bajo filtro utilizando una frecuencia de corte de 20 Hz.
3. Sacadas se eliminan de la señal de velocidad ojo usando un umbral de detección de 40 ° / s. Los datos se extrae a partir de 20 ms antes y hasta 80 ms después de cruzar el umbral de detección.
4. Mesa, que rodea la pantalla y las señales de velocidad de los ojos son un promedio de uso de cada ciclo individual en la pista (Figura 4C).
5. Señales promediadas están equipados con una función adecuada. En general, una estimulación velocidad senoidal se utiliza y se promediaron losciclos están equipados con seno o función coseno (Figura 4C). Entonces, la ganancia se puede calcular como el cociente de la velocidad del ojo a la velocidad de estímulo, mientras que la fase se puede calcular como la diferencia (en grados) entre la velocidad del ojo y la velocidad de estímulo.

4. Los resultados representativos

Vídeo-oculografía se puede utilizar para investigar las diversas formas de actuaciones oculomotores (es decir, reflejo optocinético: okr; reflejo vestíbulo-ocular: VOR, visualmente mejorada reflejo vestíbulo-ocular: VVOR), así como el motor de aprendizaje (adaptación VOR, la adaptación okr). El okr compensa las perturbaciones de baja frecuencia que utilizan información visual. El okr puede ser inducida por rotación de la pantalla bien iluminada circundante (Película 1). Rotación de la pantalla que rodea a un rango de frecuencia de 0,2 -1,0 Hz con una amplitud de 1,6 ° se muestra cómo el sistema optocinético es un mecanismo de compensación más eficiente en el intervalo de baja frecuencia Than en el intervalo de alta frecuencia (Figura 5A). El VOR compensa los movimientos de cabeza de alta frecuencia que utilizan las señales de los órganos vestibulares. El VOR puede ser inducida por rotación del animal (es decir, tocadiscos) en la oscuridad (Película 2). Al girar el plato sobre un rango de frecuencia de 0,2 -1,0 Hz con una amplitud de 1,6 ° se muestra cómo el sistema vestíbulo-ocular es más eficiente en la generación de movimientos compensatorios de los ojos en el rango de alta frecuencia que en el rango de baja frecuencia (Figura 5) . Cuando el acto sistema optocinético y vestíbulo-ocular en concierto, las imágenes pueden ser estabilizados en la retina sobre una amplia gama de movimientos de la cabeza. Al girar el plato sobre un rango de frecuencia de 0,2 -1,0 Hz con una amplitud de 1,6 °, mientras que la pantalla de los alrededores está bien iluminada (Movie 3) muestra cómo el ojo genera "gran ganancia" movimientos de compensación en el rango de frecuencias (Figura 5A ). Todos estos ganancia y el pHLos valores son típicos para ase ratones, a pesar de las diferencias de género ¹⁴ y ^15,16,17 cepa se informó.

El control independiente sobre el plato giratorio y la pantalla que rodea nos permite hacer frente a los ratones con una falta de correspondencia entre la información visual y vestibular. Después de una exposición a largo plazo y uniforme de la información visual y vestibular no coinciden, el VOR del ratón cambiará para compensar la entrada de alteración visual (adaptación VOR; Movie 4). Al girar el plato giratorio fuera de fase (es decir, 180 °) con la pantalla circundante (1 Hz, 1,6 °) aumenta la ganancia VOR (Figura 5B). El cambio máximo en el aumento de VOR, cuando se utiliza un paradigma de prueba de un aprendizaje, a menudo se alcanza después de 30 minutos.

Figura 1. Esquema del ratón de cabeza y cuerpo de inmovilización. El cuerpo del ratón está restringido utilizandoun tubo de plástico cilíndrico con un diámetro de 35 mm. La cabeza del ratón se inmoviliza mediante la conexión del pedestal del ratón en la barra de hierro con dos tornillos. La barra de hierro forma un ángulo de 30 grados con el fin de posicionar la cabeza del ratón en el terreno de juego normal, durante la deambulación. *, Vista desde arriba del pedestal que contiene dos tuercas.

Figura 2. Esquema del ratón video oculografía configuración.

Figura 3. Calibración del video de alumnos por el sistema de seguimiento. A) La cámara se gira varias veces por + / - 10 ° (es decir, 20 grados pico a pico) alrededor del eje vertical de la mesa giratoria. La pupila orugas (P) y la reflexión de referencia corneal (RC) registradas en las posiciones extremas de la rotación de la cámara se utilizan para calcular el radio de rotación de la pupila(Rp). B) El radio de la diámetro de la pupila es dependiente del tamaño de la pupila. C) Ejemplo muestra el efecto del tamaño de la pupila en posición de la pupila durante el procedimiento de calibración (ambos medidos en píxeles (px)). D) Relación entre Rp y diámetro de la pupila se mide en un solo ratón. Los diámetros diferentes trece alumno se logra mediante la alteración de la intensidad de la luz ambiente.

Figura 4. Medición y análisis de los movimientos de los ojos utilizando vídeo de seguimiento de alumnos. A) La posición de la pupila angular se calcula a partir de radio de la pupila (Rp) y la posición de la pupila (P; corregida para la posición de CR). B) Ejemplo de movimiento de los ojos compensatoria inducida por la estimulación del sistema vestibular y visual (visual mejorada VOR). El plato se hizo girar sinusoidalmente a 0,6 Hz con una amplitud de 1,6 °, mientras que la pantalla que rodea era bien iluminado. C) Análisis de la grabaciónse muestra en B). El gráfico muestra la traza de la velocidad promedio de la mesa giratoria (azul) y la pupila (rojo). Estos rastros promedio fueron equipados con una función sinusoidal (negro).

Figura 5. Desempeño y el aprendizaje del sistema motor ocular se mide en una C57BL6 ratón. Los movimientos de un ojo) son generados por la rotación de la pantalla que rodea (optocinético reflejos: paneles okr, arriba), haciendo girar el ratón en la oscuridad (reflejo vestíbulo-ocular: VOR, paneles de media) y haciendo girar el ratón a la luz (de forma visual mejorada reflejo vestíbulo-ocular: VVOR, panel inferior) en las frecuencias comprendidas entre 0,2 y 1,0 Hz a una amplitud de 1,6 °. La ganancia del reflejo se calculó como la relación de la velocidad del ojo a la velocidad de estímulo (paneles de la izquierda) y la fase del reflejo se calcula a partir de la diferencia de fase entre la velocidad del ojo y la velocidad de estímulo (paneles de la derecha). B) El motor de aprendizaje se llevó a cabo por adaptativamente el aumento de la VOR utilizando un paradigma de la fase de entrenamiento. El ratón fue sujeto a un paradigma de formación visuovestibular en el que la rotación del ratón estaba fuera de fase (180 °) con la rotación de la pantalla circundante (tanto giratoria en 1,0 Hz, 1,6 °) durante cuarenta minutos. Cada 10 minutos se puso a prueba el VOR (1,0 Hz, 1,6 °). En este ratón de la formación de fase aumentó la ganancia del RVO.

Película 1. Animación que muestra el paradigma que induce en ratones okr Haz clic aquí para ver la película .

Película 2. Animación que muestra el paradigma que induce VOR en ratones. Haga clic aquí para ver la película .

Película 3. Animación que muestra el paradigma que induce VVOR en ratones..com/files/ftp_upload/3971/3971movie3.mov "target =" _blank "> Haga clic aquí para ver la película.

4 Película. Animación que muestra la salida visuovestibular de paradigma fase de entrenamiento que induce a la adaptación VOR (aumento) en ratones. Haga clic aquí para ver la película .

Discusión

Con el fin de obtener alta calidad de video movimientos oculares grabaciones en ratones varios requisitos son necesarios. El procedimiento de calibración debe realizarse en la materia mencionada estandarizado. Por ejemplo, fuera del centro de calibración, cuando el alumno no se coloca en la línea media vertical con el CR de referencia durante el procedimiento de calibración, se traducirá en una subestimación de la RP y, en consecuencia una sobreestimación de los movimientos oculares. Además, se recomienda la integración del tamaño de la pupila método de corrección en el procedimiento de calibración de ^12, ya que los estudios que muestran un tamaño de la pupila muy estable son muy raros. Incluso un pequeño factor de estrés durante el juicio ya se puede alterar el diámetro de la pupila sustancialmente.

Cuando se diseña un experimento de movimiento de los ojos, los siguientes factores deben ser tenidos en cuenta o bajo el control de porque se sabe que afectan la respuesta de movimiento de los ojos: la edad ^13,18, el género y la tensión ^{14 15,16}, 19. Además, el animal experimental debe tener iris pigmentados ya que la detección pupila y el seguimiento es imposible cuando el contraste entre la pupila y el iris es demasiado baja, como en el ratón BALB / c. Animales muy nerviosos o ansiosos necesitan ser entrenados, antes del experimento, para acostumbrarse a la instalación experimental y de la condición restringida. Este animal el manejo de los resultados del procedimiento en menos de cierre o semi-cierre de los ojos y evita la generación de los líquidos del ojo durante el experimento, y por lo tanto un seguimiento de alumnos se logra mejor.

Por último, la adquisición y el análisis de los datos requiere de dos a tres horas por los animales. Por lo tanto, las grabaciones movimiento de los ojos probablemente se mantendrá un procedimiento específico aplicado a ratones seleccionados y no es adecuado como un ensayo de cribado de alto.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo
Isofluran	Rhodia Organique Bellas LTD
Almohadilla eléctrica	FHC	40-90-8
Duratears	Alcon
Gel de ácido fosfórico	Kerr	31297
Optibond primer	Kerr	35369
Optibond adhesiva	Kerr	35369
Carisma compuesta	Heraeus Kulzer
Maxima 480 luz de la unidad de curado	Henry Schein
AC servo-controlado del motor	Harmonic Drive AG
Cylpantalla de indric
Luz halógena (20 W)	RS Components
Potenciómetros (precisión)	Bourns inc.	6574
Poder 1401 (interfaz E / S)	CED limitada
Computadoras	Dell
Emmitters infrarrojos	RS Components	195-451
ETL-200	ISCAN
Zoom (zoom 6000)	Navitar inc.
Pilocarpinenitrate (Mínimos)	Laboratorio Chauvin