Citometría de masas: Protocolo para la afinación y servicio diario muestras de células en un citómetro de masas CyTOF

Resumen

Las medidas necesarias para la sintonización diaria y la optimización del rendimiento de un citómetro de masa CyTOF se describen. Comentarios sobre la preparación de la muestra y el caudal óptimo se discuten

Resumen

En los últimos años, el rápido análisis de células individuales que comúnmente se ha realizado usando citometría de flujo y anticuerpos marcadas con fluorescencia. Sin embargo, la cuestión de la superposición espectral de emisión de fluoróforo ha limitado el número de sondas simultáneamente. En contraste, el nuevo citómetro CyTOF masa por DVS pareja Ciencias un líquido único sistema de células de introducción a una ICP-MS. ¹ En lugar de fluoróforos, polímeros quelantes que contienen altamente enriquecido isótopos metálicos están acopladas a anticuerpos u otras sondas específicas. ^2-5 Debido a la pureza del metal y resolución de masa del citómetro de masa, no hay "superposición espectral" de isótopos vecinos, y por lo tanto no hay necesidad de matrices de compensación. Además, debido a la utilización de metales lantánidos, no hay fondo biológica y por lo tanto no equivalente de la autofluorescencia. Con una ventana de masa que abarca masa atómica 103-203, teóricamente hasta 100 etiquetas se podía distinguir simultáneamente. Actualmente, Más de 35 canales disponibles utilizando los reactivos quelantes disponible en Ciencias de la DVS, lo que permite una disección sin precedentes del perfil inmunológico de las muestras. ^6-7

Las desventajas de la citometría de masa incluyen el requisito estricto de un isótopo de metal separado por sonda (no equivalente de dispersión frontal o lateral), y el hecho de que es una técnica destructiva (sin posibilidad de ordenar la recuperación). La configuración actual del citómetro de masa también tiene una velocidad de transmisión de células de sólo ~ 25%, por lo que requieren un número de entrada más alta de células.

Óptimo rendimiento diario del citómetro de masas requiere varios pasos. El objetivo básico de la optimización es maximizar la intensidad de señal medida de los isótopos metálicos deseados (M) mientras se minimiza la formación de óxidos (M +16) que disminuirá la intensidad de la señal M e interferir con cualquier señal deseada a M +16. El primer paso es para calentar la máquina para un caliente, estable ICP plasma ha sido establecida. En segundo lugar, los ajustes para la velocidad de flujo de gas actual y el maquillaje debe ser optimizado en una base diaria. Durante la recogida de la muestra, la velocidad de células de evento máxima está limitada por la eficiencia del detector y la velocidad de procesamiento a 1000 células / segundo. Sin embargo, dependiendo de la calidad de la muestra, un tipo de célula caso, más lento (300-500 células / segundo) es por lo general deseable para permitir una mejor resolución entre los eventos de las células y por lo tanto maximizar singletes intactas sobre dobletes y escombros. Por último, la adecuada limpieza de la máquina al final del día ayuda a minimizar la señal de fondo debido a metal libre.

Protocolo

Todas las muestras de células para la CyTOF debe ser fijada y permeabilizada. Esto permite una mayor entrada de la intercalador de ADN que contiene iridio, y también previene la lisis celular durante el lavado con agua MilliQ y resuspensión inmediatamente antes de la inyección en el citómetro de masa.

1. Puesta en marcha del citómetro de masas

1. Abra el programa CyTOF. Seleccione Configuración del instrumento. En la ficha canastilla para tarjetas, vaya a la esquina inferior derecha y haga clic Calentador botón "ON". Encender el calentador de al menos 15 min antes de tiempo deseado para permitir tiempo suficiente para que el manto cámara de pulverización para llegar a 200 ° C.
2. Sustituir el blanco Norm-Ject 3 ml jeringa en la bomba de jeringa con una jeringa llena de agua fresca MilliQ.
3. Limpieza del nebulizador. Dejen pasar el nebulizador mediante el uso de la jeringa y el tubo para tirar 5% Citranox 2-3 veces a través del puerto más pequeño de introducción de líquido y el orificio de introducción de gas más grande. Repita el lavado a contracorriente con agua MilliQ to eliminar Citranox residual.
4. Confirme que las luces en el panel frontal de la CyTOF se encienden como en la figura 1.

Figura 1. CyTOF luces del panel antes de arrancar.

5. Abra la válvula del tanque de gas argón. Esto debería hacer que el "ARGON" luz en la parte frontal para encenderla.
6. Conecte el nebulizador para el maquillaje de entrada de gas. Desenrosque el maquillaje conector de gas y retire la tubería de caucho negro o-ring y la pieza de plástico blanco cónico. Tenga en cuenta la más amplia "nudillo" en el vástago del orificio de introducción de gas del nebulizador. Coloque el conector en el orificio de introducción de gas. Coloque el negro o-anillo sobre el extremo de la conexión de gas, y la fuerza de la junta tórica más allá de la parte más ancha del vástago de puerto. Coloque la pieza cónica de plástico blanco en la parte superior con el extremo estrecho señalado, y el tornillo en el tubo de gas de maquillaje.
7. Conecte el nebulizador para el tubo de introducción de líquido. Cuidadosamente inserte el tubo pequeño en la abertura en el extremo del nebulizador. Habrá dos paradas, similar en sentir a las paradas en una micropipeta. En primer lugar, presione hasta que encuentre resistencia a la luz, y el extremo del tubo pequeño debe estar al final de la recta de vidrio. En segundo lugar, presionar con más fuerza para obligar al final de la sección recta de vidrio adicional en la conexión y apriete el tornillo de ajuste para sellar. Insertar el extremo del nebulizador en la abertura blanco en el manto de calentamiento.
8. En la ficha Controlador RFG de la ventana de configuración del instrumento, pulse el botón "Start Plasma". Desde el nebulizador ya está insertado, pulse el botón "OK". El software se encenderá el enfriador, iniciar el flujo de gas, y encender un plasma. El detector de tensión se elevará. Habrá una ventana pop-up diciendo "Plasma secuencia de arranque ha finalizado con éxito" cuando haya terminado, pulse el botón "OK". Nuevas luces debe estar activada en el panel frontal (Figura 2 >).

Figura 2. CyTOF luces del panel de plasma después de encendido y puesta en marcha se completó correctamente.

9. Encender la bomba de jeringa. En la esquina superior derecha, pulse el botón verde "play" para iniciar la bomba de jeringa y comience a fluir líquido a través del tubo y la pulverización del nebulizador. Los ajustes por defecto son para jeringas 3 ml de agua. Para que muestra que se circula a través del bucle de muestra, la bomba de jeringa debe ser cambiado periódicamente cuando se ejecuta fuera del agua. En la parte superior de la pantalla, hay un contador que indica la cantidad de líquido ha fluido fuera de la bomba de jeringa. La bomba de jeringa se detendrá cuando este contador llega a "3,000" o el émbolo llega al final de la jeringa. Al rellenar la jeringa, se debe pulsar "stop" en lugar de la nada "pausa" para reiniciar el contador.

e "2>. Calibración diaria del citómetro de masas

1. El citómetro de masas se requiere aproximadamente 20 minutos para conseguir un plasma caliente y estable antes de la calibración. El propósito de los pasos de sintonía es maximizar la señal deseada de Tm169 o Tb159 manteniendo "Gd155" (óxido; La139 + O16) de la señal por debajo del 3% del valor más alto. Haga clic en el botón Configuración para abrir Adquisición de adquisición de datos Configuración de la ventana. En la pestaña de analitos, haga clic en la tabla periódica para abrir el panel de selección de isótopos. Seleccione los isótopos en la solución de sintonización DVS Ciencias aparecen en el manual, a continuación, haga clic en "Guardar".
2. Haga clic en los Isótopos por lectura para abrir la Masa (s) por la ventana de lectura. Seleccione "impulsos de contaje", y reescalar el eje introduciendo un nuevo número y pulsar "enter".
3. Llene un verde 1 ml Norma-Ject jeringa con la solución de sintonización. Gire el selector de puerto de la muestra a "LOAD", inyectar 450 l de solución de sintonización, gire el selector a "inyectar". En la ficha Calibración de masas de la Acquisit datos ion ventana de Configuración, pulse el botón "Ejecutar" para controlar masas que fluyen por. El lado izquierdo de la ventana es menor masa, mientras que el lado derecho es mayor masa. Nota: ya habrá señales en la región TOF 9400-9800, debido a isótopos de xenón en el gas argón (Figura 3). Espere hasta que los isótopos de afinación solución comenzará a aparecer en forma de líneas en esta pantalla (Figura 4).

Figura 3. Calibración de masas pestaña de la ventana, que muestra los niveles de base para varios isótopos después de la solución de lavado y enjuague con agua. La región alrededor de TOF 9400-9800 corresponde a los isótopos de xenón en el gas argón, y siempre debe estar presente. Haga clic aquí para ampliar la cifra .

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Figura 4. Calibración de masas ventana de la ficha, que muestra rayas verticales para varios isótopos en la solución de sintonización DVS. Haga clic aquí para ampliar la cifra .

4. Volver a la Masa (s) por la lectura ventana y pulse el botón verde botón "Play" en la esquina superior izquierda. Cada isótopo seleccionado en el paso 2,1 se representa por una línea de color diferente. El valor por defecto del eje X es "Time", en el s. Monitorear los niveles de los diferentes isótopos hasta que se firme.
5. Sintonización de la corriente. En la ficha Parámetros de la ventana Configuración de adquisición de datos, seleccione "Actual" en el menú desplegable. Vamos a empezar a = 0, final = 10, valor de paso = 0,5, tiempo de establecimiento = 200, y pulse "Guardar". Haga clic de nuevo en la Masa (s) por la ventana de lectura y pulsar el botón Reproducir. El eje x es ahora "actual". Tenga en cuenta que las señales de los picos de los isótopos (Figura 5), y r ECORD. En la pestaña Configuración de canales DAC de la ventana de configuración del instrumento, desplácese hacia abajo para "actual" e introduzca el nuevo valor. Pulse el botón "Ajustar valor real actual", y luego "Guardar".

Figura 5. Perfil de ajuste actual.

6. Sintonización del gas de maquillaje. Cambiar el menú desplegable de "Maquillaje de gas". Vamos a empezar = 0,55, final = 0,95, valor del paso = 0,05, tiempo de establecimiento = 200. Pulse Guardar. Regresar a la Masa (s) por la ventana de lectura y pulsar el botón Reproducir. El eje x es ahora "maquillaje gas" velocidad de flujo. Grabar en donde las señales de los picos de los isótopos. Observar el rápido aumento de la "Gd155" señal cerca del extremo (Figura 6). Volver a la ficha Configuración de canales DAC, desplácese hacia abajo para "Maquillaje gas", e introduzca el nuevo valor. Pulse el botón "Ajustar valor real actual", y luego "Guardar".

igura 6 "src =" / files/ftp_upload/4398/4398fig6.jpg "/>
Figura 6. Maquillaje perfil de ajuste de gas.

7. Relación de grabación de isótopo deseado óxido vs. Hacer una segunda inyección de 450 l de solución de sintonización. En la ficha Parámetros, seleccione "Time" en el menú desplegable, vamos start = 0, final = 10, valor de paso = 1, el tiempo de establecimiento = 200. Pulse el botón "guardar". Haga clic en "play" en Masa (s) por la lectura ventana. Después de que las líneas se han estabilizado (Figura 7), utilice el cursor para leer el valor en los cuadros superiores de la izquierda para Tm169 o Tb159 (valor superior) y también el "Gd155" valor (<3% del valor más alto). Estos valores también se pueden guardar en un archivo de sintonización para referencia futura.

Figura 7. Medición de la intensidad de la señal de ajuste de solución después de la optimización gas actual y Maquillaje.

8. La limpieza de sample circuito. Inyectar 3 ml de agua MilliQ a través del bucle de muestra, seguido por 500 l de solución de lavado DVS. Monitorear el progreso de la limpieza con el botón "Ejecutar" en la ficha Calibración de masas. Lavar hasta que la intensidad de las bandas (figura 4) empieza a disminuir, a continuación, siga por 3 ml de agua MilliQ y el monitor hasta que se establecen a niveles de fondo (Figura 3).

3. Muestras de servicio

1. Abra la ventana de adquisición. Ajustes por defecto: hacer análisis = On-The-Fly, señal para el análisis de calibración = Dual, Dual Count = Datos. Reducción de ruido está activada. Cualquiera de estos puede cambiar si se desea. Introduzca el nombre del archivo. Todos los archivos deben ser guardados en el E :/ / unidad.
2. Ajuste de retardos de adquisición. Habrá un ligero retraso en el registro de eventos de células de aproximadamente 30 segundos debido a la longitud de la tubería entre el bucle de muestra y del nebulizador. Por lo tanto, la suma total de "retardo de Adquisición" y "Detector stretardo de capacidad "debe ser al menos 30 seg. retardo detector de estabilidad debe ser de al menos 20 seg.
3. Ajuste de la hora de recogida de datos. "Tiempo de adquisición" es el número de segundos que desea ejecutar su muestra. Llenar todo el bucle de muestra 450 l requeriría 600 segundos en completarse. Se sugiere que los 50-100 seg se añade al final del tiempo de ejecución para reducir al mínimo el arrastre de muestra.
4. La resuspensión de muestra. Para minimizar la acumulación de sales en la máquina, se sugiere que al menos dos lavados en agua MilliQ se realiza al final de la tinción de las células, seguido de una resuspensión final en agua MilliQ. El volumen de agua MilliQ para resuspender el sedimento de células pueden variar en función del número de células de partida y la recuperación de las células después del procedimiento de tinción entero. Un buen punto de partida es 10 ⁶ (encender) células / ml. Después de la resuspensión, filtrar a través de un filtro de células para eliminar los agregados.
5. A partir de la muestra correr. Introduzca un nuevo nombre de archivo para la muestra actual. Cambie la válvula de bucle muestra a "LOAD", inyectar la muestra, vuelva a "inyectar", después haga clic en "Ejecutar" en la ventana de adquisición.
6. Registro de acontecimientos celulares. Las células se representan en la ventana de instantáneas como las colecciones de las marcas horizontales en cada vertical isótopo marcador / canal (Figura 8). Mientras que el citómetro de masa puede registrar 1.000 células / sec, una mejor resolución entre los eventos celulares se obtiene normalmente a 300-500 células / sec. Esto corresponde a un promedio de ~ 1 célula / actualización de la pantalla. Puede tardar hasta 30 segundos antes de que el contador de eventos célula comienza a subir. Esto es debido a "On-the-fly" procesamiento de datos; no la información de eventos de células se pierde.

Figura 8. Ventana de adquisición durante ejemplo en ejecución, mostrando filas horizontales de manchas correspondientes a los elementos asociados con tres eventos celulares separadas.ww.jove.com/files/ftp_upload/4398/4398fig8large.jpg "target =" _blank "> Haga clic aquí para ampliar la figura.

7. Calidad de los eventos celulares. Observe cualquier fondo rayas en cada canal de isótopos, así como la velocidad de células de evento. El citómetro de masa reconoce un "evento célula" como un cierto aumento de señal por encima del fondo, por lo que la señal de fondo a partir de metal libre o no unido anticuerpo puede alterar el "evento célula" recuento. Además, ejecutando las células en una concentración demasiado alta puede causar un aumento en el número de eventos de doblete. Antecedentes puede ser disminuida por lavados adicionales o mayor dilución celular. Dobletes se puede minimizar mediante la dilución de células mayor, a costa de tiempo de ejecución mayor.
8. Acabado muestra adquisición de datos. Cuando el tiempo de adquisición se ha alcanzado, la recopilación de datos terminará. Habrá un poco de retraso antes de que una ventana pop-up con un "OK" aparece, de nuevo, esto se debe a "On-the-Fly" procesamiento de datos. Adquisición de las muestras también se puede parar Prematurely pulsando el botón "Stop". En este caso, todos los eventos celulares ya inscritos serán contados y se transforma en archivos de salida.
9. La inyección de al menos 500 l de agua MilliQ entre cada muestra también ayuda a minimizar la contaminación de las muestras.

4. Limpieza de la máquina tras uso

1. La solución de lavado. Después de que la muestra final se ejecuta y muestra el lazo de lavarse con agua, inyectar 450 l de solución de lavado en el circuito de la muestra. Controlar la liberación de metal libre en la ficha Calibración de masas de la ventana Configuración de adquisición de datos como en el paso 2,8 (Figura 9). Cuando la señal de metal libre comienza a disminuir, lavar con 3 ml de agua MilliQ y controlar los niveles de fondo hasta que se alcanzan.

Figura 9. Calibración de masas pestaña de la ventana, durante la limpieza post-carrera con solución de lavado DVS. Las rayas verticales en la región TOF 9800-11000 son etiqueta anticuerpo-isótopos que se están limpiando fuera de la máquina. Las rayas verticales alrededor TOF 11500 corresponden a los dos isótopos intercaladores IR. Haga clic aquí para ampliar la cifra .

5. Cierre de la Máquina

1. En la ficha Controlador RFG de la ventana de configuración del instrumento, seleccione "Detener Plasma". Cuando el procedimiento se haya completado, habrá una ventana emergente que le solicitará que retire el nebulizador. Pulse el botón "OK". En la ficha canastilla para tarjetas, apague el calentador. Cerrar la válvula en el suministro de argón.
2. La eliminación del nebulizador. Retire el nebulizador de la cámara de pulverización tirando cuidadosamente hacia atrás. Desenrosque el tubo de introducción de muestra de 1,6 pasos y coloque a un lado. Desenrosque el maquillaje conexión de introducción de gas para aflojar un poco y luego tirar el nebulizador. Dejando el racor atornillado se reducen las probabilidades de losing el negro junta tórica de goma y de plástico blanco pieza cónica.
3. Limpieza del nebulizador. Dejen ambos puertos del nebulizador con 5% Citranox usando la jeringa y el tubo como en el paso 1,3. Tienda, cubierta, en 5% Citranox hasta el próximo uso.

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Resultados

Siguiendo el protocolo anterior debe lograr cuatro cosas. En primer lugar, lo que permite suficiente tiempo de calentamiento para el citómetro de masas producirá un plasma caliente, estable necesaria para la formación óptima de la señal y óxido mínima. Segundo lavado adecuado del citómetro de masa con agua MilliQ y la solución de lavado DVS (Figura 9) ayudará a reducir los niveles de adsorción de metal a los tubos y otras partes de la máquina, lo que ayuda a reducir el fondo durante la adqui...

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Discusión

Para las últimas décadas, la citometría de flujo de fluorescencia ha sido un método caballo de trabajo para el análisis de células individuales, tanto en términos de expresión en la superficie y en ensayos funcionales. Sin embargo, los problemas de la superposición espectral de los colorantes fluorescentes se ha limitado el número de marcadores simultáneas. Mientras que los experimentos que utilizan más de 12 marcadores simultáneos se ha informado, el monto de la compensación necesaria que hace que este t?...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
CyTOF TM masa citómetro	DVS Ciencias
Solución de lavado	DVS Ciencias	201071	0,05% de ácido fluorhídrico en agua
Ajuste solución	DVS Ciencias	201072	0,5 ppm La, Cs, Tb, Tm, Ir, ácido nítrico rastro
Eu que contienen perlas de poliestireno	DVS Ciencias	201073	Contiene los isótopos naturales de abundancia de la UE; granos suministrados a aproximadamente 1 millón / mL
Múltiples que contienen lantánidos (La / Pr / Tb / Tm / Lu) - perlas de poliestireno	DVS Ciencias	Todavía no disponible en el mercado	Contiene abundancia natural de isótopos de lantánidos cotizadas
Ácido nítrico (concentrado)	Fisher Scientific	A467-500	Optima rastro de metal puro ICP-MS grado
El poliestireno de fondo redondo de tubo con células colador cap-5mL	BD	352235	utiliza para filtrar las muestras de células antes de la inyección
Norma-Ject tuberkulin jeringa 1 ml	Henke Sass Lobo	4010-200V0	sin silicona, libre de látex
Norma-Ject-3 ml jeringa	Henke Sass Lobo	4010.000V0	sin silicona, libre de látex
MilliQ agua			18 mW agua pura; no debe ser almacenado en botellas de vidrio o plástico que han sido lavadas con detergente comercial (debido a sus altos niveles de bario presente).
Citranox	Sigma-Aldrich	Z273236	ácido detergente
Gas argón	Praxair	AR 5.0UH-T	99,999% de pureza ultra alta