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Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the ...

Stanford University 

&#x5728;&#x8FD9;&#x4E2A;&#x5B9E;&#x9A8C;&#x5BA4;&#x4F53;&#x5916;&#x5DE5;&#x4F5C;&#x5DF2;&#x786E;&#x5B9A;&#x65B0; DNA &#x75C5;&#x53D8;&#x9020;&#x6210;&#x7684;&#x5E38;&#x89C1;&#x7684;&#x751F;&#x7269;&#x6807;&#x5FD7;&#x7269;&#x6C27;&#x5316;&#x635F;&#x4F24;&#xFF0C;8-&#x7FB0;&#x57FA;-7&#xFF0C;8-dihydroguanine (OG) &#x8FDB;&#x4E00;&#x6B65;&#x6C27;&#x5316;&#x3002;OG &#x6838;&#x82F7;&#x3001; &#x6838;&#x82F7;&#x9178;&#x6216;&#x4F7F;&#x7528;&#x4F5C;&#x4E3A;&#x4E00;&#x4E2A;&#x7535;&#x5B50;&#x6C27;&#x5316;&#x5242;&#x7684;&#x91D1;&#x5C5E;&#x79BB;&#x5B50;&#x7684;&#x5355;&#x94FE;&#x5BE1;&#x6838;&#x82F7;&#x9178;&#x4E2D;&#x6C27;&#x5316;&#x7684;&#x4E3B;&#x8981;&#x4EA7;&#x54C1;&#x662F;&#x65B0;&#x7684;&#x6838;&#x82F7;&#x7C7B;&#x884D;&#x751F; spiroiminodihydantoin (Sp)&#x3002;&#x5728;&#x53CC;&#x5DE5; DNA &#x751F;&#x6210;&#x5E73;&#x8861;&#x6DF7;&#x5408;&#x7684;&#x4E24;&#x79CD;&#x5F02;&#x6784;&#x4EA7;&#x54C1;&#xFF0C;guanidinohydantoin (Gh) &#x548C; iminoallantoin (Ia)&#x3002;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x4EA7;&#x54C1;&#x4E5F;&#x662F;&#x6574;&#x4F53;&#x56DB;&#x7535;&#x5B50;&#x6C27;&#x5316;&#x9E1F;&#x82F7;&#x7684;&#x5149;&#x5316;&#x5B66;&#x8FC7;&#x7A0B;&#x6D89;&#x53CA; O(2) &#x6240;&#x5F62;&#x6210;&#x7684;&#x3002;DNA &#x6A21;&#x677F;&#x94FE;&#x5305;&#x542B;&#x6BCF;&#x4E2A; Sp &#x6216; Gh/Ia &#x901A;&#x5E38;&#x5145;&#x5F53;&#x4E00;&#x4E2A;&#x5757;&#xFF0C;&#x4EE5;&#x4E0E; Klenow exo(-) &#x7247;&#x6BB5;&#x7684; DNA &#x5408;&#x6210;&#x7684; pol &#x6211;&#x3002;&#x7136;&#x800C;&#xFF0C;&#x6838;&#x82F7;&#x9178;&#x63D2;&#x5165;&#x672A;&#x53D1;&#x751F;&#x65F6;&#x5BF9;&#x9762;&#x7684;&#x75C5;&#x53D8;&#xFF0C;5-&#x4E09;&#x78F7;&#x9178;&#x8131;&#x6C27;&#x817A;&#x53EA;&#x6709; 2&#39;-&#x82F7;&#x548C; 2&#39;-deoxyguanine 5-&#x4E09;&#x78F7;&#x9178;&#x7528;&#x4E8E;&#x5E95;&#x6F06;&#x6269;&#x5C55;&#x3002;&#x5927;&#x80A0;&#x57C3;&#x5E0C;&#x6C0F;&#x5927;&#x80A0;&#x6746;&#x83CC; DNA &#x4FEE;&#x590D;&#x9176;&#x53F0;&#x5851;&#x5F97;&#x4EE5;&#x4ECE;&#x53CC;&#x9762; DNA &#x57FA;&#x677F;&#xFF0C;&#x79FB;&#x9664; Sp &#x548C; Gh/Ia &#x75C5;&#x53D8;&#x867D;&#x7136;&#x6548;&#x7387;&#x53D6;&#x51B3;&#x4E8E;&#x75C5;&#x53D8;&#x90E8;&#x4F4D;&#x5BF9;&#x9762;&#x57FA;&#x5730;&#x3002;

&#x7ED3;&#x6784;&#x548C;&#x6F5C;&#x5728;&#x7684;&#x81F4;&#x7A81;&#x53D8;&#x6027;&#x65B0;&#x7684;&#x4E59;&#x5185;&#x9170;&#x8132;&#x4EA7;&#x54C1;&#x4ECE;&#x9E1F;&#x82F7;&#x548C; 8-&#x7FB0;&#x57FA;-7&#xFF0C;8-dihydroguanine &#x8FC7;&#x6E21;&#x91D1;&#x5C5E;&#x6C27;&#x5316;&#x3002;

In vitro work in this laboratory has identified new DNA lesions resulting from further oxidation of a common biomarker of oxidative damage, 8-oxo-7,8-dihydroguanine (OG). The major product of oxidation of OG in a nucleoside, nucleotide, or single-stranded oligodeoxynucleotide using metal ions that act as one-electron oxidants is the new nucleoside derivative spiroiminodihydantoin (Sp). In duplex DNA an equilibrating mixture of two isomeric products, guanidinohydantoin (Gh) and iminoallantoin (Ia), is produced. These products are also formed by the overall four-electron oxidation of guanosine by photochemical processes involving O(2). DNA template strands containing either Sp or Gh/Ia generally acted as a block to DNA synthesis with the Klenow exo(-) fragment of pol I. However, when nucleotide insertion did occur opposite the lesions, only 2'-deoxyadenosine 5-triphosphate and 2'-deoxyguanine 5-triphosphate were used for primer extension. The Escherichia coli DNA repair enzyme Fpg was able to remove the Sp and Gh/Ia lesions from duplex DNA substrates, although the efficiency was depended on the base opposite the lesion.

Structure and potential mutagenicity of new hydantoin products from guanosine and 8-oxo-7,8-dihydroguanine oxidation by transition metals.

Travaux in vitro dans ce laboratoire a identifi&eacute; de nouvelles l&eacute;sions de l&#39;ADN r&eacute;sultant de l&#39;oxydation subs&eacute;quente d&#39;un biomarqueur commun des dommages oxydatifs, 8-oxo-7, 8-dihydroguanine (OG). Le principal produit de l&#39;oxydation d&#39;OG, nucl&eacute;osides, nucl&eacute;otides, ou simple brin oligodeoxynucleotide &agrave; l&#39;aide d&#39;ions m&eacute;talliques qui agissent comme un &eacute;lectron oxydants est le nouveau nucl&eacute;oside d&eacute;riv&eacute; spiroiminodihydantoin (Sp). Dans l&#39;ADN duplex un &eacute;quilibre m&eacute;lange de deux produits isom&egrave;res, guanidinohydantoin (Gh) et iminoallantoin (Ia), est produit. Ces produits sont aussi form&eacute;s par l&#39;oxydation dans l&#39;ensemble quatre &eacute;lectrons de guanosine par des processus photochimiques impliquant o (2). Les torons de descripteur d&#39;ADN contenant deux Sp ou Gh/Ia repr&eacute;sentation g&eacute;n&eacute;ralement comme un bloc de synth&egrave;se de l&#39;ADN avec le fragment de Klenow exo(-) de pol I. Toutefois, lors de l&#39;insertion de s&eacute;quences de nucl&eacute;otides a-t-elle &eacute;t&eacute; en face de l&eacute;sions, seulement-2 5-triphosphate d&#39;ad&eacute;nosine et &#39; 2&#39;-d&eacute;soxyguanosine 5-triphosphate ont &eacute;t&eacute; utilis&eacute;s pour l&#39;extension d&#39;amorce. L&#39;enzyme de r&eacute;paration de l&#39;ADN Escherichia coli Fpg a r&eacute;ussi &agrave; retirer les l&eacute;sions de Sp et Gh/Ia sur des substrats de l&#39;ADN duplex, bien que l&#39;efficacit&eacute; d&eacute;pend de la base en face de la l&eacute;sion.

Mutag&eacute;nicit&eacute; structure et le potentiel de nouveaux produits de hydanto&iuml;ne de guanosine et 8-oxo-7, 8-dihydroguanine d&#39;oxydation de m&eacute;taux de transition.

In-vitro-arbeiten in diesem Labor hat neue DNA-L&auml;sionen infolge weiterer Oxidation von gemeinsamen Biomarker der oxidative Sch&auml;den, 8-Oxo-7, 8-Dihydroguanine (OG) identifiziert. Das Hauptprodukt der Oxidation der OG in einem Nukleosid, Nukleotid oder einzelstr&auml;ngige Oligodeoxynucleotide mit Metallionen, die als ein-Elektron-Oxidantien wirken ist die neue Nukleosid Derivative Spiroiminodihydantoin (Sp). In duplex DNA wird eine dieen ausgleichenden Mischung der beiden Isomeren Produkte Guanidinohydantoin (Gh) und Iminoallantoin (Ia), produziert. Diese Produkte werden auch durch die insgesamt vier-Elektronen-Oxidation von Guanosin durch photochemische Prozesse mit O(2) gebildet. DNA Schablone Litzen mit SPS oder Gh/Ia agierte im Allgemeinen als Block zu DNA-Synthese mit dem Klenow-exo(-)-Fragment von Pol I. Jedoch wenn Nukleotid Einf&uuml;gemarke gegen&uuml;ber der L&auml;sionen auftreten, waren nur 2&#39;-Deoxyadenosine 5-Triphosphat und 2&#39;-Deoxyguanine 5-Triphosphat f&uuml;r Z&uuml;ndkapselextension verwendet. Escherichia coli DNA-Reparatur-Enzym Fpg konnte sich duplex DNA-Substrate, die Sp und Gh/Ia L&auml;sionen entziehen, obwohl die Effizienz auf der Basis gegen&uuml;ber der L&auml;sion angewiesen war.

Struktur und Potential Mutagenit&auml;t Hydantoin-Neuheiten von Guanosin und 8-Oxo-7, 8-Dihydroguanine Oxidation von &Uuml;bergangsmetalle.

Lavoro in vitro in questo laboratorio ha individuato nuove lesioni del DNA derivante dall&#39;ulteriore ossidazione di un biomarcatore comune di danno ossidativo, 8-oxo-7,8-dihydroguanine (OG). Il prodotto principale di ossidazione di OG in un nucleoside, nucleotide o single-stranded oligodeoxynucleotide usando gli ioni del metallo che agiscono come ossidanti one-electron &egrave; la nuova spiroiminodihydantoin derivati nucleosidici (Sp). Nel DNA duplex &egrave; prodotta una miscela di due prodotti isomeri, guanidinohydantoin (Gh) e iminoallantoin (Ia), geografico. Questi prodotti sono anche formati dall&#39;ossidazione complessivamente quattro-elettrone di guanosina dai processi fotochimici che coinvolgono apparato. Mascherina del DNA strands contenenti entrambi Sp o Gh/Ia generalmente ag&igrave; come un blocco di sintesi del DNA con il frammento di Klenow exo(-) Pol I. Tuttavia, quando inserzione nucleotidica &egrave; avvenuta di fronte le lesioni, sono stati utilizzati solo 2&#39;--deossiadenosina 5-trifosfato e 2&#39; deoxyguanine 5-trifosfato per estensione dell&#39;iniettore. L&#39;enzima di riparazione del DNA di Escherichia coli Fpg &egrave; stato in grado di rimuovere le lesioni Sp e Gh/Ia da substrati duplex di DNA, anche se l&#39;efficienza &egrave; stato dipendeva dalla base di fronte alla lesione.

Struttura e potenziale mutagenicit&agrave; di nuovo idantoina prodotti dall&#39;ossidazione di guanosina e 8-oxo-7,8-dihydroguanine di metalli di transizione.

In vitro &#x3067;&#x306E;&#x4F5C;&#x696D;&#x3053;&#x306E;&#x7814;&#x7A76;&#x5BA4;&#x3067;&#x306F;&#x3055;&#x3089;&#x306B;&#x9178;&#x5316;&#x7684;&#x640D;&#x50B7;&#x3001;8-&#x30AA;&#x30AD;&#x30BD;-7, 8-dihydroguanine (OG) &#x306E;&#x4E00;&#x822C;&#x7684;&#x306A;&#x30D0;&#x30A4;&#x30AA; &#x30DE;&#x30FC;&#x30AB;&#x30FC;&#x306E;&#x9178;&#x5316;&#x306B;&#x8D77;&#x56E0;&#x65B0;&#x3057;&#x3044; DNA &#x75C5;&#x5909;&#x3092;&#x7279;&#x5B9A;&#x3057;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;OG &#x306E;&#x30CC;&#x30AF;&#x30EC;&#x30AA;&#x30B7;&#x30C9;&#x3001;&#x30CC;&#x30AF;&#x30EC;&#x30AA;&#x30C1;&#x30C9;&#x3001;&#x307E;&#x305F;&#x306F;&#x884C;&#x52D5;&#x3059;&#x308B;&#x4E00;&#x96FB;&#x5B50;&#x9178;&#x5316;&#x5264;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x91D1;&#x5C5E;&#x30A4;&#x30AA;&#x30F3;&#x3092;&#x7528;&#x3044;&#x305F;&#x5358;&#x4E00;&#x5EA7;&#x7901;&#x3055;&#x305B;&#x305F; dna &#x3092;&#x7528;&#x3044;&#x305F;&#x7D4C;&#x306E;&#x9178;&#x5316;&#x306E;&#x4E3B;&#x8981;&#x306A;&#x88FD;&#x54C1;&#x306F;&#x3001;&#x65B0;&#x898F;&#x30CC;&#x30AF;&#x30EC;&#x30AA;&#x30B7;&#x30C9;&#x8A98;&#x5C0E;&#x4F53; spiroiminodihydantoin (Sp) &#x3067;&#x3059;&#x3002;&#x4E8C;&#x91CD;&#x306E; DNA &#x306B;&#x306F; guanidinohydantoin (Gh) &#x3068; iminoallantoin (Ia)&#x3001;2 &#x3064;&#x306E;&#x7570;&#x6027;&#x4F53;&#x88FD;&#x54C1;&#x306E;&#x5747;&#x8861;&#x5316;&#x6DF7;&#x5408;&#x7269;&#x4F5C;&#x308A;&#x51FA;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x88FD;&#x54C1;&#x306F;&#x3001;&#x307E;&#x305F; O(2) &#x3092;&#x4F34;&#x3046;&#x5149;&#x5316;&#x5B66;&#x30D7;&#x30ED;&#x30BB;&#x30B9;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x30B0;&#x30A2;&#x30CE;&#x30B7;&#x30F3;&#x306E;&#x5168;&#x4F53;&#x7684;&#x306A; 4 &#x96FB;&#x5B50;&#x9178;&#x5316;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x5F62;&#x6210;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3044;&#x305A;&#x308C;&#x304B;&#x306E; Sp &#x3092;&#x542B;&#x3080; DNA &#x30C6;&#x30F3;&#x30D7;&#x30EC;&#x30FC;&#x30C8;&#x3092;&#x9396;&#x307E;&#x305F;&#x306F; Gh/Ia &#x306F;&#x3001;&#x4E00;&#x822C;&#x7684;&#x306B;&#x3001;&#x79C1;&#x3092;&#x30D6;&#x30ED;&#x30C3;&#x30AF;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x306E; pol &#x306E; Klenow exo(-) &#x30D5;&#x30E9;&#x30B0;&#x30E1;&#x30F3;&#x30C8;&#x306B;&#x3088;&#x308B; DNA &#x5408;&#x6210;&#x3092;&#x632F;&#x308B;&#x821E;&#x3063;&#x305F;&#x3002;&#x305F;&#x3060;&#x3057;&#x3001;&#x30CC;&#x30AF;&#x30EC;&#x30AA;&#x30C1;&#x30C9;&#x306E;&#x633F;&#x5165;&#x306E;&#x53CD;&#x5BFE;&#x5074;&#x306E;&#x75C5;&#x5909;&#x304C;&#x767A;&#x751F;&#x3057;&#x305F;&#x3068;&#x304D;&#x306B;&#x3001;&#x552F;&#x4E00; 2&#39;--&#x30C7;&#x30AA;&#x30AD;&#x30B7;&#x30A2;&#x30C7;&#x30CE;&#x30B7;&#x30F3; 5-&#x4E09;&#x30EA;&#x30F3;&#x9178;&#x3068; 2&#39; deoxyguanine 5-&#x4E09;&#x30EA;&#x30F3;&#x4F7F;&#x7528;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x30D7;&#x30E9;&#x30A4;&#x30DE;&#x30FC;&#x306E;&#x62E1;&#x5F35;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x3002;&#x52B9;&#x7387;&#x75C5;&#x5909;&#x5411;&#x304B;&#x3044;&#x30D9;&#x30FC;&#x30B9;&#x4F9D;&#x5B58;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x305F;&#x304C;&#x5927;&#x8178;&#x83CC;&#x5927;&#x8178;&#x83CC; DNA &#x4FEE;&#x5FA9;&#x9175;&#x7D20; Fpg Sp &#x3068; Gh/Ia &#x75C5;&#x5909;&#x4E8C;&#x91CD;&#x306E; DNA &#x57FA;&#x677F;&#x304B;&#x3089;&#x524A;&#x9664;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x305F;&#x3002;

&#x69CB;&#x9020;&#x3068;&#x96FB;&#x4F4D;&#x306E;&#x5909;&#x7570;&#x539F;&#x6027;&#x30B0;&#x30A2;&#x30CE;&#x30B7;&#x30F3;&#x304A;&#x3088;&#x3073; 8-&#x30AA;&#x30AD;&#x30BD;-7, 8-dihydroguanine &#x306E;&#x9178;&#x5316;&#x306B;&#x3088;&#x308B;&#x9077;&#x79FB;&#x91D1;&#x5C5E;&#x304B;&#x3089;&#x65B0;&#x3057;&#x3044;&#x30D2;&#x30C0;&#x30F3;&#x30C8;&#x30A4;&#x30F3;&#x88FD;&#x54C1;&#x3002;

&#xC774; &#xC2E4;&#xD5D8;&#xC2E4;&#xC5D0;&#xC11C; &#xCCB4; &#xC678; &#xC791;&#xC5C5;&#xC758; &#xC0B0;&#xD654; &#xC190;&#xC0C1;, 8-&#xC625; &#xC18C;-7, 8-dihydroguanine (&#xC640;)&#xC758; &#xC77C;&#xBC18;&#xC801;&#xC778; biomarker &#xB354; &#xC0B0;&#xD654;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC720;&#xB798;&#xD55C; &#xC0C8;&#xB85C;&#xC6B4; DNA &#xBCD1; &#xBCC0; &#xD655;&#xC778; &#xD588;&#xB2E4;. &#xB274; &#xD074;&#xB808; &#xC624; &#xC2DC;&#xB4DC;, &#xB274;&#xD074;&#xB808;&#xC624;&#xD2F0;&#xB4DC;, &#xB610;&#xB294; &#xD558;&#xB098;&#xC758; &#xC804;&#xC790; oxidants &#xD589;&#xC704;&#xB85C; &#xAE08;&#xC18D; &#xC774;&#xC628;&#xC744; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xB2E8;&#xC77C; &#xAC00;&#xB2E5; oligodeoxynucleotide OG&#xC758; &#xC0B0;&#xD654;&#xC758; &#xC8FC;&#xC694; &#xC81C;&#xD488;&#xC740; &#xC0C8;&#xB85C;&#xC6B4; &#xB274; &#xD074;&#xB808; &#xC624; &#xC2DC;&#xB4DC; &#xD30C;&#xC0DD; spiroiminodihydantoin (Sp) &#xC774;&#xB2E4;. &#xC774;&#xC911; DNA equilibrating guanidinohydantoin (Gh) &#xBC0F; iminoallantoin (&#xC544;&#xC774;&#xC624;&#xC640;), &#xB450; &#xC774;&#xC131;&#xC9C8;&#xD575; &#xC81C;&#xD488; &#xD63C;&#xD569;&#xBB3C;&#xC744; &#xC0DD;&#xC0B0;. &#xC774; &#xC81C;&#xD488; &#xB610;&#xD55C; &#xAD11;&#xD654;&#xD559; &#xD504;&#xB85C;&#xC138;&#xC2A4; O(2)&#xB97C; &#xD3EC;&#xD568; &#xD558; &#xC5EC; guanosine &#xC804;&#xBC18;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; 4-&#xC804;&#xC790; &#xC0B0;&#xD654;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xD615;&#xC131; &#xB41C;&#xB2E4;. DNA &#xD15C;&#xD50C;&#xB81B; &#xBB3C;&#xAC00; &#xC911; Sp &#xD3EC;&#xD568; &#xD558; &#xB610;&#xB294; Gh/Ia &#xC77C;&#xBC18;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xD589;&#xB3D9; pol&#xC758; Klenow exo(-) &#xC870;&#xAC01; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; DNA &#xD569;&#xC131;&#xC5D0; &#xBE14;&#xB85D;&#xC73C;&#xB85C; &#xB098;. &#xADF8;&#xB7EC;&#xB098;, &#xBCD1; &#xBCC0; &#xBC18;&#xB300;&#xD3B8; &#xB274;&#xD074;&#xB808;&#xC624;&#xD2F0;&#xB4DC; &#xC0BD;&#xC785; &#xD55C; &#xBC1C;&#xC0DD; &#xC720;&#xC77C;&#xD55C; 2&#39;-deoxyadenosine 5-&#xC0BC;&#xC778;&#xC0B0;&#xACFC; 2&#39;-deoxyguanine 5-&#xC0BC;&#xC778;&#xC0B0;&#xC740; &#xB1CC;&#xAD00; &#xC5F0;&#xC7A5;&#xC5D0; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xB418;&#xC5C8;&#xB2E4;. &#xBE44;&#xB85D; &#xD6A8;&#xC728;&#xC131; &#xBCD1; &#xBCC0; &#xBC18;&#xB300; &#xC790;&#xB8CC;&#xC5D0; &#xC758;&#xC874; &#xD558;&#xB294; &#xBCD1;&#xC6D0; &#xC131; &#xB300;&#xC7A5;&#xADE0; DNA &#xC218;&#xB9AC; &#xD6A8;&#xC18C; Fpg &#xAE30;&#xD310;, DNA &#xC774;&#xC911;&#xC5D0;&#xC11C; Sp &#xBC0F; Gh/Ia &#xBCD1; &#xBCC0;&#xC744; &#xC81C;&#xAC70; &#xC218; &#xC788;&#xC5C8;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;.

&#xC804;&#xC774; &#xAE08;&#xC18D;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; guanosine &#xBC0F; 8-&#xC625; &#xC18C;-7, 8-dihydroguanine &#xC0B0;&#xD654;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC0C8;&#xB85C;&#xC6B4; hydantoin &#xC81C;&#xD488;&#xC758; &#xAD6C;&#xC870;&#xC640; &#xC7A0;&#xC7AC;&#xC801;&#xC778; &#xBCC0;&#xC774;.

Trabajo in vitro en este laboratorio ha identificado nuevas lesiones de ADN resultantes de la oxidaci&oacute;n adicional de un biomarcador com&uacute;n del da&ntilde;o oxidativo, 8-oxo-7, 8-dihydroguanine (OG). El principal producto de oxidaci&oacute;n de OG en nucle&oacute;sidos, nucle&oacute;tidos o monocatenario oligodeoxynucleotide con iones met&aacute;licos que act&uacute;an como oxidantes de un electr&oacute;n es el nuevo spiroiminodihydantoin derivados de nucle&oacute;sidos (Sp). En DNA d&uacute;plex se produce una mezcla equilibradores de dos productos isom&eacute;ricos, guanidinohydantoin (Gh) y iminoallantoin (Ia). Estos productos tambi&eacute;n est&aacute;n formados por la oxidaci&oacute;n total de cuatro electrones de guanosina por procesos fotoqu&iacute;micos que implica O(2). Plantilla de ADN en hebras que contiene cualquier Sp o Gh/Ia generalmente actuaba como un bloque a la s&iacute;ntesis de ADN con el fragmento Klenow del exo(-) de pol I. Sin embargo, cuando la inserci&oacute;n de nucle&oacute;tidos ocurri&oacute; frente a las lesiones, s&oacute;lo 2&#39;-Desoxiadenosina 5-trifosfato y 2&#39;-deoxyguanine 5-trifosfato fueron utilizados para la extensi&oacute;n de la cartilla. La enzima de reparaci&oacute;n del ADN Escherichia coli Fpg fue capaz de eliminar las lesiones Sp y Gh/Ia de sustratos de DNA d&uacute;plex, aunque la eficacia era depend&iacute;a de la base frente a la lesi&oacute;n.

Mutagenicidad de estructura y potencial de nuevos productos de hidanto&iacute;na de guanosina y 8-oxo-7,8-dihydroguanine oxidaci&oacute;n por metales de transici&oacute;n.

8-&#x7FB0;&#x57FA;-7&#xFF0C;8-dihydroguanine (OG) &#x5BB9;&#x6613;&#x53D7;&#x5230;&#x8FDB;&#x4E00;&#x6B65;&#x6C27;&#x5316;&#x4F53;&#x5916;&#xFF0C;&#x5F62;&#x6210;&#x4E24;&#x4E2A;&#x4E8C;&#x7EA7;&#x6C27;&#x5316;&#x4EA7;&#x7269;&#xFF0C;guanidinohydantoin (Gh) &#x548C; spiroiminodihydantoin (Sp)&#x3002;&#x8FD9;&#x4E2A;&#x5B9E;&#x9A8C;&#x5BA4;&#x4ECE;&#x4EE5;&#x524D;&#x7684;&#x5DE5;&#x4F5C;&#x8868;&#x660E;&#xFF0C;&#x627F;&#x8BA4;&#x5E76;&#x4ECE;&#x53CC;&#x9762; DNA &#x57FA;&#x677F;&#x5207;&#x5272;&#x7531;&#x5927;&#x80A0;&#x57C3;&#x5E0C;&#x6C0F;&#x5927;&#x80A0;&#x6746;&#x83CC; DNA &#x4FEE;&#x590D;&#x9176;&#x53F0;&#x5851; OG&#x3001; Gh &#x548C; Sp&#x3002;&#x5728;&#x672C;&#x62A5;&#x544A;&#x4E2D;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x5411;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x7814;&#x7A76;&#x529F;&#x80FD;&#x76F8;&#x5173;&#x7684;&#x771F;&#x6838; OG glycosylases (OGG) &#x4ECE;&#x9175;&#x6BCD;&#x548C;&#x4EBA;&#x7C7B;&#xFF1A; yOGG1&#xFF0C;yOGG2&#xFF0C;&#x548C; hOGG1&#x3002;HOGG1 &#x9176;&#x662F;&#x53EA;&#x5BF9;&#x7F9F;&#x57FA;&#x9E1F;&#x560C; 8-&#x5464;&#xFF0C;&#x5C55;&#x793A;&#x4ECE; OG 8-&#x7F9F;&#x57FA;&#x9E1F;&#x560C;&#x5464;&#x8131; 1000-fold &#x901F;&#x5EA6;&#x66F4;&#x5FEB;&#x7684;&#x6E05;&#x9664;&#x6D3B;&#x52A8;&#x3002;&#x53CC; C &#x5305;&#x542B;&#x5DE5;&#x76F8;&#x5BF9;&#x4E8E;&#x5176; OG&#x3002;&#x540C;&#x884C;&#x3002;&#x53CC;&#x5DE5;&#x542B; Gh &#x6216;&#x5BF9;&#x9762;&#x7684;&#x56DB;&#x5927;&#x5929;&#x7136;&#x57FA;&#x5730;&#x4EFB;&#x4F55; Sp &#x4E0D;&#x662F; hOGG1 &#x9176;&#x7684;&#x57FA;&#x8D28;&#x3002;&#x76F8;&#x6BD4;&#x4E4B;&#x4E0B;&#xFF0C;yOGG1 &#x548C; yOGG2 &#x9176;&#x5220;&#x9664; Gh &#x548C; Sp 18 bp &#x53CC;&#x5DE5;&#x6548;&#x7387;&#x76F8;&#x5BF9;&#x8F83;&#x9AD8;&#x7684;&#x65B9;&#x5F0F;&#x3002;&#x542B;&#x6709;&#x751F;&#x957F;&#x6FC0;&#x7D20;&#x548C; Sp &#x53CC;&#x5DE5;&#x4E0E; yOGG1 &#x53CD;&#x5E94;&#x7684;&#x901F;&#x5EA6;&#x8BF4;&#xFF0C;&#x6CA1;&#x6709;&#x663E;&#x8457;&#x7684;&#x5DEE;&#x522B;&#x3002;&#x4F46;&#x662F;&#xFF0C;yOGG2 Sp &#x6BD4; Gh &#x66F4;&#x5FEB;&#x7684;&#x901F;&#x5EA6;&#x88AB;&#x5220;&#x9664;&#x3002;&#x8FD9;&#x4E24;&#x4E2A; yOGG &#x9176;&#x8868;&#x73B0;&#x51FA;&#x75C5;&#x53D8;&#x90E8;&#x4F4D;&#xFF0C;&#x8FD9;&#x8868;&#x660E;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x9176;&#x6D3B;&#x6027;&#x53EF;&#x80FD; promutagenic &#x5BF9;&#x9762;&#x57FA;&#x5730;&#x53EF;&#x4EE5;&#x5FFD;&#x7565;&#x4E0D;&#x8BA1;&#x4F9D;&#x8D56;&#x3002;&#x5947;&#x602A;&#x7684;&#x662F;&#xFF0C;&#x5728; 18 bp &#x5E8F;&#x5217;&#x4E2D;&#xFF0C;&#x8FD9;&#x4E24;&#x4E2A; yOGG &#x9176;&#x4E5F;&#x6CA1;&#x6709;&#x5448;&#x73B0; OG &#x53D6;&#x6D88;&#x6D3B;&#x52A8;&#x3002;&#x4F46;&#x662F;&#xFF0C;&#x4E24;&#x8005;&#x90FD;&#x5220;&#x9664; OG 30 bp &#x5DE5;&#x4E0E;&#x5468;&#x56F4; OG &#x4E0D;&#x540C;&#x5E8F;&#x5217;&#x3002;&#x8303;&#x56F4;&#x5E7F;&#x6CDB;&#x9075;&#x5B88;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x4E0D;&#x540C;&#x5E95;&#x7269;&#x4E0E;&#x9176;&#x4F53;&#x5916;&#x4FEE;&#x590D;&#x6548;&#x7387;&#x7684;&#x5EFA;&#x8BAE;&#x8FD9;&#x4F1A;&#x5927;&#x5927;&#x5F71;&#x54CD;&#x4F53;&#x5185;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x75C5;&#x53D8;&#x7684;&#x81F4;&#x7A81;&#x53D8;&#x6027;&#x3002;&#x4E8B;&#x5B9E;&#x4E0A;&#xFF0C;yOGG &#x7684;&#x8FDB;&#x4E00;&#x6B65;&#x6C27;&#x5316;&#x4EA7;&#x7269;&#xFF0C;Gh &#x548C; Sp&#xFF0C;8-&#x7F9F;&#x57FA;&#x9E1F;&#x560C;&#x5464;&#x7236;&#x6BCD;&#x5BF9;&#x53BB;&#x9664;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x7684;&#x6548;&#x7387;&#x7684;&#x63D0;&#x9AD8;&#x610F;&#x5473;&#x7740;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x75C5;&#x53D8;&#x53EF;&#x80FD;&#x662F;&#x4F53;&#x5185;&#x7684;&#x9996;&#x9009;&#x886C;&#x5E95;&#x3002;

&#x8BC6;&#x522B;&#x548C;&#x6E05;&#x9664;&#x6C27;&#x5316; guanines &#x53CC;&#x9762; DNA &#x7531;&#x57FA;&#x5207;&#x9664;&#x672F;&#x4E2D;&#x7684;&#x4FEE;&#x590D;&#x9176; hOGG1&#x3001; yOGG1&#x3001; yOGG2&#x3002;

8-Oxo-7,8-dihydroguanine (OG) is susceptible to further oxidation in vitro to form two secondary oxidation products, guanidinohydantoin (Gh) and spiroiminodihydantoin (Sp). Previous work from this laboratory has shown that OG, Gh, and Sp are recognized and excised from duplex DNA substrates by the Escherichia coli DNA repair enzyme Fpg. In this report, we extend these studies to the functionally related eukaryotic OG glycosylases (OGG) from yeast and humans: yOGG1, yOGG2, and hOGG1. The hOGG1 enzyme was active only toward the removal of 8-oxoguanine, exhibiting a 1000-fold faster rate of removal of 8-oxoguanine from OG.C-containing duplexes relative to their OG.A counterparts. Duplexes containing Gh or Sp opposite any of the four natural bases were not substrates for the hOGG1 enzyme. In contrast, both yOGG1 and yOGG2 enzymes removed Gh and Sp in a relatively efficient manner from an 18 bp duplex. No significant difference was observed in the rate of reaction of Gh- and Sp-containing duplexes with yOGG1. However, yOGG2 removed Sp at a faster rate than Gh. Both yOGG enzymes exhibit a negligible dependence on the base opposite the lesion, suggesting that the activity of these enzymes may be promutagenic. Surprisingly, in the 18 bp sequence context, both yOGG enzymes did not exhibit OG removal activity. However, both removed OG in a 30 bp duplex with a different sequence surrounding the OG. The wide range of repair efficiencies observed by these enzymes with different substrates in vitro suggests that this could greatly affect the mutagenicity of these lesions in vivo. Indeed, the greater efficiency of the yOGG proteins for removal of the further oxidized products, Gh and Sp, over their 8-oxoguanine parent, suggests that these lesions may be the preferred substrates in vivo.

Recognition and removal of oxidized guanines in duplex DNA by the base excision repair enzymes hOGG1, yOGG1, and yOGG2.

8-Oxo-7, 8-dihydroguanine (OG) est sensible &agrave; l&#39;oxydation subs&eacute;quente in vitro pour former deux produits d&#39;oxydation secondaire, guanidinohydantoin (Gh) et spiroiminodihydantoin (Sp). Des travaux ant&eacute;rieurs dans ce laboratoire ont d&eacute;montr&eacute; que OG, Gh Sp reconnus et sont pr&eacute;lev&eacute;s sur des substrats de l&#39;ADN duplex de l&#39;enzyme de r&eacute;paration de l&#39;ADN Escherichia coli Fpg. Dans le pr&eacute;sent rapport, nous exprimons ces &eacute;tudes &agrave; la fonctionnellement les eucaryotes OG glycosylases (OGG) de levure et de l&#39;homme : yOGG1, yOGG2 et hOGG1. L&#39;enzyme hOGG1 est active seulement aux d&eacute;manteler 8-oxoguanine, exposant mixte vite de l&#39;enl&egrave;vement de 8-oxoguanine d&#39;OG.Duplex contenant C par rapport &agrave; leur OG.Un homologues. Duplex contenant Gh ou Sp en face d&#39;une des quatre bases naturelles n&#39;est pas des substrats pour l&#39;enzyme hOGG1. En revanche, les enzymes yOGG1 et yOGG2 supprim&eacute; Gh et Sp de fa&ccedil;on relativement efficace d&#39;un duplex de bp 18. Aucune diff&eacute;rence significative n&#39;a &eacute;t&eacute; observ&eacute;e dans le taux de r&eacute;action des duplex contenant Gh et Sp avec yOGG1. Cependant, yOGG2 supprim&eacute; Sp &agrave; un rythme plus rapide que la Gh. Les deux enzymes yOGG pr&eacute;sentent une d&eacute;pendance n&eacute;gligeable sur le socle en face de la l&eacute;sion, ce qui sugg&egrave;re que l&#39;activit&eacute; de ces enzymes peut-&ecirc;tre &ecirc;tre promutagenic. &Eacute;tonnamment, dans le contexte de s&eacute;quence bp 18, les deux enzymes yOGG ne pr&eacute;sentaient pas activit&eacute; suppression OG. Toutefois, tous deux supprim&eacute;s OG dans un duplex bp 30 avec une autre s&eacute;quence entourant les Jeux olympiques. La vaste gamme des efficacit&eacute;s de r&eacute;paration observ&eacute;es par ces enzymes avec diff&eacute;rents substrats in vitro sugg&egrave;re que cela pourrait grandement affecter le pouvoir mutag&egrave;ne de ces l&eacute;sions in vivo. En effet, le plus grande efficacit&eacute; des prot&eacute;ines yOGG pour &eacute;liminer les autres produits oxyd&eacute;s, Gh et Sp, au fil de leur parent de la 8-oxoguanine, donne &agrave; penser que ces l&eacute;sions peuvent &ecirc;tre les substrats pr&eacute;f&eacute;r&eacute;s in vivo.

La reconnaissance et la suppression des guanines oxyd&eacute;s en duplex de l&#39;ADN par l&#39;excision de base r&eacute;parent les enzymes hOGG1, yOGG1 et yOGG2.

8-Oxo-7, 8-Dihydroguanine (OG) ist anf&auml;llig f&uuml;r weitere Oxydation in-vitro zwei sekund&auml;re Oxidationsprodukten, Guanidinohydantoin (Gh) und Spiroiminodihydantoin (Sp) zu bilden. Fr&uuml;here Arbeiten von diesem Labor ergab, dass OG, Gh und Sp erkannt und von duplex DNA-Substrate von Escherichia coli DNA-Reparatur-Enzym Fpg herausgeschnitten werden. In diesem Bericht, wir erweitern diese Studien zu den verwandeten eukaryotischen OG Glycosylases (OGG) von Hefe und Menschen: yOGG1, yOGG2, und hOGG1. Das hOGG1 Enzym war erst gegen die Abschaffung der 8-OGG1, 1000-fold schneller Entfernung des 8-OGG1 von OG ausstellen.C-haltigen Duplices relativ zu ihrer OG.Einen Kollegen. Duplex mit Gh oder Sp gegen&uuml;ber jeder der vier nat&uuml;rlichen Grundlagen waren nicht Substrate f&uuml;r das Enzym hOGG1. Im Gegensatz dazu entfernt sowohl die yOGG1 als auch die yOGG2 Enzyme Gh und Sp in einem relativ effiziente Weise aus einer 18 bp-Duplex. Kein signifikanter Unterschied war die Rate der Reaktion des Gh - und Sp-haltigen Duplexe mit yOGG1 beobachtet. Jedoch entfernt yOGG2 Sp mit einer schnelleren Rate als Gh. Beide yOGG-Enzyme weisen eine vernachl&auml;ssigbare Abh&auml;ngigkeit auf der Basis gegen&uuml;ber der L&auml;sion, was darauf hindeutet, dass die Aktivit&auml;t dieser Enzyme Promutagenic sein kann. &Uuml;berraschenderweise im Zusammenhang mit 18 bp Sequenz, beide yOGG-Enzyme nicht OG Entfernung Aktivit&auml;t aufweisen. Jedoch entfernt beide OG im 30 bp Duplex mit eine andere Sequenz, die rund um die OG. Das breite Spektrum der Reparatur Wirkungsgrade von diese Enzyme mit unterschiedlichen Substraten in-vitro beobachtet legt nahe, dass dies die Mutagenit&auml;t diese L&auml;sionen in-vivo stark beeintr&auml;chtigen k&ouml;nnten. Die gr&ouml;&szlig;ere Effizienz der yOGG-Proteine f&uuml;r die Entfernung der weiteren oxidierte Produkte, Gh und Sp, &uuml;ber Eltern 8-OGG1 deutet, an, dass diese L&auml;sionen k&ouml;nnen die bevorzugten Substrate in-vivo.

Erkennung und Entfernung von oxidierten Guanines in duplex DNA durch die base Exzision reparieren Enzyme hOGG1, yOGG1 und yOGG2.

8-Oxo-7,8-dihydroguanine (OG) &egrave; suscettibile di ulteriore ossidazione in vitro per formare due prodotti di ossidazione secondaria, guanidinohydantoin (Gh) e spiroiminodihydantoin (Sp). Lavoro precedente da questo laboratorio ha mostrato che OG, Gh e Sp sono riconosciuti e asportato da substrati duplex di DNA con l&#39;enzima di riparazione del DNA di Escherichia coli Fpg. In questa relazione, abbiamo estendere questi studi ai glycosylases OG eucariotica funzionalmente correlati (OGG) da lievito e gli esseri umani: yOGG1, yOGG2 e hOGG1. L&#39;enzima hOGG1 era attivo solo verso la rimozione di 8-oxoguanine, esibendo un tasso pi&ugrave; veloce di rimozione di 8-oxoguanine da OG.Doppiette contenenti C rispetto al loro OG.Una controparte. Doppiette contenenti Gh o Sp di fronte una delle quattro basi naturali non erano substrati per l&#39;enzima hOGG1. Al contrario, sia yOGG1 che yOGG2 enzimi rimosso Gh e Sp in maniera relativamente efficiente da un duplex bp 18. Nessuna differenza significativa &egrave; stata osservata nel tasso di reazione di doppiette contenenti Gh e Sp con yOGG1. Tuttavia, yOGG2 rimosso Sp ad un tasso pi&ugrave; veloce di Gh. Entrambi gli enzimi yOGG esibiscono una dipendenza trascurabile sulla base di fronte alla lesione, suggerendo che l&#39;attivit&agrave; di questi enzimi pu&ograve; essere promutagenic. Sorprendentemente, nel contesto sequenza bp 18, entrambi gli enzimi yOGG non hanno esibito attivit&agrave; rimozione OG. Tuttavia, entrambi rimossi OG in un duplex bp 30 con una sequenza diversa che circonda l&#39;OG. La vasta gamma delle efficienze di riparazione osservato da questi enzimi con differenti substrati in vitro suggerisce che questo potrebbe influenzare notevolmente la mutagenicit&agrave; di queste lesioni in vivo. Infatti, la maggiore efficienza delle proteine per la rimozione dei ulteriormente ossidati prodotti, Gh e Sp, sopra loro padre 8-oxoguanine, yOGG suggerisce che queste lesioni possono essere i preferito substrati in vivo.

Riconoscimento e la rimozione di guanines ossidato nel DNA duplex dalla base escissione riparazione enzimi hOGG1, yOGG1 e yOGG2.

8-&#x30AA;&#x30AD;&#x30BD;-7, 8-dihydroguanine (OG) (Sp) guanidinohydantoin (Gh) &#x3068; spiroiminodihydantoin &#x306E; 2 &#x3064;&#x306E;&#x30BB;&#x30AB;&#x30F3;&#x30C0;&#x30EA;&#x9178;&#x5316;&#x88FD;&#x54C1;&#x3092;&#x5F62;&#x6210;&#x3059;&#x308B;&#x4F53;&#x5916;&#x3055;&#x3089;&#x306B;&#x9178;&#x5316;&#x306B;&#x654F;&#x611F;&#x3067;&#x3042;&#x308A;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x306E;&#x7814;&#x7A76;&#x6240;&#x304B;&#x3089;&#x306E;&#x524D;&#x306E;&#x4ED5;&#x4E8B;&#x306F;&#x3001;OG&#x3001;Gh&#x3001;&#x304A;&#x3088;&#x3073; Sp &#x8A8D;&#x8B58;&#x3001;&#x5927;&#x8178;&#x83CC;&#x5927;&#x8178;&#x83CC; DNA &#x4FEE;&#x5FA9;&#x9175;&#x7D20;&#x306B;&#x3088;&#x308B; Fpg &#x4E8C;&#x91CD; DNA &#x57FA;&#x677F;&#x304B;&#x3089;&#x6458;&#x51FA;&#x3057;&#x305F;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x306E;&#x30EC;&#x30DD;&#x30FC;&#x30C8;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x79C1;&#x305F;&#x3061;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x7814;&#x7A76;&#x306F;&#x6A5F;&#x80FD;&#x7684;&#x306B;&#x95A2;&#x9023;&#x3057;&#x305F;&#x771F;&#x6838;&#x751F;&#x7269; OG glycosylases (OGG) &#x9175;&#x6BCD;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x30D2;&#x30C8;&#x304B;&#x3089;&#x62E1;&#x5F35;&#xFF1A; yOGG1&#x3001;yOGG2&#x3001;&#x304A;&#x3088;&#x3073; hOGG1&#x3002;HOGG1 &#x9175;&#x7D20;&#x306F; 8-&#x30AA;&#x30AD;&#x30BD;&#x30B0;&#x30A2;&#x30CB;&#x30F3;&#x304C; 1000-fold &#x9AD8;&#x901F; 8-&#x30AA;&#x30AD;&#x30BD;&#x30B0;&#x30A2;&#x30CB;&#x30F3; OG &#x304B;&#x3089;&#x306E;&#x9664;&#x53BB;&#x306E;&#x51FA;&#x5C55;&#x306E;&#x9664;&#x53BB;&#x306E;&#x65B9;&#x306B;&#x3060;&#x3051;&#x30A2;&#x30AF;&#x30C6;&#x30A3;&#x30D6;&#x3067;&#x3042;&#x3063;&#x305F;&#x3002;C &#x3092;&#x542B;&#x3080; duplexes &#x5F7C;&#x3089; OG &#x76F8;&#x5BFE;&#x7684;&#x3002;&#x30AB;&#x30A6;&#x30F3;&#x30BF;&#x30FC; &#x30D1;&#x30FC;&#x30C8;&#x3002;Gh &#x307E;&#x305F;&#x306F; Sp 4 &#x7A2E;&#x306E;&#x5929;&#x7136;&#x5869;&#x57FA;&#x306E;&#x53CD;&#x5BFE;&#x3092;&#x542B;&#x3080;&#x30C7;&#x30E5;&#x30FC;&#x30D7;&#x30EC;&#x30C3;&#x30AF;&#x30B9; hOGG1 &#x9175;&#x7D20;&#x7528;&#x57FA;&#x677F;&#x3067;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x5BFE;&#x7167;&#x7684;&#x306B;&#x3001;yOGG1 &#x3068; yOGG2 &#x306E;&#x9175;&#x7D20;&#x306F; 18 &#x306E; bp &#x4E8C;&#x91CD;&#x304B;&#x3089;&#x6BD4;&#x8F03;&#x7684;&#x52B9;&#x7387;&#x7684;&#x306A;&#x65B9;&#x6CD5;&#x3067; Gh &#x3068; Sp &#x3092;&#x524A;&#x9664;&#x3057;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;Gh &#x3068; Sp &#x3092;&#x542B;&#x3080;&#x30C7;&#x30E5;&#x30FC;&#x30D7;&#x30EC;&#x30C3;&#x30AF;&#x30B9; yOGG1 &#x3068;&#x306E;&#x53CD;&#x5FDC;&#x901F;&#x5EA6;&#x306B;&#x6709;&#x610F;&#x5DEE;&#x306F;&#x8A8D;&#x3081;&#x3089;&#x308C;&#x306A;&#x304B;&#x3063;&#x305F;&#x3002;&#x305F;&#x3060;&#x3057;&#x3001;yOGG2 Gh &#x3088;&#x308A;&#x901F;&#x3044;&#x901F;&#x5EA6;&#x3067; Sp &#x304C;&#x524A;&#x9664;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x4E21;&#x65B9; yOGG &#x9175;&#x7D20;&#x30D9;&#x30FC;&#x30B9;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x9175;&#x7D20;&#x306E; promutagenic &#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x793A;&#x5506;&#x3001;&#x75C5;&#x5909;&#x306E;&#x53CD;&#x5BFE;&#x3092;&#x7121;&#x8996;&#x4F9D;&#x5B58;&#x3092;&#x5C55;&#x793A;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x9A5A;&#x3044;&#x305F;&#x3053;&#x3068;&#x306B;&#x3001;18 &#x306E; bp &#x30B7;&#x30FC;&#x30B1;&#x30F3;&#x30B9; &#x30B3;&#x30F3;&#x30C6;&#x30AD;&#x30B9;&#x30C8;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x4E21;&#x65B9;&#x306E; yOGG &#x9175;&#x7D20; OG &#x9664;&#x53BB;&#x6D3B;&#x52D5;&#x5C55;&#x793A;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x305B;&#x3093;&#x3002;&#x305F;&#x3060;&#x3057;&#x3001;&#x4E21;&#x65B9; OG &#x3092;&#x53D6;&#x308A;&#x5DFB;&#x304F;&#x3055;&#x307E;&#x3056;&#x307E;&#x306A;&#x30B7;&#x30FC;&#x30B1;&#x30F3;&#x30B9;&#x3067;&#x306F; 30 bp &#x4E8C;&#x91CD;&#x306B; OG &#x3092;&#x524A;&#x9664;&#x3057;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x9175;&#x7D20;&#x306E;&#x7570;&#x306A;&#x308B;&#x57FA;&#x677F;&#x3068; in vitro &#x3067;&#x89B3;&#x6E2C;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x4FEE;&#x7406;&#x52B9;&#x7387;&#x306E;&#x5E83;&#x3044;&#x7BC4;&#x56F2;&#x306F;&#x3053;&#x306E;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x75C5;&#x5909;&#x306F; in vivo &#x306E;&#x5909;&#x7570;&#x539F;&#x6027;&#x304C;&#x5927;&#x5E45;&#x306B;&#x5F71;&#x97FF;&#x53EF;&#x80FD;&#x6027;&#x3092;&#x793A;&#x5506;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x78BA;&#x304B;&#x306B;&#x3001;yOGG &#x86CB;&#x767D;&#x8CEA;&#x306E;&#x9664;&#x53BB;&#x3001;&#x3055;&#x3089;&#x306B;&#x9178;&#x5316;&#x3001;Gh &#x3068; Sp &#x306F;&#x3001;&#x4EE5;&#x4E0A;&#x306E;&#x88FD;&#x54C1;&#x3001;8-&#x30AA;&#x30AD;&#x30BD;&#x30B0;&#x30A2;&#x30CB;&#x30F3;&#x306E;&#x89AA;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x52B9;&#x7387;&#x306F;&#x3001;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x75C5;&#x5909; in vivo &#x3067;&#x306E;&#x597D;&#x307E;&#x3057;&#x3044;&#x57FA;&#x677F;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x793A;&#x5506;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#x8A8D;&#x8B58;&#x3068;&#x9664;&#x53BB;&#x3067;&#x4E8C;&#x91CD;&#x306E; DNA &#x5869;&#x57FA;&#x9664;&#x53BB;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x9178;&#x5316;&#x30B0;&#x30A2;&#x30CB;&#x30F3;&#x306E;&#x9175;&#x7D20; hOGG1&#x3001;yOGG1&#x3001;&#x304A;&#x3088;&#x3073; yOGG2 &#x3092;&#x4FEE;&#x5FA9;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

8-&#xC625; &#xC18C;-7, 8-dihydroguanine (&#xC640;) &#xB354; &#xC774;&#xC0C1; &#xC0B0;&#xD654; (Sp) guanidinohydantoin (Gh) &#xBC0F; spiroiminodihydantoin &#xB450; &#xAC1C;&#xC758; 2 &#xCC28; &#xC0B0;&#xD654; &#xC81C;&#xD488; &#xD615;&#xD0DC;&#xB85C; &#xCCB4; &#xC678; &#xC27D;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC774; &#xC2E4;&#xD5D8;&#xC2E4;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC774;&#xC804; &#xC791;&#xC5C5;&#xC73C;&#xB85C; OG, Gh, &#xBC0F; Sp &#xC778;&#xC2DD; &#xB418; &#xACE0; &#xC774;&#xC911; DNA &#xAE30;&#xD310;&#xC5D0;&#xC11C; &#xBCD1;&#xC6D0; &#xC131; &#xB300;&#xC7A5;&#xADE0; DNA &#xC218;&#xB9AC; &#xD6A8;&#xC18C; Fpg&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; excised &#xB098;&#xD0C0;&#xB0AC;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC774; &#xBCF4;&#xACE0;&#xC11C;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC6B0;&#xB9AC; &#xD655;&#xC7A5; &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xC5F0;&#xAD6C; &#xAE30;&#xB2A5; &#xAD00;&#xB828;&#xB41C; &#xC9C4; &#xD575; OG glycosylases (OGG)&#xC744; &#xD6A8; &#xBAA8;&#xC640; &#xC778;&#xAC04;: yOGG1, yOGG2, &#xBC0F; hOGG1. HOGG1 &#xD6A8;&#xC18C; &#xD65C;&#xC131; 8-oxoguanine, 8-oxoguanine OG&#xC5D0;&#xC11C;&#xC758; &#xC81C;&#xAC70;&#xC758; 1000-fold &#xB354; &#xBE60;&#xB978; &#xC18D;&#xB3C4;&#xB85C; &#xC804;&#xC2DC;&#xC758; &#xC81C;&#xAC70;&#xB97C; &#xD5A5;&#xD574;&#xB9CC; &#xD588;&#xB2E4;.&#xD3EC;&#xD568; &#xD558;&#xB294; C duplexes &#xADF8;&#xB4E4;&#xC758; OG &#xAE30;&#xC900;&#xC73C;&#xB85C; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;.&#xB300;&#xC751;&#xC785;&#xB2C8;&#xB2E4;. Duplexes Gh &#xB610;&#xB294; 4 &#xAC1C;&#xC758; &#xC790;&#xC5F0; &#xAE30;&#xC9C0;&#xC758; &#xBC18;&#xB300;&#xB85C; Sp&#xB97C; &#xD3EC;&#xD568; &#xD558;&#xB294; &#xAE30;&#xD310; hOGG1 &#xD6A8;&#xC18C;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC544;&#xB2C8;&#xC5C8;&#xB2E4;. &#xB300;&#xC870;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C;, yOGG1 &#xBC0F; yOGG2 &#xD6A8;&#xC18C; 18 bp &#xC774;&#xC911;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC0C1;&#xB300;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xD6A8;&#xC728;&#xC801;&#xC778; &#xBC29;&#xC2DD;&#xC5D0;&#xC11C; Gh&#xC640; Sp&#xB97C; &#xC81C;&#xAC70;. &#xC0C1;&#xB2F9;&#xD55C; &#xCC28;&#xC774;&#xAC00; Yogg1&#xC640; Gh Sp &#xD3EC;&#xD568; duplexes&#xC758; &#xBC18;&#xC751; &#xC18D;&#xB3C4;&#xC5D0;&#xC11C; &#xAD00;&#xCC30; &#xB418;&#xC5C8;&#xB2E4;. &#xADF8;&#xB7EC;&#xB098;, yOGG2 Gh &#xBCF4;&#xB2E4; &#xBE60;&#xB978; &#xC18D;&#xB3C4;&#xB85C; Sp &#xC81C;&#xAC70;. &#xB450; yOGG &#xD6A8;&#xC18C; &#xBB34;&#xC2DC;&#xD560; &#xC218; &#xC758;&#xC874;&#xC774;&#xC774; &#xD6A8;&#xC18C;&#xC758; &#xD65C;&#xB3D9; promutagenic &#xB420; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4; &#xC81C;&#xC548; &#xD558;&#xB294; &#xBCD1; &#xBCC0; &#xBC18;&#xB300; &#xC790;&#xB8CC; &#xC804;&#xC2DC;. &#xB180;&#xB78D;&#xAC8C;&#xB3C4;, 18 bp &#xC2DC;&#xD000;&#xC2A4; &#xCEE8;&#xD14D;&#xC2A4;&#xD2B8;&#xC5D0;&#xC11C; &#xB450; yOGG &#xD6A8;&#xC18C;&#xB294; OG &#xC81C;&#xAC70; &#xD65C;&#xB3D9;&#xC744; &#xC804;&#xC2DC; &#xD558;&#xC9C0; &#xC54A;&#xC558;&#xB2E4;. &#xADF8;&#xB7EC;&#xB098;, &#xB458; &#xB2E4; OG&#xB97C; &#xB458;&#xB7EC;&#xC2FC; &#xB2E4;&#xB978; &#xC2DC;&#xD000;&#xC2A4;&#xC640; 30 bp &#xC774;&#xC911;&#xC5D0;&#xC11C; og&#xC758; &#xC81C;&#xAC70;. &#xAD11;&#xBC94;&#xC704; &#xD55C; &#xBCF5;&#xAD6C; &#xD6A8;&#xC728;&#xC131; &#xCCB4; &#xC678; &#xB2E4;&#xB978; &#xAE30;&#xD310;&#xC73C;&#xB85C;&#xC774; &#xD6A8;&#xC18C;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xAD00;&#xCC30;&#xC774; &#xC218; &#xBCC0;&#xC774; vivo&#xC5D0;&#xC11C;&#xC774; &#xBCC0;&#xC758; &#xC601;&#xD5A5;&#xC744; &#xD06C;&#xAC8C; &#xB098;&#xC654;&#xB2E4;. &#xC2E4;&#xC81C;&#xB85C;, &#xB354; &#xC0B0;&#xD654; &#xC81C;&#xD488;, Gh&#xC640; Sp, &#xADF8;&#xB4E4;&#xC758; 8 oxoguanine &#xBD80;&#xBAA8;&#xB97C; &#xD1B5;&#xD574;&#xC758; &#xC81C;&#xAC70;&#xB97C; &#xC704;&#xD55C; yOGG &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC758; &#xB192;&#xC740; &#xD6A8;&#xC728; &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xBCD1; &#xBCC0; &#xC120;&#xD638; &#xAE30;&#xD310; vivo&#xC5D0;&#xC11C; &#xC788;&#xC744; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4; &#xB098;&#xC654;&#xB2E4;.

&#xC778;&#xC2DD; &#xBC0F; &#xAE30;&#xBCF8; &#xC808;&#xB2E8; &#xD558; &#xC5EC; &#xC774;&#xC911; DNA &#xC0B0;&#xD654; guanines &#xC81C;&#xAC70; &#xBCF5;&#xAD6C; &#xD6A8;&#xC18C; hOGG1, yOGG1, &#xBC0F; yOGG2.

8-Oxo-7, 8-dihydroguanine (OG) es susceptible a la oxidaci&oacute;n m&aacute;s in vitro para formar dos productos de oxidaci&oacute;n secundario, guanidinohydantoin (Gh) y spiroiminodihydantoin (Sp). Trabajos anteriores de este laboratorio ha demostrado que OG, Gh y Sp son reconocidos y suprimido de los substratos de DNA d&uacute;plex por la enzima de reparaci&oacute;n del ADN Escherichia coli Fpg. En este informe, extendemos estos estudios a la funcionalmente relacionados eucariotas OG glicosilasas (OGG) de levadura y los seres humanos: yOGG1, yOGG2 y hOGG1. La enzima hOGG1 era activa solamente hacia la eliminaci&oacute;n de 8-oxoguanine, exhibiendo un Acmo ritmo de extracci&oacute;n de 8-oxoguanine de OG.D&uacute;plex que contienen C en relaci&oacute;n con su OG.Una contraparte. D&uacute;plex con Gh o Sp frente a cualquiera de las cuatro bases naturales no son sustratos de la enzima hOGG1. En cambio, tanto yOGG1 como yOGG2 de enzimas quitaron Gh y Sp de una manera relativamente eficiente de un d&uacute;plex de bp 18. No se observ&oacute; ninguna diferencia significativa en la velocidad de reacci&oacute;n de que Gh-Sp-contienen y d&uacute;plex con yOGG1. Sin embargo, yOGG2 quita Sp a un ritmo mayor que la Gh. Ambas enzimas yOGG exhiben una dependencia insignificante en la base frente a la lesi&oacute;n, lo que sugiere que la actividad de estas enzimas puede ser promutagenic. Sorprendentemente, en el contexto de secuencia bp 18, ambas enzimas yOGG no mostr&oacute; actividad de extracci&oacute;n de OG. Sin embargo, ambos quita OG en un duplex bp 30 con una secuencia diferente que rodean el OG. La amplia gama de las eficiencias de reparaci&oacute;n observado por estas enzimas con distintos sustratos in vitro sugiere que esto podr&iacute;a afectar en gran medida la mutagenicidad de estas lesiones en vivo. De hecho, la mayor eficiencia de las prote&iacute;nas de yOGG para la eliminaci&oacute;n de los m&aacute;s oxidados productos, Gh y Sp, sobre sus padres 8-oxoguanine, sugiere que estas lesiones pueden ser los substratos recomendado: in vivo.

Reconocimiento y eliminaci&oacute;n de guanines oxidados en DNA d&uacute;plex por la supresi&oacute;n de la base de reparaci&oacute;n enzimas hOGG1, yOGG1 y yOGG2.

WaaJ &#x57FA;&#x56E0;&#x7F16;&#x7801; &alpha;-1&#xFF0C;2-&#x8461;&#x53C2;&#x4E0E;&#x5916;&#x6838;&#x5FC3;&#x533A;&#x57DF;&#x7684;&#x4E00;&#x4E9B;&#x81F4;&#x75C5;&#x6027;&#x5927;&#x80A0;&#x6746;&#x83CC;&#x7684; lipopolysaccha &#x8BE5;&#x673A;&#x5408;&#x6210;&#x548C;&#x6C99;&#x95E8;&#x6C0F;&#x83CC;&#x682A;&#x3002;WaaJ &#x5C5E;&#x4E8E;&#x7CD6;&#x82F7;&#x8F6C;&#x79FB;&#x9176; CAZy &#x5BB6;&#x5EAD; 8&#xFF0C;&#x7279;&#x70B9;&#x662F; GT A &#x6298;&#xFF0C;DXD &#x6BCD;&#x9898;&#x548C;&#x6350;&#x52A9;&#x8005;&#x7CD6;&#x5F02;&#x78B3;&#x5728;&#x914D;&#x7F6E;&#x7684;&#x4FDD;&#x7559;&#x3002;&#x8111;&#x819C;&#x708E;&#x5948;&#x745F;&#x6C0F;&#x83CC; LgtC &#x7814;&#x7A76;&#x88AB;&#x7531;&#x4E8E;&#x7EC6;&#x83CC;&#x5BB6;&#x65CF; 8 &#x7CD6;&#x57FA;&#x8F6C;&#x79FB;&#x9176;&#x52A8;&#x529B;&#x5B66;&#x548C;&#x7ED3;&#x6784;&#x7684;&#x8BE6;&#x7EC6;&#x7684;&#x4FE1;&#x606F;&#x3002;&#x800C;&#x4E0D;&#x4F1A;&#x5F71;&#x54CD;&#x5176;&#x4F53;&#x5916;&#x50AC;&#x5316;&#x884C;&#x4E3A;&#x5C31;&#x53EF;&#x4EE5;&#x4ECE; LgtC C &#x603B;&#x7AD9;&#x5220;&#x9664;&#x591A;&#x8FBE; 28 &#x4E2A;&#x6C28;&#x57FA;&#x9178;&#x3002;&#x6B64; C &#x672B;&#x7AEF;&#x57DF;&#x90FD;&#x6709;&#x5F88;&#x9AD8;&#x6BD4;&#x4F8B;&#x7684;&#x79EF;&#x6781;&#x5145;&#x7535;&#x548C;&#x758F;&#x6C34;&#x6027;&#x7684;&#x6B8B;&#x7559;&#x7269;&#xFF0C;&#x5728; WaaJ &#x548C;&#x5176;&#x4ED6;&#x4E00;&#x4E9B;&#x5BB6;&#x5EAD; 8 &#x4EE3;&#x8868;&#x4FDD;&#x5B88;&#x7684;&#x4E00;&#x4E2A;&#x7279;&#x70B9;&#x3002;&#x610F;&#x5916;&#x7684;&#x662F;&#xFF0C;&#x5220;&#x9664;&#x7684;&#x5C11;&#x5219;&#x4ECE; WaaJ &#x7684; C &#x603B;&#x7AD9;&#x4E94;&#x6B8B;&#x7559;&#x5BFC;&#x81F4;&#x5927;&#x5E45;&#x51CF;&#x5C11;&#x4F53;&#x5185;&#x6D3B;&#x52A8;&#x3002;&#x5C0F;&#x4E8E;&#x6216;&#x7B49;&#x4E8E; 15 &#x7684;&#x6B8B;&#x7559;&#x7269;&#x8FDB;&#x884C;&#x5220;&#x9664;&#x64CD;&#x4F5C;&#xFF0C;&#x53EA;&#x80FD;&#x68C0;&#x6D4B;&#x6D3B;&#x52A8;&#x65F6;&#x7684;&#x8868;&#x8FBE;&#x6C34;&#x5E73;&#x4E0A;&#x5347;&#x4E86;&#x3002;20 &#x79CD;&#x6C28;&#x57FA;&#x9178;&#xFF0C;&#x65E0;&#x8BBA;&#x8868;&#x8FBE;&#x6C34;&#x5E73;&#x7684;&#x642C;&#x8FC1;&#x540E;&#x68C0;&#x6D4B;&#x5230;&#x6CA1;&#x6709;&#x4F53;&#x5185;&#x7684;&#x6D3B;&#x52A8;&#x3002;&#x957F;&#x5220;&#x9664; (20 &#x6B8B;&#x7559;&#x548C;&#x66F4;&#x5927;&#xFF09; &#x7684; WaaJ &#x819C;&#x5C06;&#x5173;&#x8054;&#x7684;&#x80FD;&#x529B;&#x53D7;&#x5230;&#x635F;&#x5BB3;&#x3002;&#x7136;&#x800C;&#xFF0C;&#x51CF;&#x5C11;&#x4F53;&#x5185;&#x6D3B;&#x6027;&#x9176;&#x7F3A;&#x4E4F; 5 12 C-&#x7EC8;&#x7AEF;&#x6B8B;&#x7559;&#x4E5F;&#x53CD;&#x6620;&#x51FA;&#x4F53;&#x5916;&#x50AC;&#x5316;&#x6D3B;&#x6027;&#x6025;&#x5267;&#x4E0B;&#x964D; &#xFF08;294-fold &#x8DCC;&#x5E45;&#x660E;&#x663E; kcat/&#x516C;&#x91CC;&#xFF0C;LPS&#xFF09;&#x3002;&#x5220;&#x9664;&#x5220;&#x9664; 20 &#x4E2A;&#x6216;&#x66F4;&#x591A;&#x7684;&#x6B8B;&#x7559;&#x5BFC;&#x81F4;&#x663E;&#x793A;&#x6CA1;&#x6709;&#x53EF;&#x63A2;&#x6D4B;&#x7684;&#x4F53;&#x5916;&#x6D3B;&#x6027;&#x86CB;&#x767D;&#x3002;&#x56E0;&#x6B64;&#xFF0C;WaaJ &#x7684; C &#x672B;&#x7AEF;&#x57DF;&#x5728;&#x9176;&#x529F;&#x80FD;&#x4E2D;&#x53D1;&#x6325;&#x7740;&#x5173;&#x952E;&#x7684;&#x4F5C;&#x7528;&#x3002;

&#x5927;&#x80A0;&#x57C3;&#x5E0C;&#x6C0F;&#x5927;&#x80A0;&#x6746;&#x83CC; WaaJ &#x7CD6;&#x82F7;&#x8F6C;&#x79FB;&#x9176; C &#x672B;&#x7AEF;&#x57DF;&#x662F;&#x91CD;&#x8981;&#x7684;&#x50AC;&#x5316;&#x6D3B;&#x6027;&#x548C;&#x819C;&#x534F;&#x4F1A;&#x3002;

The waaJ gene encodes an alpha-1,2-glucosyltransferase involved in the synthesis of the outer core region of the lipopolysaccha-ride of some Escherichia coli and Salmonella isolates. WaaJ belongs to glycosyltransferase CAZy family 8, characterized by the GT-A fold, a DXD motif, and by retention of configuration at the anomeric carbon of the donor sugar. Detailed kinetic and structural information for bacterial family 8 glycosyltransferases has resulted from studies of Neisseria meningitidis LgtC. As many as 28 amino acids could be deleted from the C terminus of LgtC without affecting its in vitro catalytic behavior. This C-terminal domain has a high ratio of positively charged and hydrophobic residues, a feature conserved in WaaJ and some other family 8 representatives. Unexpectedly, deletion of as few as five residues from the C terminus of WaaJ resulted in substantially reduced in vivo activity. With deletions of 15 residues or less, activity was only detected when levels of expression were elevated. No in vivo activity was detected after the removal of 20 amino acids, regardless of expression levels. Longer deletions (20 residues and greater) compromised the ability of WaaJ to associate with the membrane. However, the reduced in vivo activity in enzymes lacking 5-12 C-terminal residues also reflected a dramatic drop in catalytic activity in vitro (a 294-fold decrease in the apparent kcat/Km,LPS). Deletions removing 20 or more residues resulted in a protein showing no detectable in vitro activity. Therefore, the C-terminal domain of WaaJ plays a critical role in enzyme function.

The C-terminal Domain of the Escherichia coli WaaJ glycosyltransferase is important for catalytic activity and membrane association.

Le g&egrave;ne waaJ code pour une alpha-1, 2-glucosyltransf&eacute;rase impliqu&eacute; dans la synth&egrave;se de la r&eacute;gion du noyau externe de la lipopolysaccha-ride de certains Escherichia coli et Salmonella isole. WaaJ appartient &agrave; glycosyltransferase CAZy famille 8, caract&eacute;ris&eacute; par le GT-A Rabat, un motif DXD et par r&eacute;tention de configuration au niveau du carbone anom&egrave;re du sucre donneur. Information d&eacute;taill&eacute;e de cin&eacute;tique et structurale pour famille bact&eacute;rienne 8 glycosyltransf&eacute;rases r&eacute;sulte d&#39;&eacute;tudes de Neisseria meningitidis LgtC. 28 Acides amin&eacute;s pourrait &ecirc;tre supprim&eacute;s de la partie C terminale de LgtC sans affecter son comportement catalytique in vitro. Ce domaine C-terminal a une proportion &eacute;lev&eacute;e de r&eacute;sidus positivement charg&eacute;es et hydrophobes, une fonctionnalit&eacute; conserv&eacute;e chez les WaaJ et quelques autres repr&eacute;sentants de la famille 8. Contre toute attente, suppression d&#39;aussi peu que cinq r&eacute;sidus provenant de l&#39;extr&eacute;mit&eacute; C terminale de WaaJ a consid&eacute;rablement r&eacute;duit l&#39;activit&eacute; in vivo. Avec destructions de 15 r&eacute;sidus ou moins, l&#39;activit&eacute; a &eacute;t&eacute; seulement d&eacute;tect&eacute;e lorsque les niveaux d&#39;expression &eacute;taient &eacute;lev&eacute;s. Aucune activit&eacute; in vivo a &eacute;t&eacute; d&eacute;tect&eacute;e apr&egrave;s la suppression des 20 acides amin&eacute;s, quelles que soient les niveaux d&#39;expression. Destructions plus longues (20 r&eacute;sidus et sup&eacute;rieure) compromis la capacit&eacute; des WaaJ &agrave; associer &agrave; la membrane. Toutefois, l&#39;activit&eacute; in vivo r&eacute;duite en enzymes manque 5-12C-r&eacute;sidus terminaux refl&egrave;tent &eacute;galement une baisse marqu&eacute;e dans une activit&eacute; catalytique in vitro (294-fold diminution le kcat/Km apparent, LPS). Enlever les r&eacute;sidus de 20 ou plus de destructions ont entra&icirc;n&eacute; une prot&eacute;ine ne montrant aucune activit&eacute; d&eacute;tectable in vitro. Par cons&eacute;quent, le domaine C-terminal de WaaJ joue un r&ocirc;le essentiel en fonction de l&#39;enzyme.

Le domaine C-terminal de l&#39;Escherichia coli WaaJ glycosyltransferase est important pour l&#39;activit&eacute; catalytique et l&#39;association de la membrane.

Das WaaJ-Gen codiert f&uuml;r eine Alpha-1,2-Glucosyltransferase beteiligt bei der Synthese von der &auml;u&szlig;eren Kernregion der Lipopolysaccha-Fahrt einige Escherichia coli und Salmonellen isoliert. WaaJ geh&ouml;rt zur Glycosyltransferase CAZy Familie 8, gekennzeichnet durch die GT-A-Klappe, ein Motiv DXD und Aufbewahrung der Konfiguration am Anomere Kohlenstoffatom des Zuckers Spender. Kinetische und strukturelle Detailinformationen f&uuml;r bakterielle Familie 8 Glycosyltransferasen ist aus Studien von Neisseria Meningitidis LgtC resultiert. Mehr als 28 Aminos&auml;uren konnte von der C-Terminus von LgtC gel&ouml;scht werden, ohne seine in-vitro-katalytische Verhalten. Diese C-terminalen Dom&auml;ne hat einen hohen Anteil an positiv geladenen und hydrophoben R&uuml;ckst&auml;nden, ein Feature in WaaJ und einige andere Vertreter der Familie 8 konserviert. L&ouml;schen von so wenig wie f&uuml;nf R&uuml;ckst&auml;nde aus der Carboxyl-Terminus der WaaJ f&uuml;hrte unerwartet, betr&auml;chtlich reduzierten in-vivo-Aktivit&auml;t. Mit L&ouml;schungen von 15 R&uuml;ckst&auml;nde oder weniger wurde die Aktivit&auml;t nur erkannt, wenn Ebenen des Ausdrucks erhoben wurden. Keine in-vivo-Aktivit&auml;t wurde nach der Entfernung der 20 Aminos&auml;uren, unabh&auml;ngig von Ausdruck erkannt. L&auml;ngere Deletionen (20 R&uuml;ckst&auml;nde und gr&ouml;&szlig;er) beeintr&auml;chtigt die F&auml;higkeit der WaaJ Membran zugeordnet. Jedoch die reduzierte in-vivo-Aktivit&auml;t im Enzyme fehlen 5-12 C-terminal R&uuml;ckst&auml;nde spiegelt auch einen dramatischen R&uuml;ckgang in in-vitro-katalytische Aktivit&auml;t (eine 294-fold Abnahme der scheinbaren Kcat/km, LPS). L&ouml;schungen Entfernen von 20 oder mehr R&uuml;ckst&auml;nde ergab ein Protein zeigen keine nachweisbaren in-vitro-Aktivit&auml;t. Die C-terminalen Dom&auml;ne des WaaJ spielt daher eine wichtige Rolle in Enzym-Funktion.

Die C-terminalen Dom&auml;ne von der Escherichia coli WaaJ Glycosyltransferase ist wichtig f&uuml;r die katalytische Aktivit&auml;t und Membran-Vereinigung.

Il waaJ gene codifica un&#39;Alfa-1,2-glucosiltransferasi coinvolta nella sintesi della regione nucleo esterno del lipopolysaccha-ride di alcuni Escherichia coli e Salmonella isolati. WaaJ appartiene a glycosyltransferase CAZy famiglia 8, caratterizzata da GT-A piega, un motivo DXD e da ritenzione di configurazione al carbonio anomerico dello zucchero dei donatori. Informazioni dettagliate cinetiche e strutturali per la famiglia batterica 8 glycosyltransferases ha portato dagli studi di Neisseria meningitidis LgtC. Come ben 28 amminoacidi potrebbe essere eliminati dal C terminale di LgtC senza influire sul suo comportamento catalitico in vitro. Questo dominio C-terminale ha un elevato rapporto positivamente caricati e idrofobici residui, una caratteristica conservata in WaaJ e alcuni altri rappresentanti della famiglia 8. Inaspettatamente, eliminazione di pochi cinque residui dal capolinea C di WaaJ provocato sostanzialmente ridotta attivit&agrave; in vivo. Con delezioni di 15 residui o meno, attivit&agrave; rilevata solo quando furono elevati livelli di espressione. Dopo la rimozione di 20 amminoacidi, indipendentemente dai livelli di espressione &egrave; stata rilevata alcuna attivit&agrave; in vivo. Delezioni pi&ugrave; lungo (20 residui e maggiore) compromessa la capacit&agrave; di associare la membrana WaaJ. Tuttavia, la ridotta attivit&agrave; in vivo degli enzimi manca 5-12 C-terminale residui riflettono anche un drammatico calo di attivit&agrave; catalitica in vitro (294-fold diminuzione apparente kcat/km, LPS). Rimozione di residui di 20 o pi&ugrave; delezioni ha provocato una proteina non mostrando alcuna attivit&agrave; in vitro rilevabile. Pertanto, il dominio C-terminale di WaaJ svolge un ruolo critico nella funzione enzimatica.

Il dominio C-terminale dell&#39;Escherichia coli WaaJ glycosyltransferase &egrave; importante per l&#39;associazione di membrana e attivit&agrave; catalitica.

&Alpha;-1, 2-&#x30B0;&#x30EB;&#x30B3;&#x30B7;&#x30EB;&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30D5;&#x30A7;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC;&#x3044;&#x304F;&#x3064;&#x304B;&#x306E;&#x5927;&#x8178;&#x83CC;&#x3092; lipopolysaccha &#x306B;&#x4E57;&#x308B;&#x306E;&#x5916;&#x5074;&#x306E;&#x30B3;&#x30A2;&#x9818;&#x57DF;&#x306E;&#x5408;&#x6210;&#x306B;&#x95A2;&#x308F;&#x308B; waaJ &#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x3092;&#x30A8;&#x30F3;&#x30B3;&#x30FC;&#x30C9;&#x3057;&#x3066;&#x30B5;&#x30EB;&#x30E2;&#x30CD;&#x30E9;&#x5206;&#x96E2;&#x682A;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;WaaJ GT A &#x500D;&#x3001;DXD &#x30E2;&#x30C1;&#x30FC;&#x30D5;&#x3068;&#x4FDD;&#x6301;&#x306B;&#x3088;&#x308B;&#x30A2;&#x30CE;&#x30DE;&#x30FC;&#x70AD;&#x7D20;&#x3067;&#x69CB;&#x6210;&#x7CD6;&#x4F9B;&#x4E0E;&#x4F53;&#x306E;&#x7279;&#x5FB4; CAZy &#x5BB6;&#x65CF; 8&#x3001;&#x7CD6;&#x8EE2;&#x79FB;&#x9175;&#x7D20;&#x306B;&#x5C5E;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x904B;&#x52D5;&#x3068;&#x69CB;&#x9020;&#x306E;&#x8A73;&#x7D30;&#x7D30;&#x83CC;&#x5BB6;&#x65CF; 8 &#x7CD6;&#x8EE2;&#x79FB;&#x9175;&#x7D20;&#x306F;&#x9AC4;&#x819C;&#x708E;&#x83CC; LgtC &#x306E;&#x7814;&#x7A76;&#x304B;&#x3089;&#x7D50;&#x679C;&#x306B;&#x306A;&#x3063;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3067;&#x304D;&#x308B;&#x3060;&#x3051;&#x591A;&#x304F; 28 &#x30A2;&#x30DF;&#x30CE;&#x9178; LgtC &#x306E; C &#x672B;&#x7AEF;&#x304B;&#x3089;&#x305D;&#x306E; in vitro &#x3067;&#x306E;&#x89E6;&#x5A92;&#x6319;&#x52D5;&#x306B;&#x5F71;&#x97FF;&#x3092;&#x4E0E;&#x3048;&#x305A;&#x306B;&#x524A;&#x9664;&#x3067;&#x304D;&#x307E;&#x305B;&#x3093;&#x3067;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x3053;&#x306E; C &#x672B;&#x7AEF;&#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;&#x306F;&#x7A4D;&#x6975;&#x7684;&#x306B;&#x5145;&#x96FB;&#x3068;&#x758E;&#x6C34;&#x6027;&#x6B8B;&#x57FA;&#x306E;&#x9AD8;&#x7387; WaaJ &#x3068;&#x3044;&#x304F;&#x3064;&#x304B;&#x4ED6;&#x306E;&#x5BB6;&#x65CF; 8 &#x4EE3;&#x8868;&#x306E;&#x4FDD;&#x5B58;&#x6A5F;&#x80FD;&#x304C;&#x3042;&#x308A;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x4E88;&#x671F;&#x305B;&#x305A;&#x3001;&#x524A;&#x9664;&#x6570; 5 &#x6B8B;&#x57FA; WaaJ &#x306E; C &#x672B;&#x7AEF;&#x304B;&#x3089;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x5927;&#x5E45;&#x306B;&#x6E1B;&#x3089;&#x3055;&#x308C;&#x305F; in vivo &#x6D3B;&#x6027;&#x3067;&#x8D77;&#x56E0;&#x3057;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x306B;&#x3088;&#x308B;&#x524A;&#x9664;&#x4EE5;&#x5185; 15 &#x6B8B;&#x57FA;&#x306E;&#x6D3B;&#x52D5;&#x8868;&#x73FE;&#x306E;&#x30EC;&#x30D9;&#x30EB;&#x304C;&#x9AD8;&#x3081;&#x3089;&#x308C;&#x305F;&#x3068;&#x304D;&#x306E;&#x307F;&#x304C;&#x691C;&#x51FA;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x8868;&#x73FE;&#x306E;&#x30EC;&#x30D9;&#x30EB;&#x306B;&#x95A2;&#x4FC2;&#x306A;&#x304F; 20 &#x30A2;&#x30DF;&#x30CE;&#x9178;&#x3092;&#x9664;&#x53BB;&#x3057;&#x305F;&#x5F8C;&#x306B; in vivo &#x6D3B;&#x6027;&#x304C;&#x691C;&#x51FA;&#x3055;&#x308C;&#x306A;&#x304B;&#x3063;&#x305F;&#x3002;&#x9577;&#x304F;&#x524A;&#x9664; (20 &#x6B8B;&#x57FA;&#x3068;&#x5927;&#x304D;&#x3044;) WaaJ &#x306E;&#x819C;&#x3068;&#x3092;&#x95A2;&#x9023;&#x4ED8;&#x3051;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x5371;&#x967A;&#x306B;&#x3055;&#x3089;&#x3055;&#x3002;&#x305F;&#x3060;&#x3057;&#x3001;5 12 C &#x6B20;&#x3051;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x9175;&#x7D20;&#x306E; in vivo &#x6D3B;&#x6027;&#x4F4E;&#x4E0B;-&#x30BF;&#x30FC;&#x30DF;&#x30CA;&#x30EB;&#x6B8B;&#x57FA;&#x3082; &#xFF08;294-fold &#x306E;&#x6E1B;&#x5C11;&#x306F;&#x3001;&#x898B;&#x304B;&#x3051;&#x306E; kcat/&#x30AD;&#x30ED;&#x30E1;&#x30FC;&#x30C8;&#x30EB;&#x3001;LPS&#xFF09; &#x89E6;&#x5A92;&#x6D3B;&#x6027;&#x306E; in vitro &#x3067;&#x306E;&#x5287;&#x7684;&#x306A;&#x4F4E;&#x4E0B;&#x3092;&#x53CD;&#x6620;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;20 &#x4EE5;&#x4E0A;&#x306E;&#x6B8B;&#x57FA;&#x3092;&#x524A;&#x9664;&#x3059;&#x308B;&#x524A;&#x9664;&#x691C;&#x51FA;&#x306E; in vitro &#x6D3B;&#x6027;&#x3092;&#x793A;&#x3055;&#x306A;&#x3044;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x3067;&#x8D77;&#x56E0;&#x3057;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x3057;&#x305F;&#x304C;&#x3063;&#x3066;&#x3001;WaaJ &#x306E; C &#x672B;&#x7AEF;&#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;&#x306F;&#x9175;&#x7D20;&#x6A5F;&#x80FD;&#x3067;&#x91CD;&#x8981;&#x306A;&#x5F79;&#x5272;&#x3092;&#x679C;&#x305F;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

C &#x672B;&#x7AEF;&#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;&#x5927;&#x8178;&#x83CC;&#x5927;&#x8178;&#x83CC; WaaJ &#x7CD6;&#x8EE2;&#x79FB;&#x9175;&#x7D20;&#x306E;&#x89E6;&#x5A92;&#x6D3B;&#x6027;&#x3068;&#x819C;&#x5354;&#x4F1A;&#x306B;&#x3068;&#x3063;&#x3066;&#x91CD;&#x8981;&#x3067;&#x3059;&#x3002;

WaaJ &#xC720;&#xC804;&#xC790;&#xB294; &#xC54C;&#xD30C;-1, 2-glucosyltransferase &#xC678;&#xBD80; &#xD575;&#xC2EC; &#xC9C0;&#xC5ED; &#xC77C;&#xBD80; &#xB300;&#xC7A5;&#xADE0;&#xC758; lipopolysaccha &#xB77C; &#xC774;&#xB4DC;&#xC758; &#xD569;&#xC131;&#xC5D0; &#xAD00;&#xC5EC; &#xC778;&#xCF54;&#xB529;&#xD558;&#xACE0; &#xC0B4; &#xBAA8; &#xB12C; &#xB77C;&#xB97C; &#xACA9;&#xB9AC; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. WaaJ glycosyltransferase CAZy &#xAC00;&#xC871; 8, GT A &#xBC30; DXD &#xBAA8;&#xD2F0;&#xBE0C; &#xACE0; &#xAE30;&#xC99D;&#xC790; &#xC124;&#xD0D5;&#xC758; anomeric &#xD0C4;&#xC18C;&#xC5D0;&#xC11C; &#xAD6C;&#xC131; &#xBCF4;&#xC874; &#xD558; &#xC5EC; &#xD2B9;&#xC9D5;&#xC5D0; &#xC18D;&#xD55C;&#xB2E4;. &#xC138;&#xADE0;&#xC131; &#xAC00;&#xC871; 8 glycosyltransferases&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC790;&#xC138;&#xD55C; &#xC6B4;&#xB3D9; &#xBC0F; &#xAD6C;&#xC870; &#xC815;&#xBCF4; Neisseria meningitidis Lgtc&#xC758; &#xC5F0;&#xAD6C;&#xC5D0;&#xC11C; &#xACB0;&#xACFC; &#xC774;&#xB2E4;. 28 &#xAC1C;&#xC758; &#xC544;&#xBBF8;&#xB178;&#xC0B0; &#xC0DD;&#xCCB4; &#xC678;&#xC5D0;&#xC11C; &#xCD09;&#xB9E4; &#xB3D9;&#xC791;&#xC5D0; &#xC601;&#xD5A5;&#xC744; &#xC8FC;&#xC9C0; &#xC54A;&#xACE0; Lgtc&#xC758; C &#xB9D0;&#xB2E8;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC0AD;&#xC81C; &#xB420; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC774; C &#xD130;&#xBBF8;&#xB110; &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778;&#xC5D0; &#xAE0D;&#xC815;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xCDA9;&#xC804; &#xD558; &#xACE0; &#xC18C;&#xC218; &#xC131; &#xC794;&#xB958;&#xBB3C;&#xC758; &#xB192;&#xC740; &#xBE44;&#xC728;&#xC744; Waaj&#xC640; &#xB2E4;&#xB978; &#xAC00;&#xC871; 8 &#xB300;&#xD45C;&#xC5D0; &#xBCF4;&#xC874; &#xD558;&#xB294; &#xAE30;&#xB2A5;. &#xC608;&#xAE30;&#xCE58; &#xC54A;&#xAC8C;, &#xC0AD;&#xC81C;&#xC758; &#xBA87; &#xAC00;&#xC9C0; Waaj&#xC758; C &#xB9D0;&#xB2E8;&#xC5D0;&#xC11C; 5 &#xC794;&#xB958;&#xBB3C;&#xC73C;&#xB85C; &#xD06C;&#xAC8C; &#xAC10;&#xC18C; vivo&#xC5D0;&#xC11C; &#xD65C;&#xB3D9; &#xACB0;&#xACFC;. &#xC0AD;&#xC81C; &#xB610;&#xB294; &#xADF8;&#xC774; &#xD558; 15 &#xC794;&#xB958;&#xBB3C;&#xC758; &#xD65C;&#xB3D9;&#xC5D0; &#xC2DD;&#xC758; &#xB808;&#xBCA8; &#xC0C1;&#xC2B9; &#xD588;&#xB2E4; &#xB54C;&#xB9CC; &#xBC1C;&#xACAC; &#xD588;&#xB2E4;. &#xC544;&#xB2C8; vivo&#xC5D0;&#xC11C; &#xD65C;&#xB3D9; &#xC2DD; &#xC218;&#xC900;&#xC5D0; &#xAD00;&#xACC4; &#xC5C6;&#xC774; 20 &#xC544;&#xBBF8;&#xB178;&#xC0B0;&#xC758; &#xC81C;&#xAC70; &#xD6C4; &#xAC80;&#xC0C9; &#xB418;&#xC5C8;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xB354; &#xC774;&#xC0C1; &#xC0AD;&#xC81C; (20 &#xC794;&#xB958;&#xBB3C; &#xBC0F; &#xD070;) &#xB9C9;&#xC73C;&#xB85C; &#xC5F0;&#xACB0; &#xD558;&#xB294; Waaj&#xC758; &#xAE30;&#xB2A5;&#xC744; &#xC190;&#xC0C1;. &#xADF8;&#xB7EC;&#xB098;, 5-12 C &#xBD80;&#xC871; &#xD55C; &#xD6A8;&#xC18C; &#xAC10;&#xC18C; vivo&#xC5D0;&#xC11C; &#xD65C;&#xB3D9;-&#xD130;&#xBBF8;&#xB110; &#xC794;&#xB958;&#xBB3C;&#xB3C4; &#xBC18;&#xC601; (&#xBA85;&#xBC31;&#xD55C; &#xB3C4;&#xC2EC; &#xACF5;&#xD56D;/Km, LPS&#xC5D0;&#xC11C;&#xC5D0;&#xC11C; 294-fold &#xAC10;&#xC18C;) &#xCD09;&#xB9E4; &#xD65C;&#xB3D9; &#xCCB4; &#xC678;&#xC5D0; &#xADF9;&#xC801;&#xC778; &#xB4DC;&#xB86D;. 20 &#xAC1C; &#xC774;&#xC0C1;&#xC758; &#xC794;&#xB958;&#xBB3C;&#xC744; &#xC81C;&#xAC70; &#xD558;&#xB294; &#xC0AD;&#xC81C; &#xAC10;&#xC9C0; &#xCCB4; &#xC678; &#xD65C;&#xB3D9;&#xC774; &#xBCF4;&#xC5EC;&#xC8FC;&#xB294; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xADC0;&#xCC29;&#xB418; &#xC5C8; &#xB2E4;. &#xB530;&#xB77C;&#xC11C;, Waaj&#xC758; C-&#xD130;&#xBBF8;&#xB110; &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778; &#xD6A8;&#xC18C; &#xAE30;&#xB2A5;&#xC5D0; &#xC911;&#xC694; &#xD55C; &#xC5ED;&#xD560;&#xC744; &#xD55C;&#xB2E4;.

&#xBCD1;&#xC6D0; &#xC131; &#xB300;&#xC7A5;&#xADE0; WaaJ glycosyltransferase&#xC758; C-&#xD130;&#xBBF8;&#xB110; &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778; &#xCD09;&#xB9E4; &#xD65C;&#xB3D9; &#xBC0F; &#xBA64;&#xBE0C;&#xB808;&#xC778; &#xD611;&#xD68C;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC911;&#xC694; &#xD558;&#xB2E4;.

El gen waaJ codifica una alfa-1, 2-glucosiltransferasa implicada en la s&iacute;ntesis de la regi&oacute;n del n&uacute;cleo exterior del lipopolysaccha-paseo de algunos Escherichia coli y Salmonella aislados. WaaJ pertenece a glicosiltransferasa CAZy familia 8, caracterizado por el GT-A veces, un motivo DXD y retenci&oacute;n de la configuraci&oacute;n en el carbono anom&eacute;rico del az&uacute;car donantes. Informaci&oacute;n detallada de la cin&eacute;tica y estructural para familia bacteriana 8 glicosiltransferasas ha dado como resultado de los estudios de Neisseria meningitidis LgtC. Hasta 28 amino&aacute;cidos podr&iacute;an borrarse de la terminal C de LgtC sin afectar su comportamiento catal&iacute;tico in vitro. Este dominio c-terminal tiene una alta relaci&oacute;n de residuos positivamente cargadas e hidrof&oacute;bicas, una caracter&iacute;stica que se conserva en WaaJ y algunos otros representantes de la familia 8. Inesperadamente, eliminaci&oacute;n de tan s&oacute;lo cinco residuos de la terminal C de WaaJ dio lugar a sustancialmente reducida actividad in vivo. Con eliminaciones de 15 residuos o menos, s&oacute;lo se detect&oacute; actividad cuando los niveles de expresi&oacute;n fueron elevados. Ninguna actividad in vivo fue detectada despu&eacute;s del retiro de los 20 amino&aacute;cidos, independientemente de los niveles de expresi&oacute;n. M&aacute;s eliminaciones (20 residuos y mayor) compromete la capacidad de WaaJ para asociar a la membrana. Sin embargo, la reducci&oacute;n de la actividad in vivo en enzimas falta 5-12C-residuos terminales tambi&eacute;n reflejaban una ca&iacute;da dr&aacute;stica en la actividad catal&iacute;tica in vitro (294-fold disminuci&oacute;n en la aparente kcat/Km, LPS). Eliminaciones de eliminaci&oacute;n de residuos de 20 o m&aacute;s dio lugar a una prote&iacute;na no detectable actividad in vitro. Por lo tanto, el dominio c-terminal de WaaJ desempe&ntilde;a un papel cr&iacute;tico en funci&oacute;n de la enzima.

El dominio c-terminal de la Escherichia coli WaaJ glicosiltransferasa es importante para la actividad catal&iacute;tica y la Asociaci&oacute;n de la membrana.

WaaJ&#x3001; waaT&#x3001; &#x548C; waaR &#x57FA;&#x56E0;&#x7F16;&#x7801;&#x7CD6;&#x57FA;&#x8F6C;&#x79FB; &alpha;-1&#xFF0C;2-&#x9176;&#x53C2;&#x4E0E;&#x5916;&#x6838;&#x5FC3;&#x533A;&#x57DF;&#x7684;&#x5927;&#x80A0;&#x57C3;&#x5E0C;&#x6C0F;&#x5927;&#x80A0;&#x6746;&#x83CC;&#x8102;&#x591A;&#x7CD6;&#x7684;&#x5408;&#x6210;&#x3002;&#x4ED6;&#x4EEC;&#x5C5E;&#x4E8E;&#x5BB6;&#x5EAD; CAZy 8&#xFF0C;&#x7279;&#x70B9;&#x662F; GT A &#x6298;&#xFF0C;DXD &#x56FE;&#x6848;&#x548C;&#x4FDD;&#x7559;&#x7684;&#x914D;&#x7F6E;&#x5728;&#x5F02;&#x78B3;&#x7684;&#x6350;&#x52A9;&#x7CD6;&#x7CD6;&#x82F7;&#x8F6C;&#x79FB;&#x9176;&#x3002;&#x6BCF;&#x4E2A;&#x9176;&#x5904;&#x4E8E;&#x540C;&#x4E00;&#x9636;&#x6BB5;&#x7684;&#x6838;&#x5FC3;&#x5BE1;&#x7CD6;&#x9AA8;&#x5E72;&#x6269;&#x5C55;&#x6DFB;&#x52A0;&#x7CD6;&#x6E23;&#x3002;&#x7136;&#x800C;&#xFF0C;&#x4ED6;&#x4EEC;&#x6709;&#x6240;&#x4E0D;&#x540C;&#x7684;&#x5DEE;&#x5411;&#x5F02;&#x6784;&#x4F53;&#x4E3A;&#x5176;&#x6350;&#x52A9;&#x6838;&#x82F7;&#x9178;&#x7CD6;&#xFF0C;&#x4EE5;&#x53CA;&#x5176;&#x627F;&#x5151;&#x6B8B;&#x7559;&#x7269;&#x3002;WaaJ &#x662F; UDP-&#x8461;&#x8404;&#x7CD6;&#xFF1A; &#xFF08;&#x534A;&#x4E73;&#x7CD6;) LPS &alpha;-1&#xFF0C;2-&#x8461;&#xFF0C;&#x800C; WaaR &#x548C; WaaT &#x5206;&#x522B;&#x6709; UDP-glucose:(glucosyl) LPS &alpha;-1&#xFF0C;2-&#x8461;&#x548C; UDP-galactose:(glucosyl) LPS &alpha;-1&#xFF0C;2-&#x8F6C;&#x79FB;&#x6D3B;&#x52A8;&#x3002;&#x8FD9;&#x9879;&#x5DE5;&#x4F5C;&#x7684;&#x76EE;&#x6807;&#x662F;&#x5BA1;&#x67E5;&#x5176;&#x5229;&#x7528;&#x5907;&#x7528;&#x7684;&#x6350;&#x52A9;&#x8005;&#x548C;&#x53D7;&#x4F17;&#x7684;&#x80FD;&#x529B;&#x3002;&#x5F53;&#x8868;&#x793A;&#x5F02;&#x6E90;&#x4E3B;&#x673A;&#x4E2D;&#xFF0C;&#x6BCF;&#x4E2A;&#x9176;&#x80FD;&#x591F;&#x5EF6;&#x957F;&#x5907;&#x7528;&#x8102;&#x591A;&#x7CD6;&#x53D7;&#x4F53;&#x4F53;&#x5185;&#x4F46;&#x4ED6;&#x4EEC;&#x4FDD;&#x7559;&#x5176;&#x5929;&#x7136;&#x6350;&#x52A9;&#x7279;&#x5F02;&#x6027;&#x3002;&#x7136;&#x540E;&#xFF0C;&#x6267;&#x884C;&#x4F53;&#x5916;&#x68C0;&#x6D4B;&#x65B9;&#x6CD5;&#x6765;&#x6D4B;&#x8BD5;&#x4EE3; epimeric &#x6350;&#x52A9;&#x7CD6;&#x5BF9;&#x7EB3;&#x5165;&#x6548;&#x7387;&#x4E0E;&#x81EA;&#x7136; LPS &#x627F;&#x5151;&#x4EBA;&#x7684;&#x8FD9;&#x79CD;&#x9176;&#x7684;&#x5F71;&#x54CD;&#x3002;&#x867D;&#x7136;&#x6BCF;&#x4E2A;&#x9176;&#x53EF;&#x5229;&#x7528;&#x5907;&#x7528;&#x6350;&#x52A9;&#x5F02;&#x6784;&#x4F53;&#xFF0C;&#x6D3B;&#x52A8;&#x53D7;&#x5230;&#x663E;&#x8457;&#x4E0B;&#x8DCC; k(cat) &#x548C; K(m)(donor) &#x7684;&#x76F8;&#x5E94;&#x589E;&#x52A0;&#x3002;&#x6700;&#x540E;&#xFF0C;&#x8FDB;&#x884C;&#x4E86;&#x4F53;&#x5916;&#x68C0;&#x6D4B;&#x65B9;&#x6CD5;&#x6765;&#x63A2;&#x6D4B;&#x627F;&#x5151;&#x4EBA;&#x504F;&#x7231;&#x7684;&#x7EC6;&#x80DE;&#x673A;&#x5236;&#x7F3A;&#x4E4F;&#x3002;&#x7ED3;&#x679C;&#x88AB;&#x9176;&#x4F9D;&#x8D56;&#xFF1A; &#x5907;&#x7528;&#x627F;&#x5151;&#x4EBA;&#x867D;&#x7136;&#x5BF9;&#x4ED6; 6 WaaT &#x7684;&#x52A8;&#x529B;&#x5B66;&#x884C;&#x4E3A;&#x6CA1;&#x6709;&#x663E;&#x8457;&#x5F71;&#x54CD;&#xFF0C;&#x4ED6; 6 WaaJ &#x663E;&#x793A;&#x5927;&#x5927;&#x51CF;&#x5C11;&#x7684; k(cat) &#x548C;&#x589E;&#x52A0; K(m)(acceptor)&#x3002;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x7ED3;&#x679C;&#x8BF4;&#x660E;&#x884C;&#x4E3A;&#x5BC6;&#x5207;&#x76F8;&#x5173;&#x7684;&#x7CD6;&#x53C2;&#x4E0E;&#x7684;&#x7C7B;&#x4F3C;&#x7CD6;&#x7F00;&#x5408;&#x7269;&#x5408;&#x6210;&#x7684;&#x9176;&#x4E4B;&#x95F4;&#x7684;&#x5DEE;&#x5F02;&#x548C;&#x5BF9; glycoengineering &#x5E94;&#x7528;&#x7A0B;&#x5E8F;&#x4EA7;&#x751F;&#x5F71;&#x54CD;&#x3002;

&#x7CD6;&#x57FA;&#x8F6C;&#x79FB;&#x9176;&#x53C2;&#x4E0E;&#x5916;&#x6838;&#x5FC3;&#x533A;&#x57DF;&#x7684;&#x5927;&#x80A0;&#x57C3;&#x5E0C;&#x6C0F;&#x5927;&#x80A0;&#x6746;&#x83CC;&#x8102;&#x591A;&#x7CD6;&#x751F;&#x7269;&#x5408;&#x6210;&#x8868;&#x73B0;&#x51FA;&#x66F4;&#x5E7F;&#x6CDB;&#x7684;&#x886C;&#x5E95;&#x7279;&#x70B9;&#x6BD4;&#x9884;&#x8BA1;&#x4ECE;&#x8102;&#x591A;&#x7CD6;&#x7ED3;&#x6784;&#x3002;

The waaJ, waaT, and waaR genes encode alpha-1,2-glycosyltransferases involved in synthesis of the outer core region of the lipopolysaccharide of Escherichia coli. They belong to the glycosyltransferase CAZy family 8, characterized by the GT-A fold, DXD motifs, and by retention of configuration at the anomeric carbon of the donor sugar. Each enzyme adds a hexose residue at the same stage of core oligosaccharide backbone extension. However, they differ in the epimers for their donor nucleotide sugars, and in their acceptor residues. WaaJ is a UDP-glucose: (galactosyl) LPS alpha-1,2-glucosyltransferase, whereas WaaR and WaaT have UDP-glucose:(glucosyl) LPS alpha-1,2-glucosyltransferase and UDP-galactose:(glucosyl) LPS alpha-1,2-galactosyltransferase activities, respectively. The objective of this work was to examine their ability to utilize alternate donors and acceptors. When expressed in the heterologous host, each enzyme was able to extend the alternate LPS acceptor in vivo but they retained their natural donor specificity. In vitro assays were then performed to test the effect of substituting the epimeric donor sugar on incorporation efficiency with the natural LPS acceptor of the enzyme. Although each enzyme could utilize the alternate donor epimer, activity was compromised because of significant decreases in k(cat) and corresponding increases in K(m)(donor). Finally, in vitro assays were performed to probe acceptor preference in the absence of the cellular machinery. The results were enzyme-dependent: while an alternate acceptor had no significant effect on the kinetic behavior of His(6)-WaaT, His(6)-WaaJ showed a significantly decreased k(cat) and increased K(m)(acceptor). These results illustrate the differences in behavior between closely related glycosyltransferase enzymes involved in the synthesis of similar glycoconjugates and have implications for glycoengineering applications.

Glycosyltransferases involved in biosynthesis of the outer core region of Escherichia coli lipopolysaccharides exhibit broader substrate specificities than is predicted from lipopolysaccharide structures.

Le waaJ, waaT et waaR g&egrave;nes codent alpha-1, 2-glycosyltransf&eacute;rases impliqu&eacute;es dans la synth&egrave;se de la r&eacute;gion de noyau externe du lipopolysaccharide d&#39;Escherichia coli. Ils appartiennent &agrave; la glycosyltransf&eacute;rase CAZy famille 8, caract&eacute;ris&eacute;e par le pli de GT-A, des motifs DXD et par r&eacute;tention de configuration au niveau du carbone anom&egrave;re du sucre donneur. Chaque enzyme ajoute un r&eacute;sidu d&#39;hexoses au m&ecirc;me stade d&#39;extension de colonne vert&eacute;brale core oligosaccharide. Cependant, ils diff&egrave;rent dans les &eacute;pim&egrave;res pour leurs sucres de nucl&eacute;otide de donateurs et leurs r&eacute;sidus de l&#39;accepteur. WaaJ est une UDP-glucose: (galactosyl) LPS alpha-1, 2-glucosyltransf&eacute;rase, tandis que WaaR et WaaT ont UDP-glucose:(glucosyl) LPS alpha-1, 2-glucosyltransf&eacute;rase et activit&eacute;s d&#39;alpha-1, 2-galactosyltransf&eacute;rase UDP-galactose:(glucosyl) LPS, respectivement. L&#39;objectif de ce travail &eacute;tait d&#39;examiner leur capacit&eacute; &agrave; utiliser les accepteurs et autres bailleurs de fonds. Lorsqu&#39;elle est exprim&eacute;e dans l&#39;h&ocirc;te h&eacute;t&eacute;rologue, chaque enzyme est capable d&#39;&eacute;tendre l&#39;accepteur alternatif de LPS in vivo, mais ils ont conserv&eacute; leur sp&eacute;cificit&eacute; naturelle donneur. Puis, essais in vitro ont &eacute;t&eacute; r&eacute;alis&eacute;es pour tester l&#39;effet de substituer le sucre &eacute;pim&egrave;res de donateurs sur l&#39;efficacit&eacute; de la Constitution avec l&#39;accepteur de LPS naturel de l&#39;enzyme. Bien que chaque enzyme pourrait utiliser l&#39;&eacute;pim&egrave;re de rechange donneur, activit&eacute; &eacute;tait compromise en raison des diminutions significatives des k(cat) et une augmentation correspondante dans K(m)(donor). Enfin, essais in vitro ont &eacute;t&eacute; r&eacute;alis&eacute;es pour sonder la pr&eacute;f&eacute;rence accepteur en l&#39;absence de la machinerie cellulaire. Les r&eacute;sultats &eacute;taient enzyme d&eacute;pendante : alors qu&#39;un accepteur de rechange n&#39;eu aucun effet significatif sur le comportement cin&eacute;tique de son 6-WaaT, son 6-WaaJ a montr&eacute; une diminution significative de k(cat) et augment&eacute; K(m)(acceptor). Ces r&eacute;sultats illustrent les diff&eacute;rences de comportement entre glycosyltransferase &eacute;troitement apparent&eacute;es enzymes impliqu&eacute;es dans la synth&egrave;se des glycoconjugu&eacute;s semblables et ont des implications pour les applications de glycosylation.

Glycosyltransf&eacute;rases impliqu&eacute;s dans la biosynth&egrave;se de la r&eacute;gion du noyau externe de lipopolysaccharides de Escherichia coli pr&eacute;sentent des sp&eacute;cificit&eacute;s de substrat plus larges que pr&eacute;vu de structures de lipopolysaccharides.

Der WaaJ, WaaT und WaaR Gene codieren Alpha-1,2-Glycosyltransferasen Synthese der Region &auml;u&szlig;eren Kern das Lipopolysaccharid von Escherichia coli beteiligt. Sie geh&ouml;ren zu den Glycosyltransferase CAZy Familie 8, gekennzeichnet durch die GT-A-Klappe, DXD Motiven und Aufbewahrung der Konfiguration am Anomere Kohlenstoffatom des Zuckers Spender. Jedes Enzym f&uuml;gt eine Hexose-R&uuml;ckst&auml;nde auf der gleichen Stufe der Kern-Oligosaccharid-R&uuml;ckgrat-Erweiterung. Jedoch unterscheiden sie sich in die Epimers f&uuml;r ihre Spender-Nukleotid-Zucker und in ihre Akzeptor-R&uuml;ckst&auml;nde. WaaJ ist ein UDP-Glukose: (Galaktosyltransferase) LPS Alpha-1,2-Glucosyltransferase, wohingegen WaaR und WaaT UDP-glucose:(glucosyl) LPS Alpha-1,2-Glucosyltransferase und UDP-galactose:(glucosyl) LPS Alpha-1,2-Galaktosyltransferase Aktivit&auml;ten, bzw. haben. Ziel dieser Arbeit war, ihre F&auml;higkeit, Alternativen Spendern und Acceptors nutzen zu pr&uuml;fen. Wenn im heterologen Host ausgedr&uuml;ckt, konnte jedes Enzym der alternativen LPS-Akzeptor in-vivo verl&auml;ngern, aber behielten sie ihre nat&uuml;rliche Spender-Spezifit&auml;t. In-vitro-Tests wurden dann durchgef&uuml;hrt, um die Auswirkungen der Substitution des Epimeric Spender Zuckers auf Einbeziehung Effizienz mit der nat&uuml;rlichen LPS-Akzeptor des Enzyms testen. Obwohl jedes Enzym der alternativen Spender-Epimer nutzen konnte, war T&auml;tigkeit wegen erheblichen R&uuml;ckgang der k(cat) und entsprechende Erh&ouml;hungen der K(m)(donor) gef&auml;hrdet. Schlie&szlig;lich wurden in-vitro-Tests durchgef&uuml;hrt, um die Sonde Akzeptor Pr&auml;ferenz in Ermangelung der zellul&auml;ren Maschinerie. Die Ergebnisse waren Enzym-abh&auml;ngig: w&auml;hrend eine Alternative Akzeptor keinen signifikanten Einfluss auf das kinetische Verhalten seiner 6-WaaT hatte, seine 6-WaaJ zeigte eine deutlich verminderte k(cat) und erh&ouml;hte K(m)(acceptor). Diese Ergebnisse zeigen die Unterschiede im Verhalten zwischen eng verwandten Glycosyltransferase Enzyme die Synthese von &auml;hnlichen Glykokonjugate beteiligt und haben Auswirkungen auf Glykan-Anwendungen.

Glykosyltransferasen beteiligt bei der Biosynthese von der &auml;u&szlig;eren Kernregion von Escherichia coli Lipopolysaccharide weisen breitere Substrat Besonderheiten als von Lipopolysaccharid Strukturen vorhergesagt ist.

Il waaJ e waaT waaR geni codificano per alpha-1,2-glycosyltransferases coinvolti nella sintesi della regione nucleo esterno del lipopolisaccaride di Escherichia coli. Essi appartengono al glycosyltransferase CAZy famiglia 8, caratterizzata da GT-A piega, motivi DXD e da ritenzione di configurazione al carbonio anomerico dello zucchero dei donatori. Ogni enzima aggiunge un residuo esoso nella stessa fase di estensione dorsale del nucleo degli oligosaccaridi. Tuttavia, si differenziano in epimeri per loro gli zuccheri nucleotide del donatore e nel loro residui accettore. WaaJ &egrave; un UDP-glucosio: (galattosil) LPS alpha-1,2-glucosiltransferasi, mentre WaaR e WaaT LPS UDP-glucose:(glucosyl) alpha-1,2-glucosiltransferasi e attivit&agrave; 1,2-alfa-galattosiltransferasi LPS UDP-galactose:(glucosyl), rispettivamente. L&#39;obiettivo di questo lavoro era quello di esaminare la loro capacit&agrave; di utilizzare accettori e donatori alternativi. Quando espresso nell&#39;ospite eterologo, ogni enzima &egrave; stato in grado di estendere l&#39;accettore LPS alternativo in vivo, ma hanno mantenuto la loro specificit&agrave; di donatore naturale. Saggi in vitro sono stati poi eseguiti per verificare l&#39;effetto di sostituire lo zucchero del donatore di epimeric sull&#39;efficienza di incorporazione con l&#39;accettore LPS naturale dell&#39;enzima. Sebbene ogni enzima potrebbe utilizzare il donatore alternativo epimero, attivit&agrave; era stata compromessa a causa di diminuzioni significative in k(cat) e corrispondenti aumenti in K(m)(donor). Infine, saggi in vitro sono stati eseguiti per sonda preferenza accettore in assenza del macchinario cellulare. I risultati sono stati enzima-dipendente: mentre un accettore alternativo ha avuto alcun effetto significativo sul comportamento cinetico di suo (6) - WaaT, suo (6) - WaaJ ha mostrato un k(cat) significativamente diminuita e aumentata K(m)(acceptor). Questi risultati illustrano le differenze di comportamento tra glycosyltransferase strettamente correlati gli enzimi coinvolti nella sintesi di glycoconjugates simili e hanno implicazioni per le applicazioni glycoengineering.

Glycosyltransferases coinvolti nella biosintesi della regione nucleo esterno di lipopolisaccaridi di Escherichia coli esibiscono pi&ugrave; ampia specificit&agrave; di substrato che &egrave; predetto da strutture lipopolisaccaride.

WaaJ&#x3001;waaT&#x3001;&#x304A;&#x3088;&#x3073; waaR &#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x30A2;&#x30EB;&#x30D5;&#x30A1;&#x306B;-1, 2-&#x7CD6;&#x8EE2;&#x79FB;&#x9175;&#x7D20;&#x5927;&#x8178;&#x83CC;&#x306E;&#x30EA;&#x30DD;&#x591A;&#x7CD6;&#x306E;&#x5916;&#x5074;&#x306E;&#x30B3;&#x30A2;&#x9818;&#x57DF;&#x306E;&#x5408;&#x6210;&#x306B;&#x95A2;&#x308F;&#x308B;&#x3092;&#x30A8;&#x30F3;&#x30B3;&#x30FC;&#x30C9;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x5F7C;&#x3089;&#x306F;&#x3001;GT A &#x500D;&#x3001;DXD &#x30E2;&#x30C1;&#x30FC;&#x30D5;&#x3068;&#x4FDD;&#x6301;&#x306B;&#x3088;&#x308B;&#x30A2;&#x30CE;&#x30DE;&#x30FC;&#x70AD;&#x7D20;&#x3067;&#x69CB;&#x6210;&#x7CD6;&#x4F9B;&#x4E0E;&#x4F53;&#x306E;&#x7279;&#x5FB4;&#x3068; CAZy &#x5BB6;&#x65CF; 8&#x3001;&#x7CD6;&#x8EE2;&#x79FB;&#x9175;&#x7D20;&#x306B;&#x5C5E;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x5404;&#x9175;&#x7D20;&#x30D8;&#x30AD;&#x30BD;&#x30FC;&#x30B9;&#x6B8B;&#x6E23;&#x30B3;&#x30A2; &#x30AA;&#x30EA;&#x30B4;&#x7CD6;&#x30D0;&#x30C3;&#x30AF;&#x30DC;&#x30FC;&#x30F3;&#x62E1;&#x5F35;&#x5B50;&#x306E;&#x540C;&#x3058;&#x6BB5;&#x968E;&#x3067;&#x8FFD;&#x52A0;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3057;&#x304B;&#x3057;&#x3001;&#x5F7C;&#x3089;&#x306F;&#x305D;&#x306E;&#x30C9;&#x30CA;&#x30FC; &#x30CC;&#x30AF;&#x30EC;&#x30AA;&#x30C1;&#x30C9;&#x7CD6;&#x985E;&#x306E;&#x9ED2;&#x6DF5;&#x3068;&#x305D;&#x306E;&#x53D7;&#x5BB9;&#x4F53;&#x306E;&#x6B8B;&#x7559;&#x7269;&#x3068;&#x306F;&#x7570;&#x306A;&#x308A;&#x307E;&#x3059;&#x3002;WaaJ &#x306F; UDP &#x30B0;&#x30EB;&#x30B3;&#x30FC;&#x30B9;&#xFF1A; &#x30A2;&#x30EB;&#x30D5;&#x30A1; 1, 2&#xFF0C; &#x30B0;&#x30EB;&#x30B3;&#x30B7;&#x30EB;&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30D5;&#x30A7;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC; (&#x30AC;&#x30E9;&#x30AF;&#x30C8;&#x30B7;&#x30EB;) LPS UDP-glucose:(glucosyl) LPS &#x30A2;&#x30EB;&#x30D5;&#x30A1;-1, 2-&#x30B0;&#x30EB;&#x30B3;&#x30B7;&#x30EB;&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30D5;&#x30A7;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC;&#x3068; UDP-galactose:(glucosyl) LPS &#x30A2;&#x30EB;&#x30D5;&#x30A1; 1, 2&#xFF0C; &#x30AC;&#x30E9;&#x30AF;&#x30C8;&#x30FC;&#x30B9;&#x8EE2;&#x79FB;&#x9175;&#x7D20;&#x306E;&#x6D3B;&#x52D5;&#x3001;&#x305D;&#x308C;&#x305E;&#x308C; WaaR &#x3068; WaaT &#x304C;&#x3042;&#x308B;&#x306B;&#x5BFE;&#x3057;&#x3002;&#x3053;&#x306E;&#x4F5C;&#x696D;&#x306E;&#x76EE;&#x7684;&#x306F;&#x3001;&#x4EE3;&#x66FF;&#x306E;&#x30C9;&#x30CA;&#x30FC;&#x3068;&#x30A2;&#x30AF;&#x30BB;&#x30D7;&#x30BF;&#x3092;&#x6D3B;&#x7528;&#x3059;&#x308B;&#x80FD;&#x529B;&#x3092;&#x691C;&#x8A0E;&#x3057;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x7570;&#x7A2E;&#x5BBF;&#x4E3B;&#x3067;&#x8868;&#x73FE;&#x3059;&#x308B;&#x3068;&#x3001;&#x5404;&#x9175;&#x7D20;&#x306F; in vivo &#x3067;&#x306E;&#x4EE3;&#x66FF;&#x306E; LPS &#x53D7;&#x5BB9;&#x4F53;&#x3092;&#x62E1;&#x5F35;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3060;&#x3063;&#x305F;&#x304C;&#x3001;&#x5F7C;&#x3089;&#x306F;&#x5F7C;&#x3089;&#x306E;&#x81EA;&#x7136;&#x306A;&#x30C9;&#x30CA;&#x30FC;&#x306E;&#x7279;&#x7570;&#x6027;&#x3092;&#x4FDD;&#x6301;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x8A66;&#x9A13;&#x7BA1;&#x5185;&#x30A2;&#x30C3;&#x30BB;&#x30A4;&#x306F;&#x305D;&#x306E;&#x5F8C;&#x306E;&#x6DF7;&#x5165;&#x52B9;&#x7387;&#x81EA;&#x7136; LPS &#x30A2;&#x30AF;&#x30BB;&#x30D7;&#x30BF;&#x30FC;&#x5206;&#x5B50;&#x9175;&#x7D20;&#x306E;&#x7CD6;&#x4F9B;&#x4E0E;&#x4F53; epimeric &#x3092;&#x4EE3;&#x5165;&#x3057;&#x305F;&#x5834;&#x5408;&#x306E;&#x52B9;&#x679C;&#x3092;&#x30C6;&#x30B9;&#x30C8;&#x3092;&#x884C;&#x3063;&#x305F;&#x3002;&#x5404;&#x9175;&#x7D20;&#x4EE3;&#x66FF;&#x30C9;&#x30CA;&#x30FC; &#x30A8;&#x30D4;&#x30DE;&#x30FC;&#x3092;&#x5229;&#x7528;&#x3067;&#x304D;&#x308B;&#x304C;&#x3001;k(cat) &#x306E;&#x6709;&#x610F;&#x306A;&#x6E1B;&#x5C11;&#x3068; K(m)(donor) &#x306E;&#x5BFE;&#x5FDC;&#x3059;&#x308B;&#x5897;&#x52A0;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x6D3B;&#x52D5;&#x304C;&#x4FB5;&#x5BB3;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x6700;&#x5F8C;&#x306B;&#x3001;&#x8A66;&#x9A13;&#x7BA1;&#x5185;&#x30A2;&#x30C3;&#x30BB;&#x30A4;&#x306F;&#x30A2;&#x30AF;&#x30BB;&#x30D7;&#x30BF;&#x30FC;&#x55DC;&#x597D;&#x7D30;&#x80DE;&#x6A5F;&#x68B0;&#x88C5;&#x7F6E;&#x306E;&#x4E0D;&#x5728;&#x3067;&#x30D7;&#x30ED;&#x30FC;&#x30D6;&#x3092;&#x884C;&#x3063;&#x305F;&#x3002;&#x7D50;&#x679C;&#x306F;&#x9175;&#x7D20;&#x4F9D;&#x5B58;&#x3067;&#x3042;&#x3063;&#x305F;: &#x4EE3;&#x66FF;&#x30A2;&#x30AF;&#x30BB;&#x30D7;&#x30BF;&#x306F;&#x5F7C; (6) - WaaT&#x3001;&#x5F7C;&#x306E; &#xFF08;6&#xFF09; - &#x306E;&#x904B;&#x52D5;&#x6319;&#x52D5;&#x306B;&#x5927;&#x304D;&#x306A;&#x5F71;&#x97FF;&#x3092;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x305F;&#x304C; WaaJ &#x306E;&#x6709;&#x610F;&#x306A;&#x6E1B;&#x5C11; k(cat) &#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x3001;K(m)(acceptor) &#x3092;&#x5897;&#x52A0;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x7D50;&#x679C;&#x306F;&#x3001;&#x5BC6;&#x63A5;&#x306B;&#x95A2;&#x9023;&#x3059;&#x308B;&#x7CD6;&#x8EE2;&#x79FB;&#x9175;&#x7D20;&#x306E;&#x9175;&#x7D20;&#x985E;&#x4F3C;&#x306E;&#x8907;&#x5408;&#x7CD6;&#x8CEA;&#x306E;&#x5408;&#x6210;&#x306B;&#x95A2;&#x308F;&#x308B;&#x52D5;&#x4F5C;&#x306E;&#x9055;&#x3044;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3001;&#x30AD;&#x30E3;&#x30EA;&#x30A2;&#x30FC;&#x306E;&#x30A2;&#x30D7;&#x30EA;&#x30B1;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x542B;&#x610F;&#x304C;&#x3042;&#x308A;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#x5916;&#x5074;&#x306E;&#x30B3;&#x30A2;&#x9818;&#x57DF;&#x5927;&#x8178;&#x83CC;&#x5927;&#x8178;&#x83CC;&#x306E;&#x30EA;&#x30DD;&#x591A;&#x7CD6;&#x306E;&#x751F;&#x5408;&#x6210;&#x306B;&#x95A2;&#x4E0E;&#x3059;&#x308B;&#x7CD6;&#x8EE2;&#x79FB;&#x9175;&#x7D20;&#x30EA;&#x30DD;&#x591A;&#x7CD6;&#x306E;&#x69CB;&#x9020;&#x304B;&#x3089;&#x306E;&#x4E88;&#x6E2C;&#x3088;&#x308A;&#x3082;&#x5E83;&#x3044;&#x306E;&#x57FA;&#x8CEA;&#x7279;&#x7570;&#x6027;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

WaaJ, waaT, &#xBC0F; waaR &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xC778;&#xCF54;&#xB529; &#xC54C;&#xD30C;-1, 2-glycosyltransferases &#xB300;&#xC7A5;&#xADE0; lipopolysaccharide &#xC678;&#xBD80; &#xD575;&#xC2EC; &#xC9C0;&#xC5ED;&#xC758; &#xD569;&#xC131;&#xC5D0; &#xAD00;&#xC5EC;. &#xADF8;&#xB4E4;&#xC740; glycosyltransferase CAZy &#xAC00;&#xC871; 8, GT A &#xBC30; DXD &#xBAA8;&#xD2F0;&#xBE0C; &#xACE0; &#xAE30;&#xC99D;&#xC790; &#xC124;&#xD0D5;&#xC758; anomeric &#xD0C4;&#xC18C;&#xC5D0;&#xC11C; &#xAD6C;&#xC131; &#xBCF4;&#xC874; &#xD558; &#xC5EC; &#xD2B9;&#xC9D5;&#xC5D0; &#xC18D;&#xD55C;&#xB2E4;. &#xAC01; &#xD6A8;&#xC18C;&#xB294; &#xCF54;&#xC5B4; &#xC62C;&#xB9AC;&#xACE0; &#xB2F9; &#xBC31;&#xBCF8; &#xD655;&#xC7A5;&#xC758; &#xB3D9;&#xC77C;&#xD55C; &#xB2E8;&#xACC4;&#xC5D0;&#xC11C; hexose &#xCC0C; &#xAEBC; &#xAE30;&#xB97C; &#xCD94;&#xAC00;&#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xADF8;&#xB7EC;&#xB098;, &#xADF8;&#xB4E4;&#xC740; &#xADF8;&#xB4E4;&#xC758; &#xAE30;&#xC99D;&#xC790; &#xB274;&#xD074;&#xB808;&#xC624;&#xD2F0;&#xB4DC; &#xC124;&#xD0D5;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; epimers &#xBC0F; &#xADF8;&#xB4E4;&#xC758; &#xC218;&#xB77D;&#xC790; &#xC794;&#xB958;&#xBB3C; &#xB2E4;&#xB985;&#xB2C8;&#xB2E4;. Waaj&#xC740; UDP &#xD3EC;&#xB3C4; &#xB2F9;: (galactosyl) LPS &#xC54C;&#xD30C;-1, 2-glucosyltransferase, WaaR &#xBC0F; Waat&#xB294; UDP-glucose:(glucosyl) LPS &#xC54C;&#xD30C;-1, 2-glucosyltransferase &#xBC0F; UDP-galactose:(glucosyl) LPS &#xC54C;&#xD30C;-1, 2-galactosyltransferase &#xD65C;&#xB3D9; &#xAC01;&#xAC01; &#xBC18;&#xBA74;. &#xC774; &#xC791;&#xD488;&#xC758; &#xBAA9;&#xC801;&#xC740; &#xB300;&#xCCB4; &#xAE30;&#xC99D;&#xC790; &#xC218;&#xB77D;&#xC790;&#xB97C; &#xD65C;&#xC6A9; &#xD558;&#xB294; &#xADF8;&#xB4E4;&#xC758; &#xAE30;&#xB2A5;&#xC744; &#xAC80;&#xC0AC; &#xD588;&#xB2E4;. &#xAC01; &#xD6A8;&#xC18C;&#xB294; vivo&#xC5D0;&#xC11C; &#xB300;&#xCCB4; LPS &#xC218;&#xB77D;&#xC790; &#xD655;&#xC7A5;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xAC8C; &#xBD84;&#xB9AC; &#xD638;&#xC2A4;&#xD2B8;&#xC5D0;&#xC11C; &#xD45C;&#xD604; &#xD558;&#xC9C0;&#xB9CC; &#xADF8;&#xB4E4;&#xC740; &#xADF8;&#xB4E4;&#xC758; &#xC790;&#xC5F0;&#xC801;&#xC778; &#xAE30;&#xC99D;&#xC790; &#xD2B9;&#xC774;&#xC131;&#xC744; &#xC720;&#xC9C0;. &#xC0DD;&#xCCB4; &#xC678; &#xBD84;&#xC11D; &#xC2E4;&#xD5D8; &#xB2E4;&#xC74C; &#xBCD1;&#xD569; &#xD6A8;&#xC728; &#xD6A8;&#xC18C;&#xC758; &#xC790;&#xC5F0; LPS &#xC218;&#xB77D;&#xC790;&#xC5D0; &#xB300; epimeric &#xAE30;&#xC99D;&#xC790; &#xC124;&#xD0D5; &#xB300;&#xCCB4;&#xC758; &#xD6A8;&#xACFC; &#xD14C;&#xC2A4;&#xD2B8;&#xB97C; &#xC218;&#xD589; &#xD588;&#xB2E4;. &#xAC01; &#xD6A8;&#xC18C; &#xB300;&#xCCB4; &#xAE30;&#xC99D;&#xC790; epimer&#xB97C; &#xD65C;&#xC6A9;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xB294;, &#xBE44;&#xB85D; &#xD65C;&#xB3D9; k(cat)&#xC5D0; &#xC788;&#xB294; &#xC0C1;&#xB2F9;&#xD55C; &#xAC10;&#xC18C;&#xC640; k(m)(donor)&#xC5D0; &#xD574;&#xB2F9; &#xC99D;&#xAC00; &#xC190;&#xC0C1; &#xB418;&#xC5C8;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xB9C8;&#xC9C0;&#xB9C9;&#xC73C;&#xB85C;, &#xC0DD;&#xCCB4; &#xC678; &#xBD84;&#xC11D; &#xC2E4;&#xD5D8; &#xC138;&#xD3EC;&#xC9C8; &#xAE30;&#xACC4; &#xC7A5;&#xCE58; &#xC5C6;&#xC774; &#xC218;&#xB77D;&#xC790; &#xC120;&#xD638; &#xC870;&#xC0AC;&#xB97C; &#xC218;&#xD589; &#xD588;&#xB2E4;. &#xACB0;&#xACFC;&#xAC00; &#xD6A8;&#xC18C; &#xC885;&#xC18D;: &#xB300;&#xCCB4; &#xC218;&#xB77D;&#xC790; &#xADF8;&#xC758; (6)-Waat&#xC758; &#xC6B4;&#xB3D9; &#xB3D9;&#xC791;&#xC5D0; &#xC0C1;&#xB2F9;&#xD55C; &#xC601;&#xD5A5;&#xC744; &#xD588;&#xB2E4;, &#xADF8;&#xC758; (6)-WaaJ &#xC8FC;&#xBA70; &#xD06C;&#xAC8C; &#xAC10;&#xC18C; k(cat) K(m)(acceptor) &#xC99D;&#xAC00; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xACB0;&#xACFC; &#xBC00;&#xC811; &#xD558; &#xAC8C; &#xAD00;&#xB828;&#xB41C; glycosyltransferase &#xD6A8;&#xC18C; &#xBE44;&#xC2B7;&#xD55C; glycoconjugates &#xD569;&#xC131;&#xC5D0; &#xAD00;&#xB828; &#xB41C; &#xB3D9;&#xC791;&#xC758; &#xCC28;&#xC774;&#xC810;&#xC744; &#xC124;&#xBA85; &#xD558; &#xACE0; glycoengineering &#xC751;&#xC6A9; &#xD504;&#xB85C;&#xADF8;&#xB7A8;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC758;&#xBBF8;&#xB97C;&#xAC00;&#xC9C0;&#xACE0;.

Glycosyltransferases &#xBCD1;&#xC6D0; &#xC131; &#xB300;&#xC7A5;&#xADE0; lipopolysaccharides&#xC758; &#xC678;&#xBD80; &#xD575;&#xC2EC; &#xC9C0;&#xC5ED;&#xC758; &#xC0DD; &#xD569;&#xC131;&#xC5D0; &#xAD00;&#xB828; &#xB41C; &#xAD11;&#xBC94;&#xC704; &#xD55C; &#xAE30;&#xC9C8; &#xD2B9;&#xC774;&#xC131; lipopolysaccharide &#xAD6C;&#xC870;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC608;&#xC0C1; &#xBCF4;&#xB2E4; &#xC804;&#xC2DC;.

El waaJ, waaT y waaR genes codifican alfa-1,2-glicosiltransferasas implicados en la s&iacute;ntesis de la regi&oacute;n del n&uacute;cleo exterior de los lipopolisac&aacute;ridos de Escherichia coli. Pertenecen a la glicosiltransferasa CAZy familia 8, caracterizado por el GT-A veces, motivos DXD y retenci&oacute;n de la configuraci&oacute;n en el carbono anom&eacute;rico del az&uacute;car donantes. Cada enzima a&ntilde;ade un residuo de hexosas en la misma etapa de extensi&oacute;n columna vertebral oligosac&aacute;rido. Sin embargo, difieren en la ep&iacute;meros de sus az&uacute;cares de nucle&oacute;tido de donantes y en sus residuos del aceptador. WaaJ es un UDP-glucosa: (galactosil) LPS alfa-1,2-glucosiltransferasa, Considerando que WaaR y WaaT UDP-glucose:(glucosyl) LPS alfa-1,2-glucosiltransferasa y actividades de alfa-1, 2-galactosyltransferase UDP-galactose:(glucosyl) LPS, respectivamente. El objetivo de este trabajo fue examinar su capacidad para utilizar aceptadores y donantes alternativos. Cuando se expresan en el host heter&oacute;logo, cada enzima fue capaz de extender el aceptador de LPS alternativo en vivo pero conservaron su especificidad natural donante. Luego se realizaron ensayos in vitro para probar el efecto de sustituir el az&uacute;car de la donante de epimeric sobre la eficacia de la incorporaci&oacute;n con el aceptador de LPS natural de la enzima. Aunque cada enzima podr&iacute;a utilizar el ep&iacute;mero donantes alternativo, actividad fue comprometida debido a una disminuci&oacute;n significativa en el k(cat) y el aumento correspondiente K(m)(donor). Finalmente, se realizaron ensayos in vitro para sonda preferencia aceptador en ausencia de la maquinaria celular. Los resultados fueron enzima dependiente: mientras un aceptor alterno no tuvo efectos significativos sobre el comportamiento cin&eacute;tico de su 6-WaaT, su 6-WaaJ demostr&oacute; un k(cat) significativamente disminuida y aument&oacute; K(m)(acceptor). Estos resultados ilustran las diferencias de comportamiento entre glicosiltransferasa estrechamente relacionados con las enzimas implicadas en la s&iacute;ntesis de los glicoconjugados similares y tienen consecuencias para aplicaciones de glycoengineering.

Glicosiltransferasas implicadas en la bios&iacute;ntesis de la regi&oacute;n del n&uacute;cleo exterior de lipopolisac&aacute;ridos de Escherichia coli exhiben especificidades de sustrato m&aacute;s amplias que se prev&eacute; de estructuras de lipopolisac&aacute;rido.

Le lectine sono stati sempre pi&ugrave; importante nello studio delle glicoproteine. Riportiamo un metodo glycoprofiling basato sull&#39;allegato covalente di polimeri chelanti metalli di lectine per uso in un&#39;analisi ICP-MS-basata. Le lectine etichette sono in grado di distinguere tra glicoproteine covalenza collegate a una piastra di microtitolo e loro associazione pu&ograve; essere misurata direttamente mediante ICP-MS. Poich&eacute; ogni coniugato contiene un lantanide differente, i dosaggi possono essere condotte in modo singolo o multiplo e possono essere prontamente elaborati in molti formati diversi test.

ICP-MS-based multiplex profilatura delle glicoproteine usando le lectine coniugata con polimeri chelanti lantanidi.

&#x30EC;&#x30AF;&#x30C1;&#x30F3;&#x306F;&#x7CD6;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306E;&#x7814;&#x7A76;&#x3067;&#x307E;&#x3059;&#x307E;&#x3059;&#x91CD;&#x8981;&#x306A;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x3053;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x91D1;&#x5C5E;&#x30AD;&#x30EC;&#x30FC;&#x30C8;&#x9AD8;&#x5206;&#x5B50;&#x306E;&#x30AD;&#x30E3;&#x30E9;&#x30AF;&#x30BF;&#x30EA;&#x30BC;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3; &#x30EC;&#x30AF;&#x30C1;&#x30F3; ICP-MS &#x30D9;&#x30FC;&#x30B9;&#x306E;&#x30A2;&#x30C3;&#x30BB;&#x30A4;&#x3067;&#x4F7F;&#x7528;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x57FA;&#x3065;&#x304F; glycoprofiling &#x6CD5;&#x3092;&#x5831;&#x544A;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x6A19;&#x8B58;&#x30EC;&#x30AF;&#x30C1;&#x30F3;&#x304C;&#x5171;&#x6709;&#x7D50;&#x5408;&#x30DE;&#x30A4;&#x30AF;&#x30ED;&#x30BF;&#x30A4;&#x30BF;&#x30FC; &#x30D7;&#x30EC;&#x30FC;&#x30C8;&#x306B;&#x63A5;&#x7D9A;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x7CD6;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x3092;&#x533A;&#x5225;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x307E;&#x3059;&#x3055;&#x308C;&#x3001;&#x305D;&#x306E;&#x30D0;&#x30A4;&#x30F3;&#x30C7;&#x30A3;&#x30F3;&#x30B0;&#x306F;&#x76F4;&#x63A5; ICP-MS &#x306B;&#x3088;&#x308B;&#x5B9A;&#x91CF;&#x5316;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x5404;&#x5171;&#x5F79;&#x7570;&#x306A;&#x308B;&#x30E9;&#x30F3;&#x30BF;&#x30CB;&#x30C9;&#x3092;&#x542B;&#x3093;&#x3067;&#x3044;&#x308B;&#x306E;&#x3067;&#x306F;&#x8A66;&#x91D1;&#x3092;&#x5358;&#x4E00;&#x307E;&#x305F;&#x306F;&#x591A;&#x91CD;&#x7684;&#x306B;&#x5B9F;&#x65BD;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x3001;&#x5BB9;&#x6613;&#x306B;&#x591A;&#x304F;&#x306E;&#x7570;&#x306A;&#x308B;&#x30A2;&#x30C3;&#x30BB;&#x30A4; &#x30D5;&#x30A9;&#x30FC;&#x30DE;&#x30C3;&#x30C8;&#x3092;&#x63A8;&#x6572;&#x3057;&#x306A;&#x3051;&#x308C;&#x3070;&#x306A;&#x308A;&#x307E;&#x305B;&#x3093;&#x3002;

ICP-MS &#x30D9;&#x30FC;&#x30B9;&#x591A;&#x91CD;&#x30EC;&#x30AF;&#x30C1;&#x30F3;&#x3092;&#x7528;&#x3044;&#x305F;&#x7CD6;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306E;&#x30D7;&#x30ED;&#x30D5;&#x30A1;&#x30A4;&#x30EA;&#x30F3;&#x30B0;&#x5171;&#x5F79;&#x30E9;&#x30F3;&#x30BF;&#x30CB;&#x30C9; &#x30AD;&#x30EC;&#x30FC;&#x30C8;&#x9AD8;&#x5206;&#x5B50;&#x306B;&#x3002;

&#x51DD;&#x96C6;&#x7D20;&#x5DF2;&#x7CD6;&#x86CB;&#x767D;&#x7814;&#x7A76;&#x4E2D;&#x8D8A;&#x6765;&#x8D8A;&#x91CD;&#x8981;&#x3002;&#x5728;&#x8FD9;&#x91CC;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x62A5;&#x544A;&#x4E00;&#x79CD;&#x57FA;&#x4E8E;&#x91D1;&#x5C5E;&#x87AF;&#x5408;&#x805A;&#x5408;&#x7269;&#x5171;&#x4EF7;&#x9644;&#x4EF6;&#x7528;&#x4E8E;&#x57FA;&#x4E8E; ICP MS &#x6CD5;&#x6D4B;&#x5B9A;&#x51DD;&#x96C6;&#x7D20;&#x7684;&#x7CD6;&#x65B9;&#x6CD5;&#x3002;&#x6807;&#x8BB0;&#x7684;&#x51DD;&#x96C6;&#x7D20;&#x662F;&#x80FD;&#x591F;&#x533A;&#x5206;&#x5171;&#x4EF7;&#x952E;&#x7ED3;&#x6784;&#x5230;&#x5FAE;&#x5B54;&#x677F;&#x7CD6;&#x86CB;&#x767D;&#x548C;&#x7535;&#x611F;&#x8026;&#x5408;&#x7B49;&#x79BB;&#x5B50;&#x4F53;&#x8D28;&#x8C31;&#x53EF;&#x4EE5;&#x76F4;&#x63A5;&#x91CF;&#x5316;&#x5176;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x3002;&#x56E0;&#x4E3A;&#x6BCF;&#x4E2A;&#x5171;&#x8F6D;&#x5305;&#x542B;&#x4E0D;&#x540C;&#x7684;&#x9567;&#x7CFB;&#x5143;&#x7D20;&#xFF0C;&#x6BD2;&#x6027;&#x68C0;&#x6D4B;&#x65B9;&#x6CD5;&#x53EF;&#x4EE5;&#x8FDB;&#x884C;&#x5355;&#x4E00;&#x6216;&#x591A;&#x8DEF;&#x590D;&#x7528;&#x7684;&#x65B9;&#x5F0F;&#xFF0C;&#x548C;&#x53EF;&#x80FD;&#x968F;&#x65F6;&#x9610;&#x8FF0;&#x5230;&#x8BB8;&#x591A;&#x4E0D;&#x540C;&#x7684;&#x6D4B;&#x5B9A;&#x683C;&#x5F0F;&#x3002;

&#x57FA;&#x4E8E; ICP MS &#x591A;&#x8DEF;&#x590D;&#x7528;&#x5206;&#x6790;&#x4F7F;&#x7528;&#x51DD;&#x96C6;&#x7D20;&#x7684;&#x7CD6;&#x86CB;&#x767D;&#x7684;&#x5171;&#x8F6D;&#x5BF9;&#x9567;&#x7CFB;&#x87AF;&#x5408;&#x805A;&#x5408;&#x7269;&#x3002;

Lectins have been increasingly important in the study of glycoproteins. Here, we report a glycoprofiling method based on the covalent attachment of metal-chelating polymers to lectins for use in an ICP-MS-based assay. The labeled lectins are able to distinguish between glycoproteins covalently attached to a microtiter plate and their binding can be directly quantified by ICP-MS. Since each conjugate contains a different lanthanide, the assays can be conducted in a single or multiplex fashion, and may be readily elaborated to many different assay formats.

ICP-MS-based multiplex profiling of glycoproteins using lectins conjugated to lanthanide-chelating polymers.

Lectines ont &eacute;t&eacute; de plus en plus importants dans l&#39;&eacute;tude des glycoprot&eacute;ines. Nous rapportons ici une m&eacute;thode de glycoprofiling bas&eacute;e sur l&#39;attachement covalent des ch&eacute;lateurs de m&eacute;taux polym&egrave;res aux lectines devant servir &agrave; une analyse ax&eacute;e sur les ICP-MS. Les lectines marqu&eacute;es sont capables de distinguer entre les glycoprot&eacute;ines de fa&ccedil;on covalente &agrave; une plaque de microtitration et leur liaison peut &ecirc;tre quantifi&eacute; directement par ICP-MS. Puisque chaque conjugu&eacute; contient un lanthanide diff&eacute;rent, les dosages peuvent &ecirc;tre men&eacute;es de mani&egrave;re unique ou multiplex et peuvent &ecirc;tre facilement &eacute;labor&eacute;s vers de nombreux formats diff&eacute;rents test.

ICP-MS-fonction multiplex profilage des glycoprot&eacute;ines utilisant des lectines conjugu&eacute; &agrave; polym&egrave;res ch&eacute;lateurs de lanthanide.

Lektine wurden in der Studie von Glykoproteinen zunehmend an Bedeutung. Hier berichten wir &uuml;ber eine Glycoprofiling-Methode, basierend auf die kovalente Anlage Metall-Chelat-Polymere auf Lektine f&uuml;r den Einsatz in einer ICP-MS-gegr&uuml;ndeten Probe. Die beschrifteten Lektine sind zu unterscheiden von Glykoproteinen kovalent gebunden zu einer Mikrotiterplatte und ihre Bindung direkt quantifiziert werden kann, von ICP-MS. Da jede Konjugat eines anderen Lanthanoide enth&auml;lt, die Assays in Einzel- oder multiplex Weise durchgef&uuml;hrt werden k&ouml;nnen, und k&ouml;nnen auf viele verschiedene Assay-Formate leicht erarbeitet werden.

ICP-MS-basierte multiplex Profilerstellung von Glykoproteinen Lektine mit konjugierten Lanthanide Chelat-Polymere.

Lectins &#xC810;&#xC810; glycoproteins&#xC758; &#xC5F0;&#xAD6C;&#xC5D0; &#xC911;&#xC694; &#xD55C; &#xB418;&#xC5C8;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC5EC;&#xAE30;&#xC5D0;, &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; ICP MS &#xAE30;&#xBC18; &#xBD84;&#xC11D; &#xACB0;&#xACFC;&#xC5D0;&#xC11C; lectins &#xAE08;&#xC18D; &#xD0AC;&#xB808;&#xC774;&#xD2B8; &#xD654; &#xACE0;&#xBD84;&#xC790;&#xC758; &#xACF5;&#xC720; &#xCCA8;&#xBD80; &#xD30C;&#xC77C;&#xC5D0;&#xB294; glycoprofiling &#xBC29;&#xC2DD;&#xC744; &#xBCF4;&#xACE0; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xB808;&#xC774;&#xBE14;&#xC774; &#xC788;&#xB294; lectins &#x70AD; microtiter &#xD50C;&#xB808;&#xC774;&#xD2B8;&#xC5D0; &#xC5F0;&#xACB0; &#xB41C; glycoproteins&#xB97C; &#xAD6C;&#xBCC4;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xC73C;&#xBA70; &#xBC14;&#xC778;&#xB529;&#xC744; &#xC9C1;&#xC811; ICP MS&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xCE21;&#xC815;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xB2E4;. &#xAC01; &#xACF5;&#xC561; &#xD3EC;&#xD568; &#xB2E4;&#xB978; &#xB780;&#xD0C0;&#xB118;&#xC871; &#xC774;&#xD6C4;&#xB294; &#xBD84;&#xC11D; &#xC2E4;&#xD5D8; &#xB2E8;&#xC77C; &#xB610;&#xB294; &#xB2E4;&#xC911; &#xBC29;&#xC2DD;&#xC73C;&#xB85C; &#xC218;&#xD589;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4; &#xADF8;&#xB9AC;&#xACE0; &#xB9CE;&#xC740; &#xB2E4;&#xB978; &#xBD84;&#xC11D; &#xACB0;&#xACFC; &#xD615;&#xC2DD; &#xC27D;&#xAC8C; &#xC815;&#xAD50; &#xB420; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;.

Lectins&#xB97C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; glycoproteins&#xC758; &#xD504;&#xB85C; &#xD30C;&#xC77C;&#xB9C1; &#xBA40;&#xD2F0;&#xD50C;&#xB809;&#xC2A4; ICP MS &#xAE30;&#xBC18; &#xB780;&#xD0C0;&#xB118;&#xC871; &#xD0AC;&#xB808;&#xC774;&#xD2B8; &#xD654; &#xACE0;&#xBD84;&#xC790;&#xB97C; &#xD65C;&#xC6A9; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;.

Lectinas han sido cada vez m&aacute;s importantes en el estudio de las glicoprote&iacute;nas. Presentamos un m&eacute;todo de glycoprofiling basado en la fijaci&oacute;n covalente de pol&iacute;meros quelantes del metal al lectinas para su uso en un an&aacute;lisis de ICP-MS-basado. Los etiquetado lectinas son capaces de distinguir entre glicoprote&iacute;nas covalentemente Unidos a una placa de microtitulaci&oacute;n y su enlace puede cuantificarse directamente por ICP-MS. Puesto que cada conjugado contiene una serie de los lant&aacute;nidos diferente, los ensayos pueden realizarse de manera individual o m&uacute;ltiplex y pueden ser f&aacute;cilmente elaborados a muchos formatos de ensayo diferentes.

Perfiles multiplex basados en ICP-MS de glicoprote&iacute;nas con lectinas conjugan con quelantes del lant&aacute;nido pol&iacute;meros.

Fluoreszierende Durchflusszytometrie ist die Methode der Wahl f&uuml;r die Befragung des bakteriellen Bev&ouml;lkerungen auf der Ebene der einzelnen Zelle geworden. Einschr&auml;nkungen dieser Technik umfassen jedoch Fragen der Dynamikbereich, spektrale &Uuml;berlappung, Photobleaching und insgesamt niedrige Signalintensit&auml;t aufgrund der geringen Gr&ouml;&szlig;e der Bakterien. Die aktuelle Entwicklung der Masse Cytometry erlaubt einzellige Analyse mit der Aufl&ouml;sung von Induktiv gekoppelte Plasma-Massenspektrometrie, multiparametric Analyse zu erleichtern. Mit einer Kombination aus einem metallbasierte Membran-Fleck und Lektine Konjugation mit LANTHANIDEN-Chelat-Polymere, zeigen wir, dass einzelne Escherichia coli Zellen basierend auf ihrer Zelle-Oberfl&auml;che Polysaccharide mit mass Cytometry unterschieden werden k&ouml;nnen. Das Modell E. Coli System betrifft die Bewertung von drei verschiedenen Oberfl&auml;che Polysaccharide mit Element-Tags Concanavalin A und Weizenkeime Agglutinin Lektine. Schlie&szlig;lich ersetzt diese Technik aktiviert-Experimente entwickelt, um den Export von O-Antigen folgen Lipopolysaccharid in eine bedingte Mutante. Diese Studien ergeben, dass die Kultur als eine einheitliche Bev&ouml;lkerung reagiert und Lipopolysaccharid-Export ist ungef&auml;hr 10-mal schneller als die logarithmische bakteriell dauert.

Entwicklung von Masse Cytometry Methoden f&uuml;r bakterielle Diskriminierung.

&#x86CD;&#x5149;&#x30D5;&#x30ED;&#x30FC;&#x30B5;&#x30A4;&#x30C8;&#x30E1;&#x30C8;&#x30EA;&#x30FC;&#x5C0B;&#x554F;&#x5358;&#x4E00;&#x7D30;&#x80DE;&#x30EC;&#x30D9;&#x30EB;&#x3067;&#x306E;&#x7D30;&#x83CC;&#x306E;&#x96C6;&#x56E3;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x9078;&#x629E;&#x65B9;&#x5F0F;&#x306B;&#x306A;&#x3063;&#x305F;&#x3002;&#x305F;&#x3060;&#x3057;&#x3001;&#x3053;&#x306E;&#x624B;&#x6CD5;&#x306E;&#x9650;&#x754C;&#x306F;&#x30C0;&#x30A4;&#x30CA;&#x30DF;&#x30C3;&#x30AF; &#x30EC;&#x30F3;&#x30B8;&#x3001;&#x30B9;&#x30DA;&#x30AF;&#x30C8;&#x30EB;&#x306E;&#x91CD;&#x306A;&#x308A;&#x3001;&#x9000;&#x8272;&#x3001;&#x5168;&#x4F53;&#x7684;&#x306B;&#x4F4E;&#x3044;&#x4FE1;&#x53F7;&#x5F37;&#x5EA6;&#x7D30;&#x83CC;&#x306E;&#x5C0F;&#x578B;&#x30B5;&#x30A4;&#x30BA;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x554F;&#x984C;&#x304C;&#x3042;&#x308A;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x8CEA;&#x91CF; cytometry &#x306E;&#x6700;&#x8FD1;&#x306E;&#x958B;&#x767A;&#x5358;&#x4E00;&#x7D30;&#x80DE;&#x89E3;&#x6790; multiparametric &#x5206;&#x6790;&#x3092;&#x4FC3;&#x9032;&#x3059;&#x308B;&#x8A98;&#x5C0E;&#x7D50;&#x5408;&#x30D7;&#x30E9;&#x30BA;&#x30DE;&#x8CEA;&#x91CF;&#x5206;&#x6790;&#x6CD5;&#x306E;&#x5206;&#x89E3;&#x80FD;&#x3092;&#x6301;&#x3064;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x91D1;&#x5C5E;&#x30D9;&#x30FC;&#x30B9;&#x819C;&#x67D3;&#x8272;&#x3068;&#x30EC;&#x30AF;&#x30C1;&#x30F3;&#x306E;&#x7D44;&#x307F;&#x5408;&#x308F;&#x305B;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x3066;&#x5171;&#x5F79;&#x30E9;&#x30F3;&#x30BF;&#x30CB;&#x30C9; &#x30AD;&#x30EC;&#x30FC;&#x30C8;&#x9AD8;&#x5206;&#x5B50;&#x306B;&#x306F;&#x3001;&#x79C1;&#x305F;&#x3061;&#x500B;&#x3005; &#x306E;&#x5927;&#x8178;&#x83CC;&#x5927;&#x8178;&#x83CC;&#x7D30;&#x80DE;&#x8CEA;&#x91CF;&#x30D5;&#x30ED;&#x30FC;&#x30B5;&#x30A4;&#x30C8;&#x30E1;&#x30C8;&#x30EA;&#x30FC;&#x6CD5;&#x3092;&#x7528;&#x3044;&#x3066;&#x3001;&#x7D30;&#x80DE;&#x8868;&#x9762;&#x591A;&#x7CD6;&#x985E;&#x306B;&#x57FA;&#x3065;&#x3044;&#x3066;&#x533A;&#x5225;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x30E2;&#x30C7;&#x30EB;&#x5927;&#x8178;&#x83CC;&#x30B7;&#x30B9;&#x30C6;&#x30E0;&#x306B;&#x306F;&#x8981;&#x7D20;&#x30BF;&#x30B0; &#x30B3;&#x30F3;&#x30AB;&#x30CA;&#x30D0;&#x30EA;&#x30F3; A &#x3068;&#x5C0F;&#x9EA6;&#x80DA;&#x82BD;&#x51DD;&#x96C6;&#x7D20;&#x30EC;&#x30AF;&#x30C1;&#x30F3;&#x3092;&#x7528;&#x3044;&#x305F; 3 &#x3064;&#x306E;&#x7570;&#x306A;&#x308B;&#x8868;&#x9762;&#x591A;&#x7CD6;&#x985E;&#x306E;&#x8A55;&#x4FA1;&#x304C;&#x542B;&#x307E;&#x308C;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x6700;&#x5F8C;&#x306B;&#x3001;O &#x6297;&#x539F;&#x306E;&#x30A8;&#x30AF;&#x30B9;&#x30DD;&#x30FC;&#x30C8;&#x3092;&#x5B9F;&#x884C;&#x3059;&#x308B;&#x3088;&#x3046;&#x306B;&#x8A2D;&#x8A08;&#x3053;&#x306E;&#x624B;&#x6CD5;&#x304C;&#x6709;&#x52B9;&#x306A;&#x5B9F;&#x9A13;&#x6761;&#x4EF6;&#x4ED8;&#x304D;&#x5909;&#x7570;&#x682A;&#x30EA;&#x30DD;&#x591A;&#x7CD6;&#x3067;&#x4EE3;&#x7528;&#x3002;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x7814;&#x7A76;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x6587;&#x5316;&#x306E;&#x5747;&#x4E00;&#x306A;&#x96C6;&#x56E3;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x5FDC;&#x7B54;&#x3057;&#x3001;&#x30EA;&#x30DD;&#x591A;&#x7CD6;&#x306E;&#x8F38;&#x51FA;&#x304C;&#x500D;&#x52A0;&#x6642;&#x9593;&#x5BFE;&#x6570;&#x306E;&#x7D30;&#x83CC;&#x3088;&#x308A;&#x3082;&#x7D04; 10 &#x500D;&#x9AD8;&#x901F;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x660E;&#x3089;&#x304B;&#x306B;&#x3057;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;

&#x7D30;&#x83CC;&#x306E;&#x5DEE;&#x5225;&#x306E;&#x8CEA;&#x91CF;&#x30D5;&#x30ED;&#x30FC;&#x30B5;&#x30A4;&#x30C8;&#x30E1;&#x30C8;&#x30EA;&#x30FC;&#x6CD5;&#x306E;&#x958B;&#x767A;&#x3002;

Citometria a flusso fluorescente &egrave; diventato il metodo di scelta per l&#39;interrogatorio di popolazioni batteriche a livello di cella singola. Tuttavia, limitazioni di questa tecnica includono problemi di gamma dinamica, la sovrapposizione spettrale, photobleaching e intensit&agrave; di segnale nel complesso basso a causa delle piccole dimensioni dei batteri. Il recente sviluppo di massa cytometry permette l&#39;analisi di cella singola con la risoluzione di spettrometria di massa al plasma accoppiato induttivamente, agevolando analisi multiparametrica. Utilizzando una combinazione di una macchia di membrana base metallica e lectine coniugate ai polimeri chelanti lantanidi, dimostreremo che le singole cellule di Escherichia coli possono essere differenziate basato sulla loro polisaccaridi di superficie cellulare mediante citometria a massa. Il sistema di e. coli modello comporta la valutazione di tre diversi polisaccaridi superficie utilizzando elemento taggati con Concanavalina A e lectine agglutinina germe di grano. Infine, questo esperimenti tecnica abilitato progettato per seguire l&#39;esportazione dell&#39;antigene O sostituito lipopolisaccaride in un mutante condizionale. Questi studi hanno rivelato che la cultura risponde come una popolazione uniforme e che esporta lipopolisaccaride &egrave; circa 10 volte pi&ugrave; veloce la logaritmica batterica raddoppiando il tempo.

Sviluppo di metodi di massa cytometry per discriminazione batterica.

&#x8367;&#x5149;&#x6D41;&#x5F0F;&#x7EC6;&#x80DE;&#x672F;&#x5DF2;&#x6210;&#x4E3A;&#x9009;&#x62E9;&#x7684;&#x5355;&#x4E2A;&#x5355;&#x5143;&#x683C;&#x7EA7;&#x522B;&#x7684;&#x7EC6;&#x83CC;&#x83CC;&#x7FA4;&#x7684;&#x5BA1;&#x8BAF;&#x65B9;&#x6CD5;&#x3002;&#x7136;&#x800C;&#xFF0C;&#x8FD9;&#x79CD;&#x6280;&#x672F;&#x7684;&#x5C40;&#x9650;&#x6027;&#x5305;&#x62EC;&#xFF1A; &#x52A8;&#x6001;&#x8303;&#x56F4;&#x3001; &#x5149;&#x8C31;&#x91CD;&#x53E0;&#x3001; &#x6F02;&#x767D;&#xFF0C;&#x89C4;&#x6A21;&#x5C0F;&#x7684;&#x7EC6;&#x83CC;&#x6574;&#x4F53;&#x4F4E;&#x4FE1;&#x53F7;&#x5F3A;&#x5EA6;&#x7684;&#x95EE;&#x9898;&#x3002;&#x6700;&#x8FD1;&#x53D1;&#x5C55;&#x7684;&#x5927;&#x89C4;&#x6A21;&#x6D41;&#x5F0F;&#x7EC6;&#x80DE;&#x4EEA;&#x5141;&#x8BB8;&#x5355;&#x4E2A;&#x5355;&#x5143;&#x683C;&#x5206;&#x6790;&#x7535;&#x611F;&#x8026;&#x5408;&#x7684;&#x7B49;&#x79BB;&#x5B50;&#x4F53;&#x8D28;&#x8C31;&#x6CD5;&#xFF0C;&#x4FC3;&#x8FDB;&#x591A;&#x53C2;&#x6570;&#x5206;&#x6790;&#x7684;&#x51B3;&#x8BAE;&#x3002;&#x4F7F;&#x7528;&#x4E00;&#x79CD;&#x57FA;&#x4E8E;&#x91D1;&#x5C5E;&#x819C;&#x67D3;&#x8272;&#x548C;&#x51DD;&#x96C6;&#x7D20;&#x7684;&#x7EC4;&#x5408;&#x5171;&#x8F6D;&#x5BF9;&#x9567;&#x7CFB;&#x87AF;&#x5408;&#x805A;&#x5408;&#x7269;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x8868;&#x73B0;&#x51FA;&#x4E2A;&#x522B;&#x5927;&#x80A0;&#x57C3;&#x5E0C;&#x6C0F;&#x5927;&#x80A0;&#x6746;&#x83CC;&#x7EC6;&#x80DE;&#xFF0C;&#x53EF;&#x4EE5;&#x5206;&#x5316;&#x57FA;&#x4E8E;&#x4F7F;&#x7528;&#x5927;&#x89C4;&#x6A21;&#x7684;&#x6D41;&#x5F0F;&#x7EC6;&#x80DE;&#x4EEA;&#x53CA;&#x5176;&#x7EC6;&#x80DE;&#x8868;&#x9762;&#x591A;&#x7CD6;&#x3002;&#x6A21;&#x578B;&#x5927;&#x80A0;&#x6746;&#x83CC;&#x7CFB;&#x7EDF;&#x6D89;&#x53CA;&#x4F7F;&#x7528;&#x5143;&#x7D20;&#x6807;&#x8BB0;&#x7684;&#x5200;&#x8C46;&#x86CB;&#x767D; A &#x548C;&#x9EA6;&#x80DA;&#x51DD;&#x96C6;&#x7D20;&#x51DD;&#x96C6;&#x7D20;&#x7684;&#x4E09;&#x4E2A;&#x4E0D;&#x540C;&#x8868;&#x9762;&#x591A;&#x7CD6;&#x7684;&#x8BC4;&#x4EF7;&#x3002;&#x6700;&#x540E;&#xFF0C;&#x6B64;&#x6280;&#x672F;&#x542F;&#x7528;&#x5B9E;&#x9A8C;&#x65E8;&#x5728;&#x6309;&#x7167;&#x51FA;&#x53E3;&#x7684; O &#x6297;&#x539F;&#x53D6;&#x4EE3;&#x8102;&#x591A;&#x7CD6;&#x6761;&#x4EF6;&#x7684;&#x7A81;&#x53D8;&#x4F53;&#x3002;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x7814;&#x7A76;&#x8868;&#x660E;&#x6587;&#x5316;&#x54CD;&#x5E94;&#x4F5C;&#x4E3A;&#x4E00;&#x4E2A;&#x7EDF;&#x4E00;&#x7684;&#x4EBA;&#x53E3;&#x548C;&#x8102;&#x591A;&#x7CD6;&#x51FA;&#x53E3;&#x662F;&#x5927;&#x7EA6;&#x6BD4;&#x65F6;&#x95F4;&#x589E;&#x52A0;&#x4E00;&#x500D;&#x7684;&#x5BF9;&#x6570;&#x7EC6;&#x83CC;&#x5FEB; 10 &#x500D;&#x3002;

&#x7EC6;&#x83CC;&#x6B67;&#x89C6;&#x5927;&#x89C4;&#x6A21;&#x6D41;&#x5F0F;&#x7EC6;&#x80DE;&#x5206;&#x6790;&#x65B9;&#x6CD5;&#x7684;&#x53D1;&#x5C55;&#x3002;

Fluorescent flow cytometry has become the method of choice for interrogation of bacterial populations at the single-cell level. However, limitations of this technique include issues of dynamic range, spectral overlap, photobleaching, and overall low signal intensity due to the small size of bacteria. The recent development of mass cytometry allows single-cell analysis with the resolution of inductively coupled plasma mass spectrometry, facilitating multiparametric analysis. Using a combination of a metal-based membrane stain and lectins conjugated to lanthanide-chelating polymers, we demonstrate that individual Escherichia coli cells can be differentiated based on their cell surface polysaccharides using mass cytometry. The model E. coli system involves evaluation of three different surface polysaccharides using element-tagged concanavalin A and wheat germ agglutinin lectins. Finally, this technique enabled experiments designed to follow the export of O-antigen substituted lipopolysaccharide in a conditional mutant. These studies revealed that the culture responds as a uniform population and that lipopolysaccharide export is approximately 10 times faster than the logarithmic bacterial doubling time.

Development of mass cytometry methods for bacterial discrimination.

Cytom&eacute;trie en flux fluorescent est devenu la m&eacute;thode de choix pour l&#39;interrogation des populations bact&eacute;riennes au niveau de la cellule unique. Cependant, les limites de cette technique incluent les questions de plage dynamique, chevauchement spectrale, photobleaching et intensit&eacute; de signal faible en raison de la petite taille des bact&eacute;ries. Le d&eacute;veloppement r&eacute;cent de la cytom&eacute;trie en flux massique permet l&#39;analyse de la cellule unique avec la r&eacute;solution de la spectrom&eacute;trie de masse &agrave; plasma inductif, facilitant l&#39;analyse multiparam&eacute;trique. En utilisant une combinaison d&#39;une tache de la membrane &agrave; base de m&eacute;tal et de lectines conjugu&eacute; aux ch&eacute;lateurs de lanthanide polym&egrave;res, nous d&eacute;montrons que les cellules individuelles d&#39;Escherichia coli peuvent &ecirc;tre diff&eacute;renci&eacute;s selon leurs polysaccharides de surface cellulaire &agrave; l&#39;aide de cytom&eacute;trie en masse. Le syst&egrave;me d&#39;e. coli de mod&egrave;le implique l&#39;&eacute;valuation de trois diff&eacute;rents polysaccharides de surfaces &agrave; l&#39;aide d&#39;&eacute;l&eacute;ment-le tag concanavaline A et lectines agglutinine du germe de bl&eacute;. Enfin, cette exp&eacute;riences technique activ&eacute;e con&ccedil;u pour suivre l&#39;exportation de l&#39;antig&egrave;ne O substitu&eacute;s lipopolysaccharides chez un mutant conditionnels. Ces &eacute;tudes ont r&eacute;v&eacute;l&eacute; que la culture r&eacute;agit comme une population homog&egrave;ne et que l&#39;exportation du lipopolysaccharide est environ 10 fois plus rapide que les bact&eacute;ries logarithmique temps de doublement.

D&eacute;veloppement de m&eacute;thodes de cytom&eacute;trie de flux massique pour discrimination bact&eacute;rienne.

&#xD615;&#xAD11; cytometry &#xC138;&#xADE0;&#xC131; &#xC778;&#xAD6C; &#xB2E8;&#xC77C; &#xC138;&#xD3EC; &#xC218;&#xC900;&#xC5D0;&#xC11C;&#xC758; &#xC2EC;&#xBB38;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC120;&#xD0DD;&#xC758; &#xBC29;&#xBC95;&#xC774; &#xB418;&#xC5C8;&#xB2E4;. &#xADF8;&#xB7EC;&#xB098;,&#xC774; &#xAE30;&#xC220;&#xC758; &#xD55C;&#xACC4; &#xB3D9;&#xC801; &#xBC94;&#xC704;, &#xC2A4;&#xD399;&#xD2B8;&#xB7FC; &#xC911;&#xCCA9;, photobleaching, &#xBC15;&#xD14C;&#xB9AC;&#xC544;&#xC758; &#xC791;&#xC740; &#xD06C;&#xAE30; &#xB54C;&#xBB38;&#xC5D0; &#xC804;&#xBC18;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xB0AE;&#xC740; &#xC2E0;&#xD638; &#xAC15;&#xB3C4; &#xBB38;&#xC81C; &#xD3EC;&#xD568;. &#xB300;&#xB7C9; cytometry&#xC758; &#xCD5C;&#xADFC; &#xAC1C;&#xBC1C; multiparametric &#xBD84;&#xC11D;&#xC744; &#xCD09;&#xC9C4; &#xD558;&#xB294; &#xC720;&#xB3C4; &#xACB0;&#xD569;&#xB41C; &#xD50C;&#xB77C;&#xC988;&#xB9C8; &#xC9C8;&#xB7C9; &#xBD84;&#xC11D;&#xC758; &#xD574;&#xC0C1;&#xB3C4; &#xAC00;&#xC9C4; &#xB2E8;&#xC77C; &#xC138;&#xD3EC; &#xBD84;&#xC11D;&#xC744; &#xD5C8;&#xC6A9; &#xD55C;&#xB2E4;. &#xB780;&#xD0C0;&#xB118;&#xC871; &#xD0AC;&#xB808;&#xC774;&#xD2B8; &#xD654; &#xACE0;&#xBD84;&#xC790;&#xB97C; &#xD65C;&#xC6A9; &#xAE08;&#xC18D; &#xAE30;&#xBC18; &#xB9C9; &#xC5BC;&#xB8E9; &#xBC0F; lectins &#xACB0;&#xD569; &#xD558; &#xC5EC;, &#xB2E4; &#xB2F9; &#xADF8;&#xB4E4;&#xC758; &#xC138;&#xD3EC; &#xD45C;&#xBA74; &#xB958; &#xB300;&#xB7C9; cytometry &#xC0AC;&#xC6A9;&#xC5D0; &#xB530;&#xB77C; &#xAC1C;&#xBCC4; &#xBCD1;&#xC6D0; &#xC131; &#xB300;&#xC7A5;&#xADE0; &#xC138;&#xD3EC;&#xB97C; &#xCC28;&#xBCC4;&#xD654; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4; &#xBCF4;&#xC5EC; &#xC90D;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xBAA8;&#xB378; &#xB300;&#xC7A5;&#xADE0; &#xC2DC;&#xC2A4;&#xD15C; &#xB2E4; &#xB2F9; 3 &#xAC1C;&#xC758; &#xB2E4;&#xB978; &#xD45C;&#xBA74; &#xB958; &#xC694;&#xC18C; &#xD0DC;&#xADF8; concanavalin A&#xC640; &#xBC00; &#xC138;&#xADE0; agglutinin lectins&#xB97C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xD3C9;&#xAC00; &#xD574;&#xC57C; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xB9C8;&#xC9C0;&#xB9C9;&#xC73C;&#xB85C;, O-&#xD56D; &#xC6D0;&#xC5D0;&#xC758; &#xC218;&#xCD9C;&#xC5D0; &#xB530;&#xB77C; &#xC124;&#xACC4; &#xB41C;&#xC774; &#xAE30;&#xC220;&#xC740; &#xD65C;&#xC131;&#xD654; &#xC2E4;&#xD5D8; lipopolysaccharide &#xC870;&#xAC74;&#xBD80; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774;&#xC5D0; &#xB300;&#xCCB4;. &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xC5F0;&#xAD6C; &#xACF5;&#xAC1C; &#xBB38;&#xD654; &#xC77C;&#xC815; &#xD55C; &#xC778;&#xAD6C;&#xB85C; &#xC11C; &#xC751;&#xB2F5; &#xADF8;&#xB9AC;&#xACE0; lipopolysaccharide &#xC218;&#xCD9C; &#xBC30;&#xB85C; &#xC2DC;&#xAC04; &#xB85C;&#xADF8; &#xC138;&#xADE0; &#xBCF4;&#xB2E4; &#xC57D; 10 &#xBC30; &#xBE60;&#xB978;.

&#xC138;&#xADE0;&#xC131; &#xCC28;&#xBCC4;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xB300;&#xB7C9; cytometry &#xBC29;&#xBC95;&#xC758; &#xAC1C;&#xBC1C;&#xC785;&#xB2C8;&#xB2E4;.

Citometr&iacute;a de flujo fluorescente se ha convertido en el m&eacute;todo de elecci&oacute;n para el interrogatorio de poblaciones bacterianas a nivel unicelular. Sin embargo, las limitaciones de esta t&eacute;cnica incluyen temas de rango din&aacute;mico, superposici&oacute;n espectral, photobleaching y la intensidad de la se&ntilde;al baja debido al peque&ntilde;o tama&ntilde;o de las bacterias. El desarrollo reciente de citometr&iacute;a de masas permite an&aacute;lisis unicelulares con la resoluci&oacute;n de espectrometr&iacute;a de masas de plasma acoplado inductivamente, facilitar an&aacute;lisis multiparam&eacute;trico. Usando una combinaci&oacute;n de una mancha de membrana base de metal y lectinas conjugado con quelantes del lant&aacute;nido pol&iacute;meros, demostramos que las c&eacute;lulas individuales Escherichia coli pueden ser distinguidas en base a sus polisac&aacute;ridos de superficie celular mediante citometr&iacute;a de masas. El sistema de e. coli modelo implica la evaluaci&oacute;n de tres diferentes polisac&aacute;ridos superficiales mediante etiquetado como elemento Concanavalina A y lectinas de aglutinina de germen de trigo. Finalmente, este experimentos t&eacute;cnica permiti&oacute; dise&ntilde;ado para seguir la exportaci&oacute;n de ant&iacute;geno O sustituci&oacute;n lipopolisac&aacute;ridos en un mutante condicional. Estos estudios revelaron que la cultura responde como una poblaci&oacute;n uniforme y que la exportaci&oacute;n de lipopolisac&aacute;rido es aproximadamente 10 veces m&aacute;s r&aacute;pida que el logar&iacute;tmico bacteriano tiempo de duplicaci&oacute;n.

Michael D. Leipold

Human Immune Monitoring Center,
Institute for Immunity,
Transplantation,
and Infection,
Human Immune Monitoring Center, Institute for Immunity, Transplantation, and Infection

Stanford University

Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer

Michael D. Leipold

.css-o250i3{font-size:18px;font-family:Open Sans,sans-serif;line-height:21.6px;}Human Immune Monitoring Center,Institute for Immunity,Transplantation,and Infection,Human Immune Monitoring Center, Institute for Immunity, Transplantation, and Infection

Stanford University

Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer

Human Immune Monitoring Center,
Institute for Immunity,
Transplantation,
and Infection,
Human Immune Monitoring Center, Institute for Immunity, Transplantation, and Infection