Perfiles de Polímeros Glycan la pared celular vegetal utilizando microarrays

Resumen

Una técnica llamada C Omprehensive M Icroarray P olymer (CoMPP) para la caracterización de los glicanos la pared celular vegetal se describe. Este método combina la especificidad de los anticuerpos monoclonales dirigidos a epítopos definidos glicano con una miniatura plataforma de microarrays analítico que permite detección de la ocurrencia de glicanos en una amplia gama de contextos biológicos.

Resumen

Paredes celulares de las plantas son matrices complejas de los glicanos heterogéneos, que desempeñan un papel importante en la fisiología y el desarrollo de las plantas y proporcionar las materias primas para las sociedades humanas (por ejemplo, industrias de la madera, papel, textiles y de biocombustibles) ^1,2. Sin embargo, la comprensión de la biosíntesis y función de estos componentes sigue siendo un reto.

Glucanos de la pared celular son químicamente y conformacionalmente diversa debido a la complejidad de sus bloques de construcción, los residuos de glicosilo. Estos forman uniones en las posiciones múltiples y difieren en estructura de anillo, configuración isomérica o anomérico, y además, están sustituidos con una matriz de no azúcar residuos. Glycan composición varía en células diferentes y / o tipos de tejidos o incluso sub-dominios de una sola célula de la pared ^3. Además, su composición también se modifica durante el desarrollo ^1, o en respuesta a señales ambientales ^4.

En exproceso de 2.000 genes tienen paredes celulares de las plantas son matrices complejas de los glicanos heterogéneos ha previsto que participen en la biosíntesis de la pared celular y la modificación de glicanos en Arabidopsis ^5. Sin embargo, relativamente pocos de los genes biosintéticos se han caracterizado funcionalmente ^4,5. Ida y enfoques de genética son difíciles debido a que los genes son a menudo expresados ​​diferencialmente, a menudo a niveles bajos, entre los tipos de células ^6. Además, los estudios mutantes son a menudo obstaculizado por la redundancia de genes o mecanismos compensatorios para asegurar el funcionamiento adecuado de la pared celular se mantiene ^7. Así, nuevos enfoques son necesarios para caracterizar rápidamente la diversa gama de estructuras de glucanos y para facilitar enfoques de la genómica funcional para la biosíntesis de la pared celular y la comprensión modificación.

Los anticuerpos monoclonales (mAbs) ^8,9 han surgido como una herramienta importante para determinar la estructura de glicano y distribución en las plantas. En ellos se reconoce distINCT presentes dentro de las principales categorías de glicanos la pared celular vegetal, incluidas las pectinas, xiloglucanos, xilanos, mananos, glucanos y arabinogalactanos epítopos. Recientemente su uso se ha extendido a los experimentos de cribado a gran escala para determinar la abundancia relativa de los glicanos en una amplia gama de plantas y tipos de tejidos simultáneamente ^9,10,11.

Aquí presentamos un método basado en micromatrices glicano exploración llamada integral Microarray de perfiles de polímero (CoMPP) (Figuras 1 y 2) ^10,11 que permite múltiples muestras (100 segundos) para ser seleccionados utilizando una plataforma de microarrays miniaturizado con reactivo reducida y volúmenes de muestra. Las señales de punto del microarray puede ser formalmente cuantificados para dar semi-cuantitativos de los datos sobre la ocurrencia glycan epítopos. Este método es muy adecuado para el seguimiento de los cambios en glicanos complejos sistemas biológicos ¹² y que proporciona una visión global de la composición de la pared celular en particular cuando el conocimiento previo of este no estará disponible.

Protocolo

1. Colección de tejidos y preparación

1. Recoger 100 mg de peso fresco de los tejidos vegetales (un mínimo de 10 mg de peso seco) al menos por triplicado para cada tejido de interés. Los pasos siguientes describen la preparación de material de la pared celular de los tejidos vegetativos. En el caso de los tejidos de almacenamiento, no deseado almidón es enzimáticamente eliminado antes de proceder con la extracción de los polímeros de la pared celular como se ha descrito previamente ^13.
2. Homogeneizar las muestras a un polvo fino con nitrógeno líquido utilizando un Qiagen TissueLyser II, con 24 conjuntos de adaptador y el tubo 3 mm de tungsteno granos de carburo (30 Hz, 2 x 30 seg). Alternativamente, si solamente unas pocas muestras se procesan, un mortero y mano de mortero se utiliza.
3. Transfiera los homogeneizados en 10 ml tubos cónicos de plástico.
4. Preparar el material de la pared celular mediante el lavado de los homogeneizados en 10 ml de 80% v / v de etanol a temperatura ambiente y agitando vigorosamente durante 2 min.
5. Centrifugar las muestras a 3.500 xg y desechar el sobrenadante. Repetir el etanol al 70% se lava al menos tres veces o hasta que el sobrenadante es claro, en particular para los tejidos que contienen clorofila.
6. Realizar un lavado final con 100% de acetona y dejar los gránulos que contienen residuos insolubles en alcohol (AIR) para secar al aire durante la noche.
7. Tamiz las muestras de aire con un 0,4 mm de malla de ² para conseguir un polvo fino y homogéneo y para eliminar más grande, mal partículas de tierra que en algún momento permanecen en el homogeneizado.
8. Pesar 10 mg de muestra de aire en microtubos, conteniendo cada una 3 mm de perlas de vidrio para ayudar al mezclado de las muestras.

2. Extracción de los glicanos de la pared celular

1. Pectinas, y polímeros asociados con pectinas se extraen de las muestras mediante la adición de 500 l de CDTA mu M 50 (pH 7,5) a cada muestra.
2. Agitar brevemente los tubos para asegurar el disolvente está en contacto con el material de la muestra y, a continuación mezclar mediante el TissueLyser durante 3 horas a 8 Hz.
3. Centrifugar las muestras a 12.000 xg, cuidadosamente reMove los sobrenadantes y se almacena a 4 ° C.
4. Lavar gránulos en 1 ml de agua desionizada para diluir y eliminar cualquier disolvente restante vórtice, y se centrifuga a 13.000 x g. Repita este paso sin perturbar el precipitado y retirar todo el líquido de los tubos antes de proceder al siguiente paso.
5. De reticulación glicanos son secuencialmente extraída de la pared celular restante pellet con 500 l de NaOH 4 M con 0,1% w / v NaBH4, usando el mismo procedimiento descrito en los pasos 2,1 a 2,4 para la extracción CDTA. NaBH ₄ se añade para reducir el aldehído (o ceto) en el extremo reductor de los polisacáridos a un alcohol evitando de este modo la base de polisacáridos descamación.
6. Después de la centrifugación, los sobrenadantes se retira de nuevo, se almacenaron a 4 ° C, y los sedimentos se lavaron dos veces en agua desionizada antes de proceder a la extracción siguiente.
7. Como una etapa opcional, los polímeros residuales, tales como la celulosa se extrajo con 500 cadoxen mu l (31% v / v 1,2-diaminanoethane con 0,78 M CdO) usando el mismo procedimiento como se describe en los pasos desde 2,1 hasta 2,4. Alternativamente, el contenido absoluto de celulosa en gránulos restantes se puede determinar usando ensayos acético / nítrico (véase la discusión).

3. Microarrays de impresión

1. Sobrenadantes de centrífuga que contiene extrajo polímeros de la pared celular a 13.000 xg para eliminar cualquier materia en partículas.
2. Cargar 50 l de cada muestra en un polipropileno de 384 pocillos placa de microtitulación usando un diseño personalizado prediseñada en donde las muestras se disponen de acuerdo con el tipo de tejido y del tipo de extracción.
3. Diluir la muestra de polímero de la pared celular en una serie 0, 5 y 25 × dilución en serie con agua desionizada.
4. Los parámetros tales como la altura pin, recogida y tiempo de permanencia, y los pasos de lavado se encuentra en el software que controla la microarrayer.
5. La humedad de la cámara de impresión se controla a 60% para evitar la evaporación de la muestra.
6. El trabajo de impresión se inicia mediante LabNEXT software y un programa que corresponde a la disposición de microarrays.
7. El robot utiliza los pins de canal capilar para imprimir soluciones de la placa de muestra en 20 x 20 cm de membrana de nitrocelulosa que se une a una placa plana en la máquina. Cada punto de la matriz contiene 15 nl de solución y se imprime por triplicado.
8. Microarrays idénticos se imprimen uno al lado del otro en la membrana y se cortó en matrices individuales después de que el trabajo de impresión.
9. En cada experimento las matrices pueden ser modificados con el fin de acomodar muestras más o menos, diluciones o replicados.

4. Sondeo de Microarrays glicano

1. Después de la impresión, bloquear los microarrays individuales en 5% w / v de leche en polvo desnatada disuelta en solución salina tamponada con fosfato (MPBS) a temperatura ambiente durante 2 horas para reducir la unión no específica.
2. Microarrays de sondas con anticuerpos monoclonales específicos para epítopos de la pared celular glicano durante 2 horas en MPBS al. La mayoría de antib monoclonalodies contra glucanos de la pared celular están disponibles comercialmente en tres compañías; Biosupplies ( www.biosupplies.com.au ), Servicios Carbosource ( www.carbosource.net ) y PlantProbes ( www.plantprobes.net ).
3. Incluir un control negativo, un microarray incubaron con MPBS al solamente y sin anticuerpo primario.
4. Lavar los microarrays de 3 veces en tampón fosfato salino (PBS) durante 5 minutos para eliminar la unión no específica.
5. Controle los microarrays con anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) en MPBS al durante 2 horas. Más anticuerpos monoclonales contra glucanos de la pared celular requiere anti-ratón o anti-rata anticuerpos secundarios.
6. Repetir las etapas de lavado 3 veces con tampón PBS durante 5 minutos para eliminar la unión no específica.
7. Desarrollar los microarrays utilizando cromógeno (3,3-diaminobencidina) o chemiluminecent (luminol) sustratos.

5. Cuantificación

1. Después del revelado, escanear los microarrays individuales utilizando una alta resolución (1.200 dpi) Escáner de sobremesa y guardar las imágenes como negativas, de 16-bit TIFF (Figura 3).
2. Calcular la intensidad integral de cada mancha usando Xplore Software de procesamiento de imágenes (LabNEXT) equipado con una herramienta de cuadrícula automatizado. La intensidad de la mancha integral se deriva de la suma de los píxeles en el área de rejilla que rodean a cada punto.
3. Los datos de la cuadrícula para cada microarray se exporta como un archivo de texto y se puede importarse manualmente en una hoja de cálculo Excel para su análisis. Una herramienta en línea ( http://microarray.plantcell.unimelb.edu.au/ ) ha sido desarrollado para traducir automáticamente y procesar los datos de cada archivo de txt.
4. La intensidad de la mancha integral se promedia a través de la impresión repeticiones y diluciones para obtener un lugar "justo mediointensidad "valor para cada muestra (Figura 2). Alternativamente, las señales de mancha correspondiente al valor de dilución sólo uno en la matriz se utilizan para cuantificar la abundancia relativa de glicano epítopo para cada muestra.
5. Las intensidades relativas medias al contado entre las diferentes muestras se presentan como un mapa de calor (Figura 4) utilizando el formato condicional en Excel o HeatMapper herramientas en línea ( http://bar.utoronto.ca/welcome.htm ). Los datos para cada tipo de anticuerpo se corrige a 100 y un valor de corte de 5% se impone para eliminar la señal de fondo y los falsos positivos.

Resultados

La abundancia relativa de los glicanos en seis tipos de tejido (filamentos de anteras, polen, ovarios, pétalos, sépalos y el estigma) de Nicotiana alata flores se determinó usando CoMPP. La Figura 3A muestra un microarray representante que se ha sondeado con mAb específico para JIM5 parcialmente (bajo) methylesterified homogalacturonan (HG), un epítopo que se produce en polisacáridos pécticos ^14. El epítopo JIM5 se detecta en extractos CDTA de todos los tejidos de las flores sin embargo es m?...

Discusión

CoMPP es un método rápido y sensible para perfilar la composición glicanos de cientos de plantas derivadas de las muestras en cuestión de días. Este método complementa las plataformas de glicano ya disponibles bacterianas o de mamíferos de matriz para cribado de alto rendimiento de las interacciones de hidratos de carbono con glicanos de proteínas de unión tales como lectinas, receptores, y anticuerpos ^16. Con una gran diversidad de sondas disponibles para la detección de glucanos de la pared celula...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios (opcional)
3 mm de carburo de tungsteno bolas	Qiagen	69997
Colección de microtubos (1,2 mm)	Qiagen	19560	1,5 ml tubos de microcentrífuga también se puede utilizar
Qiagen TissueLyser II	Qiagen	85300
3 perlas de vidrio mm	Sigma Aldrich	Z143928
CDTA	Sigma Aldrich	34588
Óxido de cadmio	Sigma Aldrich	202894
1,2-diaminoetano	Sigma Aldrich	03550
Membrana de nitrocelulosa (0,22 micras de tamaño de poro)	GE Water & Process Technologies	EP2HY00010	diferentes membranas de tamaño de poro son adecuados para diferentes tipos de anclaje
Xact II microarrayer robot	Labnext	001A	la Xact II robot fue equipado con una costumbre 20 x 20 cm de placa cerámica a la que se une la membrana de nitrocelulosa
Xtend pins RM microarrays	Labnext	0037-350	pins deben ser adecuados para manchas en membranas
Placas de microtitulación de 384 pocillos (polipropileno)	Greiner	781207
Anti-glicanos anticuerpos monoclonales	Sondas vegetales / CarboSource / Biosupplies		Sitios Web; PlantProbes ( www.plantprobes.net ), Carbosource (ww.carbosource.net "target =" _blank "> www.carbosource.net) y Biosupplies ( www.biosupplies.com.au ).
IgG anti-rata (molécula completa) - anticuerpo peroxidasa producida en cabra.	Sigma	A9037	el tipo de anticuerpos secundarios depende del anticuerpo primario utilizado (por ejemplo, criado en rata, ratón de cabra, etc,).
SIGMA RÁPIDO 3,3 '-diaminobenzidina tabletas	Sigma	D4293	el tipo de desarrollo de reactivo depende de los anticuerpos secundarios utilizados y el método de detección (colourmetric, o chemiluminecent).
SuperSignal West Pico Substrato quimioluminiscente	Thermoscientific	34080	véase anteriormente
Xplore Software de procesamiento de imágenes	LabNext	008	muchos tipos de software con herramientas automáticas de grillado disponiblespara medir el valor de píxel de manchas de microarrays.
Polisacáridos de plantas	Sigma / Megazyme