Generación rápida y eficiente de las neuronas a partir de células madre pluripotentes en un formato de placa Multititre

Resumen

Protocolos para la diferenciación neuronal de las células madre humanas pluripotentes (hPSCs) son a menudo mucho tiempo y requieren considerables conocimientos de cultivo de células. Aquí, hemos adaptado una molécula pequeña de un procedimiento basado en una diferenciación a un formato de placa de multititre, que permite la generación sencilla, rápida, y eficiente de las neuronas humanas de una manera controlada.

Resumen

Los protocolos existentes para la generación de neuronas a partir de células madre pluripotentes (hPSCs) suele ser tedioso, ya que son procedimientos de múltiples etapas que implica el aislamiento y la expansión de las células precursoras neurales, antes de la diferenciación terminal. En comparación con estos métodos consumen mucho tiempo, recientemente se ha encontrado que la inhibición combinada de tres vías de señalización, TGFβ/SMAD2, BMP/SMAD1, FGF y / ERK, promueve la rápida inducción de la neuroectodermo de hPSCs, seguido de inmediato diferenciación en neuronas funcionales. Aquí, hemos adaptado nuestro procedimiento para un formato de placa novela multititre, para mejorar aún más su reproducibilidad y para que sea compatible con mediados de rendimiento de las aplicaciones. Se compone de cuatro días de formación neuroectodermo en esferas flotantes (cuerpos embrioides), seguido por un período de cuatro días de diferenciación en neuronas en condiciones adherentes. La mayoría de las células obtenidas con este protocolo parecen ser las neuronas sensoriales bipolares. Por otra parte,el procedimiento es altamente eficaz, no requiere habilidades particulares de expertos, y se basa en un simple medio químicamente definido con rentables moléculas pequeñas. Debido a estas características, el procedimiento puede servir como una plataforma útil para la investigación funcional adicional, así como para el cribado basado en células humanas se aproxima requiere neuronas sensoriales o neuronas de cualquier tipo.

Introducción

hPSCs, que comprende embrión derivado de células madre embrionarias humanas (hESCs) y células madre pluripotentes inducidas (hiPSCs), son pluripotentes sentido de que pueden dar lugar a diversos linajes celulares in vitro ^1-2. Numerosos tipos de células diferenciadas se han derivado de hESCs hasta la fecha, apoyando la idea de que estas células presentan valiosas herramientas para la investigación científica y basados ​​en células enfoques de cribado, y mantienen la promesa para células basadas en la terapéutica.

Protocolos de diferenciación neuronal para hESCs son generalmente complejas y requiere mucho tiempo, ya que a menudo se basan en la inducción de primera general destino neural, seguido de aislamiento manual de los progenitores neuronales, y la diferenciación terminal posterior en un tipo de neurona dada de interés ^3-6. En algunos respecto, esta complejidad no es sorprendente e inevitable dado que tal estado-de-la-arte dirigido protocolos de diferenciación por etapas tienden a imitar el desarrollo temprano humano, which es en sí mismo muy complejo. Por otra parte, puede, en parte, también reflejan la falta de entendimiento de los procesos moleculares subyacentes, lo que resulta en protocolos de diferenciación que aún están lejos de ser totalmente optimizado.

Con respecto a la conversión de hPSCs indiferenciadas en neuroectodermo, Pera et al. encontraron que la supresión de BMP / SMAD1/5/8 señalización aumenta la inducción neural de hESCs ^7. Además, la inactivación de Smad2 / 3 de señalización se ha demostrado para promover la formación neuroectodermo ^8. Por consiguiente, la inactivación combinada de estas dos vías tiende a conducir a la inducción neural más eficiente de hPSCs ^4,9. Más recientemente, se ha demostrado que una tercera vía de señalización, FGF / ERK, sirve como un represor fuerte de los primeros pasos de compromiso neuroectodérmico en hESCs. Por el contrario, la represión simultánea de estos tres caminos conducen a casi homogéneo conversión de hESCs en neuroectodermo conen tan sólo cuatro días ^10. Posteriormente, la diferenciación terminal altamente eficiente en neuronas funcionales se observó dentro de ocho días. Las neuronas obtenidas fueron probablemente las neuronas sensoriales del sistema nervioso periférico, lo que puede explicar en parte su derivación rápida ^10. Errores de mantenimiento neurona sensorial se considera una causa de ciertos trastornos humanos, tales como la disautonomía familiar ^11. Para el modelado de dichas enfermedades basadas en la tecnología hiPSC ^12, para la caracterización funcional adicional, así como para fines aplicados no requieren ningún tipo particular de neuronas, este procedimiento de diferenciación puede presentar una base útil.

Sin embargo, la estrategia de diferenciación de lo que originalmente se empleó la formación de los cuerpos involucrados embrionarias (EBS) de grupos de ¹⁰ colonias hESC, y esto dio lugar a un buen grado de heterogeneidad en cuanto a tamaños de EB, y también parecía poner en peligro la eficiencia de formación de neuronas en algunas celíneas ll. Además, debido a la heterogeneidad en los tamaños EB, la capacidad para probar sistemáticamente los efectos de factores de crecimiento adicionales o moléculas pequeñas durante y después de la formación de neuronas parecían ser algo confundido.

En este informe, hemos adaptado nuestro procedimiento anterior para un rendimiento medio-compatible, forzado agregación basado en la técnica para generar EBS en un tamaño muy controlado de manera que también se observan en otros contextos ^13. Posteriormente, el EBS generada en forma de V pocillos de placas de 96 pocillos se transfirieron a en forma de U ultra-bajo fijación placas 96-pocillos, para iniciar la formación neuroectodermo en suspensión. Cuatro días más tarde, el EBS se podría sembraron dar lugar a neuronas terminalmente diferenciadas con alta eficiencia y homogeneidad. Alternativamente, día-4 EBS se disocia en células individuales y se colocaron como tal, lo que resultó en monocapas de baja densidad de neuronas humanas. Resultados fueron coherentes con los obtenidos hasta el momento dos de forma independientelíneas de células madre, Rived HuES6 y NCl3.

Como un requisito previo, la formación de EB éxito era estrictamente dependiente de la utilización de un polímero sintético, alcohol de polivinilo (PVA), junto con inhibidor de la ROCA Y-27632 conocido para promover la supervivencia hESC ^13-14. Como resultado de ello, la homogeneidad de la EBS formado en el 96-V-placas se mejoró considerablemente en comparación a la formación de EBs como cultivos en masa basado en técnicas de splitting aleatorios. Así, este sistema proporciona una plataforma significativamente mejorada para la formación de neuroectodermo en cultivo en suspensión, seguido por la formación de neuronas altamente controlada en condiciones adherentes.

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Protocolo

1. Preparación de Matrigel recubiertos con placas y los medios

1. Preparación de Matrigel recubierto con Matrigel placas se ha encontrado que es un sustrato preferido para la unión de diferenciar EBs y también promueve la excrecencia eficiente de las neuronas de estos ^10.
   1. Descongelar 10 ml de noche en hielo Matrigel.
   2. Al día siguiente, se diluye la Matrigel gelatinosa con dos volúmenes de hielo frío DMEM/F-12 y preparar partes alícuotas de 1 ml en tubos de 15 ml preenfriados cónicos que pueden almacenarse congeladas a -20 ° C.
   3. Decidir sobre un formato de placa para la diferenciación neuronal. Por ejemplo, como punto de partida, se recomienda llevar a cabo una ronda inicial de la diferenciación en un formato de 12-así. Pre-enfriar cuatro placas de 12 pocillos a 4 ° C. Disolver una alícuota de Matrigel congelado mediante la adición de 9 ml de pre-refrigerado DMEM/F-12 seguido por pipeteando arriba y abajo hasta que todo el Matrigel prediluido ha descongelado y se disolvió.
   4. Entonces, Transferir el contenido en un tubo de 50 ml nuevo que contiene 15 ml de DMEM/F-12 en hielo (dilución final Matrigel: 1:75). A continuación, añadir 0,5 ml de Matrigel diluido a cada pocillo de las pre-enfriados 12-pocillos. Envuelva las placas con Parafilm y se deja reposar durante la noche a temperatura ambiente.
   5. Al día siguiente, transferir las placas a 4 ° C. Las placas recubiertas se pueden almacenar durante varias semanas antes de su uso.
2. Medios de comunicación

EB medio de formación (~ 15 ml necesario para realizar la diferenciación en una placa de 96 pocillos - ver Tabla 1 y el esquema en la figura 2):
DMEM/F-12 con 0,4% (PVA)
1x N2
1x B27
0,05% de BSA
20 ng / ml FGF2
10 mM Y-27632
1x PenStrepGln

Medio de diferenciación (~ 30 ml necesario para realizar la diferenciación en una placa de 96-pocillos, seguido por la formación de neuronas en una Matrigel recubierto de 12-pocillos, véase la Tabla 1):
DMEM/F-12
1x N2
1x B27
0,05% de BSA
0,5 mM PD0325901
15 SB431542 mu M
0,5 mM Dorsomorphin
1x PenStrepGln

2. EB forzado Formación

1. Crecer hPSCs bajo tus preferidos sin conexión en condiciones. Utilizamos MEF medio acondicionado en Matrigel revestidos 6-y las placas ^15. Sin embargo, otros sistemas de cultivo, como medio definido caseros o comerciales también debería funcionar. En el momento de iniciar un experimento diferenciación, hPSCs debe ser sub-confluente y creciendo activamente.
2. Mecánicamente eliminar espontáneamente colonias diferenciadas usando una punta de pipeta de plástico estéril bajo un microscopio estéreo.
3. Lávese las restantes colonias indiferenciadas con PBS, y se resumen a células individuales utilizando Accutase contiene 1X Y-27632. Pellets individuales células por centrifugación a 200 xg durante 2 min, se resuspende en un pequeño volumen de medio de formación de EB y determinar título celular utilizando un hematocitómetro.
4. Añadir una alícuota de células ael EB restante medio de formación para dar como resultado un título entre 40.000 y 80.000 células por ml.
5. Usando una pipeta multicanal, transferir 100 l por pocillo a una placa de fondo 96V, resultando en 4.000 a 8.000 células por pocillo. Centrifugación placa de 96 pocillos en una centrífuga de plato oscilante a 400 xg durante 1 min para recoger las células en la parte inferior de los pocillos, y transferir a la incubadora de cultivo celular. EBS se forman durante la noche, como se muestra en la figura 1.

3. Neuroectodermo Inducción

1. Al día siguiente (día 0), recoger EBs de 96V de la placa bajo un microscopio estéreo y transferencia en un pequeño volumen en una placa de 3,5 cm bacteriano que contiene 2 ml de medio de diferenciación. Agitar suavemente el plato durante unos segundos para lavar el EBS.
2. Añadir 100 l de medio de diferenciación por pocillo de un ultra-bajo-apego fondo en U de 96 pocillos. Bajo un microscopio estereoscópico, la transferencia de EBS en pequeños volúmenes del lavado de platos en el 96U-pozos (uno por EB quell). Place 96U placa en cultivo celular incubadora durante 4 días para permitir la formación neuroectodermo.

4. Neurona Formación

1. El día 4, preparar un plato de lavado como en el paso 3,1 y adicionalmente sustituir DMEM/F-12 en un pre-calentado Matrigel recubierto 12-así placa por medio de diferenciación (1 ml por pocillo).
2. Revestimiento de EBs
   1. Recoger EBs de placa de 96U, lavar estas semillas como anteriormente, y con cuidado uno por uno en los pocillos de la Matrigel recubierto de 12-pocillos (aproximadamente 8 CE por pocillo): EBS se distribuirá uniformemente dentro de los pozos para permitir el crecimiento sin perturbaciones de neuronas en los próximos días (ver "día 5" imagen de la Figura 2).
   2. Antes de la transferencia de la placa de respaldo 12-bien en la incubadora, permitir EBS para acoplar con flojedad de alrededor de 10 min a TA. Luego, transferir cuidadosamente 12-así placa de cultivo celular incubadora. Las neuronas se crecen desde el chapado de EBs de forma radial dentro de los próximos 4 días, como shown en la Figura 2 ("Día 8" La imagen de la derecha).

5. Neurona Formación como monocapas

1. Como alternativa a los pasos del punto 4), en el día 4 del procedimiento, recoger EBs de en una placa de 3,5 cm bacteriano que contiene 2 ml de medio de diferenciación, a continuación, transferir embrioides en un pequeño volumen a un plato que contiene PBS, y luego en otro plato que contiene Accutase.
2. Deje digerir a células individuales, se centrifuga a 200 xg durante 2 min, se resuspende en un pequeño volumen de medio de diferenciación y determinar título celular utilizando un hematocitómetro. Ajuste título a 1-2x10 ⁶ células por ml usando medio de diferenciación (sin S-27632).
3. Células de la placa hacia fuera en pre-calentado Matrigel recubierto de 12-pocillos (1 ml por pocillo), y la transferencia a la incubadora de cultivo celular. Formación de las neuronas como monocapas se observó entre los días 7 a 8 (Figura 3C). Cabe señalar, sin embargo, que esta variante de monocapael procedimiento no está totalmente optimizado con respecto a la supervivencia de las células y el substrato más adecuado.

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Resultados

En nuestro informe anterior, en línea con muchos otros, EBS desde hPSCs podría generarse simplemente replating agregados sobre la división de rutina de hPSCs en platos de baja fijación ^10. Esto usualmente resulta en una amplia distribución de tamaños de EB resultantes (Figura 1 C, arriba). Otro problema que resulta de esto es que EBS mantienen en suspensión tienden a agregarse entre sí, dando lugar a una heterogeneidad aún mayor de tamaños de EB. Para evitar estos problemas, por lo ...

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Discusión

La mayoría de los protocolos de diferenciación que implican la formación de EB hPSCs, incluyendo nuestro procedimiento previamente publicado ^10, se basa en el manual o con ayuda de enzima de recolección hESCs como agregados, lo que inevitablemente conduce a la heterogeneidad en los tamaños de EB. Este hecho conduce a variabilidad en la eficacia con la diferenciación de algunas líneas celulares, haciendo así difícil análisis sistemáticos, en particular, a una escala de rendimiento medio. Además, la...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Matrigel HC	Becton Dickinson	354263	Ver texto para más detalles sobre el manejo de
DMEM/F-12	Life Technologies	21331-020
Poli (alcohol vinílico)	Sigma	363170	Disolver en 0,4% en DMEM/F-12 utilizando un baño de agua ultrasónico / evitar el sobrecalentamiento / puede mantenerse a 4 ° C durante varias semanas
Suplemento N2	Life Technologies	17502-048	100X, almacenar como alícuotas congeladas
B27 Suplemento	Life Technologies	12587-010	Tienda 50X, como alícuotas congeladas
Albúmina de suero bovino	Sigma	A1595	10% = 500X, almacenar en alícuotas congeladas
L-Glutamina con penicilina / estreptomicina	PAA	P11-013	O el equivalente
FGF2	Peprotech	100-18B	Disolver en 10 ug / ml en 0,1% de BSA / PBS = 1000X tienda, como alícuotas congeladas
ROCA inhibidor Y-27632	abcamBiochemicals	Asc-129	Disolver en 10 mM en DMSO = 1000X tienda, como alícuotas congeladas
PBS	PAA	H15-002	O el equivalente
Accutase	PAA	L11-007
96-y de fondo en V placas	Nunc	277143
PD0325901	Axon MedChem	Axon 1408	Disolver en 0,5 mM en DMSO = 1000X tienda, como alícuotas congeladas
SB431542	abcamBiochemicals	Asc-163	se disuelven a 15 mM en DMSO = 1000X tienda, como alícuotas congeladas
Dorsomorphin	Santa Cruz	sc-200689	disolver en 0,5 mM en DMSO = 1000X tienda, como alícuotas congeladas
U de 96 pocillos de fondo ultra bajo placas de fijación	Corning	7007
beta-tubulina III anticuerpos (ratón)	Sigma	T8660	utilizar a 1:1000
beta-tubulina III anticuerpos (conejo)	Covance	PRB-435P	utilizar a 1:2000
Brn3a (POU4F1) de anticuerpos	Santa Cruz	sc-8429	utilizar a 1:500
			Tabla 1. </ Strong> reactivos y equipos específicos.