Análisis de la transcripción de genes de una sola célula de ARN fluorescente<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación (FISH)

Resumen

Fluorescente In situ (FISH) para identificar las transcripciones de mRNA en células individuales permite el análisis de la actividad poligénica tales como la transcripción simultánea de más de un miembro de la Var Multigene familia en Plasmodium falciparum Eritrocitos infectados ¹. La técnica es adaptable y puede ser utilizado en diferentes tipos de genes, células y organismos.

Resumen

La adhesión de Plasmodium falciparum eritrocitos infectados (IE) a receptores humanos endoteliales durante las infecciones de malaria está mediada por la expresión de PfEMP1 variantes de proteínas codificadas por los genes var.

El P. haploide falciparum genoma alberga aproximadamente 60 genes diferentes var de que ha sido único que se cree que ser transcrito por célula en un momento durante la fase sanguínea de la infección. Como tal regulación mutuamente excluyente de la transcripción de genes var que se logra es clara, ya que es la identificación de los genes var individuales o subgrupos de genes var asociados con diferentes receptores y la consecuencia de unión diferencial sobre el resultado clínico de P. infecciones por P. falciparum. Recientemente, el paradigma de la transcripción mutuamente excluyentes ha sido puesta en duda por los ensayos de transcripción basado en individuo P. falciparum identificación única transcripción en infeja células eritrocitarias utilizando ARN hibridación in situ fluorescente (FISH) El análisis de la transcripción de genes var por el parásito en los núcleos individuales de P. falciparum IE ^1.

Aquí, se presenta un protocolo detallado para llevar a cabo la metodología de ARN-FISH para el análisis de la transcripción de genes var en un solo núcleo de P. falciparum infecta los eritrocitos humanos. El método se basa en el uso de digoxigenina y biotina marcado con sondas de ARN antisentido utilizando el TSA Plus fluorescencia sistema de paletas ² (Perkin Elmer), los análisis microscópicos y recién seleccionado P. falciparum IE. El método de hibridación in situ se puede utilizar para controlar la transcripción y la regulación de una variedad de genes expresados ​​durante las diferentes etapas de la P. ciclo de vida falciparum y es adaptable a otras especies de parásito de la malaria y otros organismos y tipos de células.

Protocolo

1. La generación de recién seleccionada eritrocitos infectados

Para este ensayo, los mejores resultados se obtienen cuando se utilizan cultivos recién seleccionadas para la expresión en superficie de la proteína PfEMP1. En este experimento particular la P. 3D7 linaje falciparum fue seleccionado utilizando anticuerpos específicos como se ha descrito anteriormente ^1.

Día 1

1. Cosecha de 200 l de células de sangre envasados ​​de una P. falciparum cultivo que contiene 2-5% IE etapa tardía por centrifugación a 800 xg durante 8 minutos a temperatura ambiente.
2. Se resuspende el sedimento en sangre 2 ml de 37 ° C cálido solución 0,75% de gelatina en un tubo de 14 ml estéril, y se deja durante 15-20 min a 37 ° C para permitir que el IE no infectado y anillo etapa-a sedimentos.
3. Se recoge el IE en etapa tardía, es decir, la fase superior, en un tubo de 14 ml nuevo y se lava dos veces con 10 ml de 37 ° C cálidos RBC-medios de lavado.
4. Diluir 50 l de anticuerpos específicos anti-PfEMP1 anticuerpos en 2 ml de 37 ° C cálidos RBC-medios de lavado y filtro estéril.
5. Mezclar el lavado la fase final del IE con los antisueros esterilizado diluida en un tubo de 14 ml estéril y se incuba durante 30 min a 37 ° C con agitación suave.
6. Centrifugue a 800 xg durante 8 minutos a temperatura ambiente, y se lava dos veces con 10 ml de 37 ° C cálidos RBC-medios de lavado.
7. Lávese 50 l de Proteína Dynabead Una suspensión dos veces con RBC-lavado de los medios de comunicación utilizando un imán DynaMaq-15.
8. Resuspender las Dynabeads en 300 L RBC-lavado de los medios de comunicación y añadirlos a la última etapa de lavado IE. Incubar durante 30 min a 37 ° C con agitación suave.
9. Transferir el tubo en el imán DynaMaq-15. Dejar reposar 1-2 minutos y retirar todo el líquido.
10. Resuspender las Dynabeads en 4-5 ml de RBC-lavado de medios de comunicación. Transfiera la parte posterior del tubo en el imán y se deja durante 1-2 minutos antes de retirar todo el líquido. Repetir la etapa de lavado una vez.
11. Transfiera las perlas lavadas a un 25 cm ² f cultivo estérillask contiene 200 mu l recién concentrados de glóbulos rojos. Añadir 5-6 ml de Albumax medios de comunicación en la cultura. Guarde la noche a 5% de CO ₂ a 37 ° C.

Día 2

12. Eliminar las Dynabeads de la cultura cuando la IE ha seleccionado reinvadido las células rojas de la sangre fresca mediante la transferencia de todo el cultivo a un tubo de 14 ml estéril. Poner el tubo en el imán DynaMaq-15 y se deja durante 1-2 min. Luego, vierta todo el líquido nuevamente a un frasco de cultivo.
13. Cultura para el mayor número posible de ciclos hasta un 5-10% de parasitemia y los parásitos se encuentran en el ringstage.
14. Es decir, se analizaron por FACS para asegurarse de que el fenotipo de la superficie correcta, es decir, la expresión de la proteína de cualquiera de and/orPF11_0008 PFD1235w se ha obtenido ^1.

2. Preparación de sondas

Las sondas de ARN antisentido se generaron a partir de las regiones más variables de la PFD1235w y la var PF11_0008 </ Em> genes de P. falciparum 3D7 ADN genómico. El ADN fue amplificado por PCR y clonado en el vector pSPT18 o 19 para la transcripción, respectivamente de acuerdo con la descripción del fabricante (Roche). Las sondas (580 pares de bases (pb) y 590 pb de longitud) fueron marcadas con digoxigenina (DIG) o biotina usando un kit de marcaje de ARN DIG o una mezcla de biotina ARN etiquetado, respectivamente. Se confirmó la especificidad de las sondas tanto por análisis de transferencia Northern y por una sola etiqueta análisis FISH ^1.

3. Frotis delgado y fijación de los parásitos antes de la hibridación in situ

Día 1

Todos los pasos se realizan en un ambiente libre de RNasa y todos los reactivos son RNasa libre o pre-tratado con pirocarbonato de dietilo (DEPC) o RNasa Zap (Invitrogen). Los portaobjetos y cubreobjetos debe limpiarse con alcohol para eliminar la grasa residual de fabricación. Es importante realizar el protocolo sin ninguna pausa entre pasoscon el fin de minimizar el riesgo de contaminación con nucleasas.

1. Hacer una película delgada de sangre por el método estándar de difusión ^3. Usando el lente objetivo 100x aceite del microscopio, cuente el IE y calcular el porcentaje de IE en la cultura. Compruebe que las etapas de parásitos están en sincronía aproximada, en el ring y las primeras etapas del ciclo de trofozoíto IE. Estos son el pre-replicación, etapas uni-nucleado, que expresan mRNA del gen var y adecuado para ensayos de células individuales de transcripción de peces de este tipo.
2. Transferir 50 l de la cultura parásito, a una parasitemia de 5-10%, a un 1,5 ml de RNasa libre de tubo Eppendorf. Centrifugar durante 1 min a 2.000 rpm a temperatura ambiente.
3. Retire el papel y añadir 50 l de PBS pH 7,2 en agua tratada con DEPC. Agite suavemente el tubo. Repetir la etapa de sedimentación centrífuga dos veces para lavar las células libres de los medios de comunicación y los residuos celulares.
4. Haga cuatro buenos frotis finos de calidad. Para cada mancha, hacer un frotis enuno de 11 mm de diámetro y de una diapositiva 4 bien, es decir, cuatro placas de vidrio en total, en una campana de RNasa libre (un paso crítico). Wave desliza brevemente en el aire para secar. Hacer tres diapositivas adicionales para controles de frotis negativo y uno para la tinción única sonda para cualquier gen no pertinente mediante el uso de una sonda específica, otra diapositiva para el tratamiento de RNasa y una tercera diapositiva que contiene IE no expresan el gen de interés. Deje que los portaobjetos se sequen en el banquillo durante 10-20 min.
5. Fijar las películas delgadas mediante la adición de 60 l de solución de fijación que contiene 4% de paraformaldehído y 5% de ácido acético glacial en los pocillos. Dejar durante 10 minutos en el banquillo a temperatura ambiente.
6. Lavar los portaobjetos en tampón SSPE 2x por 5 min por agitación suave a temperatura ambiente. Brevemente eliminar el exceso de líquido al tocar los pocillos que contienen las células suavemente con un pañuelo de papel.
7. Cubrir los portaobjetos con 0,01% de pepsina en HCl 0,01 M durante 2 min a 37 ° C (un paso extremadamente crítico). Lavar los portaobjetos en 2 x SSPE durante 5 min a temperatura ambiente.
8. Diluir la solución de RNasa hasta una concentración final de 10 mg / ml. Cubrir los frotis de control negativo con 60 l de la solución de RNasa. Incubar durante 30 min a 37 ° C y lavar los portaobjetos en 2 x SSPE durante 5 min a temperatura ambiente.
9. Se procede inmediatamente a la etapa de hibridación.

4. La hibridación de sondas de ARN a las diapositivas fijas

Día 1

1. Prepare la cámara de hibridación, como un Thermostar 100 HC4 o una caja de puntas de pipeta vacía puso en un horno limpio, rociando con RNasa Zap y límpiela con un pañuelo de papel. Llenar los canales de la cámara de hibridación o la parte inferior de la caja con agua tratada con DEPC para asegurarse de que los portaobjetos no se sequen durante la hibridación. Cerrar la cubeta y precalentar a 48 ° C.
2. Diluir las sondas en la solución de hibridación a una concentración final de 12 ng / l. Desnaturalizar la solución de sonda a 65 ° C durante 5 min en un bloque calefactor. Inmediatamente enfriar en hielo.
3. En pocas palabras Secar las preparaciones después del lavado 2x SSPE. Retire cuidadosamente el exceso de líquido alrededor de los pocillos con un pañuelo de papel.
4. Abra la cámara de hibridación y coloque las diapositivas en la cámara. Aplicar una o ambas sondas en un volumen total de 60 l por pocillo. Cubra cuidadosamente la caída de líquido con un cubreobjetos RNasa libre con unas pinzas estériles.
5. Cerrar la cámara y se hibridan los portaobjetos a 48 ° C durante al menos 16 horas durante la noche.

5. Conjugación de anticuerpo y amplificación de fluorescencia

Día 2

Los siguientes pasos se basan en el sistema de fluorescencia TSA Plus paleta de Perkin Elmer. Todos los pasos se realizan a temperatura ambiente.

1. Lavar los portaobjetos 3 veces en tampón TNT por 5 min con agitación suave.
2. Bloquear los pocillos en 150 l de tampón TNB para 30 min.
3. Diluir el conjugado HRP-α-DIG anticuerpo en tampón TNB en una proporción de 1:100 y el anticuerpo HRP-conjugado de α-biotina en tampón TNB, en una proporción de 1:500. Retire el exceso de buffer de TNB las diapositivas con un pañuelo de papel. Al detectar simultáneamente dos transcripciones, ambos anticuerpos pueden ir a la vez. Aplique una cantidad total de 100 ml de la solución de anticuerpo por TNB bien y con cuidado cubrir con un cubreobjetos. Incubar los portaobjetos durante 2 horas.
4. Quitar los cubreobjetos con cuidado. Lavar los portaobjetos en tampón TNT 3 veces durante 5 min.
5. Diluir la FITC-fluoróforo en el reactivo de amplificación tiramida en una proporción de 1:500 y se aplican 100 ml de la solución a cada pocillo. Cubrir los pocillos con cubreobjetos y se incuba durante 12 min.
6. Quite el cubreobjetos con cuidado y lavar los portaobjetos 3 veces durante 5 minutos en tampón de TNT por agitación suave.
7. Diluir la Cyan3-fluoróforo en el reactivo de amplificación tiramida en una proporción de 1:500. Añadir 100 l porasí de esta solución. Cubrir los pocillos con cubreobjetos y se incuba durante 12 min.
8. Quite el cubreobjetos con cuidado y luego enjuague los portaobjetos rápidamente por inmersión en una solución tampón TNT.
9. Lavar los portaobjetos 3 veces con tampón TNT por 5 min.
10. Sumergir los portaobjetos rápidamente en agua tratada con DEPC.
11. Deje que los portaobjetos se seque al aire. Montar las diapositivas con anti-fade reactivo que contiene DAPI. Selle las esquinas de las hojas de la cubierta con esmalte de uñas.
12. Los portaobjetos ahora está listo para la microscopía. Mantenga las diapositivas cubiertas con papel de aluminio y se almacenan a 4 ° C si el experimento se completará al día siguiente. Un sellado completo de los lados de las láminas puede llevarse a cabo 24 horas después de aplicar el reactivo anti-fade. Esto permitirá que las láminas se fotografió por hasta una semana después de que el protocolo se ha completado.

6. La visualización de las sondas hibridadas

1. Encender el microscopio. Un microscopio de inmunofluorescencia estándar es sufficient para este tipo de experimento, pero si usted tiene acceso a un microscopio confocal también puede usar esto para imágenes en 3D o para obtener los vídeos de las células teñidas. Permitir microscopio se caliente durante 15-30 min. Encienda el ordenador y el software.
2. Compruebe la calidad de la tinción al microscopio de inmunofluorescencia. Elija un lugar que contiene unos cuantos parásitos.
3. Ajuste la ganancia de cada láser manual. Ajuste el pixel de espera en 4-6 m ^-1 s ^-1 y los pasos a 512 x 512 píxeles.
4. Tome una fotografía de prueba utilizando Frame Lambda. Vuelva a ajustar la ganancia del láser.
5. Tome un mínimo de 20 buenas fotos de fluorescentes células individuales. Al menos 2-5 imágenes de un campo que contiene 5-20 parásitos son necesarios a fin de obtener una visión general ajustada del porcentaje de parásitos positivos.

Resultados

La Figura 1 ilustra un diagrama de flujo de los pasos principales y el tiempo de duración de la metodología de ARN FISH.

Una serie de imágenes representativas de bien y mal conservados experimentos manchadas de ARNm de peces utilizando solo P. falciparum IE se muestra en la Figura 2. Este protozoo intracelular tiene un pequeño (1-1.5 m de diámetro) núcleo que se tiñe de azul con DAPI. Veinticuatro horas después de la invasión de los eritroc...

Discusión

Análisis de ARN FISH, en contraste con los métodos tales como transferencia Northern y RT-PCR, permite la discriminación de los transcritos de ARNm específicos en el nivel de célula única. Esto hace que sea posible discriminar entre células transcripcionalmente activos e inactivos, en este ejemplo, P. falciparum protozoos parásitos dentro de los glóbulos rojos. Tales células enteras observaciones son a menudo necesarias y puede desentrañar los patrones transcripcionales importantes y novedosas ^1...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Ácido Acético	Sigma / Aldrich	338826-100ml
Albumax medios de comunicación: RPMI 1640 Glutamina solución	Lonza	BE12-115F	500 ml de medio RPMI 1640 5 ml de solución de glutamina
Albumax medios de comunicación: Gentamicina sulfato Albumax-solución	Lonza	BE02-012E	2,5 ml de gentamicina sulfato 50 ml de solución de Albumax
Albumax-solución: hipoxantina	Sigma-Aldrich	H9377	0,8 g de hipoxantina
Albumax-solución: Albumax II	Yonvitrogen	11021-037	200 g Albumax
Albumax-solución: RPMI 1640	Lonza	BE12-115F	4 litros RPMI 1640 Disolver con el imán en el máximo. 50 ° C. Filtrar esterilizar y almacenar a -20 ° C en alícuotas.
Amberlite	Sigma	A5710-110G	Resina para desionizar formamida.
Anti-biotina peroxidasa de cabra pAb	Calbiochem	203206
Anticuerpo anti-DIG	Novus Productos Biológicos	NB100-41330
Anti-fade reactivo con DAPI	Invitrogen	P36931	Los medios de montaje tiene que curar durante 24 h antes de sellar la corredera completamente.
La biotina RNA Labeling Mix	Roche	11685597910
Cámara digital de	Digital Nikon vista DC-F11
Cubreobjetos	Menzel-Glaser	631-1570
frasco de cultivo de 25 cm 2 de superficie Nunclon	Nunc	156340
DEPC	Fluka / Sigma	32490-100ml	1 ml DEPC en 1000 ml de agua deinonized. Añadir una barra de agitación y se agita durante 12 h. Esterilizar en autoclave durante 30 min.
Cámara digital	Digital Nikon vista DC-F11
Dynabeads Proteína A	Invitrogen	10002D
DynaMaq-15 Imán	Invitrogen	123-01D
Bioultra formamida 99%	Fluka/ Sigma	47671-1l-F	Formamida desionizada: 5 g de resina de intercambio iónico por 100 ml de formamida. Se agita 30 min. Filtrar a través de papel Whatman.
. 0 Gelatina solución al 75%: Gelatina	Sigma-Aldrich	G2500	3,75 g de gelatina en 500 ml de RPMI 1640. Calentar a 56 ° C para disolver. Filtrar esterilizar cuando 56 ° C. Almacenar a -20 ° C en alícuotas.
. Gelatina 0 solución de 75%: RPMI 1640	Lonza	BE12-115F	3,75 g de gelatina en 500 ml de RPMI 1640. Calentar a 56 ° C para disolver. Filtrar esterilizar cuando 56 ° C. Almacenar a -20 ° C en alícuotas.
La glutamina solución: L-glutamina	Sigma-Aldrich	G3126	14,6 g L-glutamina en 500 ml de NaCl al 0,9%. Disolver, filtro sterilize y almacenar a -20 ° C en alícuotas.
Glutamina solución: HCl	Sigma	H1758	14,6 g L-glutamina en 500 ml de NaCl al 0,9%. Disolver, filtrar esterilizar y almacenar a -20 ° C en alícuotas.
Solución de hibridación: formamida al 99% de ultra Bio SSC 20x	Fluka / Sigma	47671-1l-F	Total 20 ml, mantener congelado a -20 ° C en alícuotas 10 ml de formamida desionizada
Solución de hibridación: el concentrado 50x de Denhardt	Sigma	D2532	5ml 20xSSC
Solución de hibridación: Levadura tRNARoche reactivo de bloqueo	Sigma	R-6750	2 ml 50x Denhardt 250 l 20 mg por ml de ARNt de levadura
Solución de Hibridación: DNA de esperma de salmón	Fluka / Sigma	31149-106GF	0,4 g Roche reactivo de bloqueo 1 ml de 10 mg por ml de ADN de esperma de salmón (Critical: desnaturalizan salmón spermDNA a 96 ° C durante 5 min antes de añadir a la solución de hibridación)
Hybridizer Thermostar 100 HC4	Quantifoil Instruments GmbH	1004-0011	Puede ser reemplazado por el horno de hibridación y las cámaras de RNasa libre de hibridación rellenados con agua DEPC.
Inmersión en aceite UV transparente, libre de fluorescencia	Sigma	10976-1EA
Microscopio confocal de inmunofluorescencia o	Nikon D-Eclipse TE2000C
Nailpolish	Disponible en cualquier farmacia
20x PBS: NaCl KCl Na 2 HPO 4 x 2 H 2 O KH 2 PO 4 DEPC desionizada H 2 O			Adecuar el pH a 7,4 160 g 4 g 23 g 4 g 1 l
Paraformaldehído al 4%	Fluka / Chemika	76240	4 g PFA en 80 ml de PBS / DEPC. Calentar a 65 ° C hasta que se disuelve el PFA. Añadir 20 ml de PBS, permitir que la solución se enfríe. Ajustar el pH a 7,4. Filtrar. Almacenar en alícuotas a -20 ° C.
Paraformaldehído al 4% / ácido acético 5%			950 paraformaldhyde l de ácido acético + 50 l
Pepsina	Sigma / Aldrich	P7000
Conjugado con peroxidasa anti-biotina	Calbiochem	203206
RBC-wash medios de comunicación: RPMI 1640 Glutamina solución	Lonza	BE12-115F	500 ml de RPMI 1640 5 ml de solución de glutamina
RBC-wash medios de comunicación: Sulfato de Gentamicina	Lonza	BE02-012E	2,5 ml de gentamicina sulfato
RNasa	Sigma / Aldrich		Hacer una dosis de 10 mg / ml de solución madre.
RNasa libre de 1,5 ml tubo	Ambion	AM12450
RNasa Zap	Ambion	AM9780
Diapositivas 4 pozos de 11 mm	Thermo Scientific	MENZXER306W
20x SSC: NaCl	Sigma / Aldrich	S9625	3 M NaCl (175 g / l) 0,3 M Na citrato x 3 H 2 O (88 g / l) Ajustar a pH 7,0 con HCl 1M
SSC 20x: Citrato de sodio dihidrato	Sigma / Aldrich	W302600	3 M NaCl (175 g / l) 0,3 M Na citrato x 3 H 2 O (88 g / l) Ajustar a pH 7,0 con HCl 1M
SSPE 20x: NaCl	Sigma / Aldrich	S9625	175,3 g de NaCl
SSPE 20x: NaH 2 PO 4	Sigma / Aldrich	S0751	27,6 g NaH 2 PO 4.
SSPE 20x: 4 EDTA en polvo			9,4 g de EDTA en polvo Añadir agua DEPC, ajustar el pH 7,4. AutoHendió durante 20 min
TNB buffer: tampón TNT			10 ml tampón TNT
TNB búfer: reactivo de bloqueo			0,05 g de reactivo de bloqueo Para disolver el reactivo de bloqueo, se calienta la solución a 60 ° C durante una hora con agitación. Conservar a -20 ° C. (Derivado de la Perkin Elmer TSA-protocolo).
TNT tampón: Tris / HCl	Sigma	T1503	1 M Tris / HCl, pH 8,0
TNT buffer: NaCl	Sigma Aldrich	S9625	100 ml
TNT buffer: Tween20	Sigma	93773	5 M NaCl 30 ml 1 ml DEPC dH 2 O869 Ml Ajustar el pH a 7,5 a temperatura ambiente. (Derivado de la Perkin Elmer TSA-protocolo).
TSA más Cyanine3 / fluoresceína sistema	Perkin Elmer	NEL753000IKT	Leer el protocolo de la TSA Plus sistema de fluorescencia paleta cuidadosamente antes de iniciar el experimento.
Tubos de 14 ml estéril	Almeco - CM Aps LAB	91016