Protocolo mejorado para microdisección láser de islotes pancreáticos humanos a partir de muestras quirúrgicas

Resumen

Microdisección por láser es una técnica que permite la recuperación de células seleccionados a partir de cantidades mínimas de parénquima. Aquí se describe un protocolo para la obtención islotes pancreáticos humanos a partir de especímenes quirúrgicos para su uso para transcriptomic estudios. Nuestro protocolo mejora la autofluorescencia intrínseca de las células beta humanas, lo que facilita su recogida.

Resumen

Microdisección por láser (LMD) es una técnica que permite la recuperación de células y tejidos seleccionados de pequeñas cantidades de parénquima ^1,2. Las células disecadas se puede utilizar para una variedad de investigaciones, tales como transcriptomic estudios o proteómica o análisis de evaluación de ADN cromosómico de ^2,3. Una aplicación especialmente difícil de LMD es el análisis de transcriptoma, que, debido a la labilidad del ARN ^4, puede ser particularmente importante cuando las células se disecan a partir de tejidos que son ricos de RNasas, tales como el páncreas. Un protocolo de microdisección que permite una rápida identificación y colección de las células diana es esencial en este contexto con el fin de acortar el tiempo de la manipulación de tejidos y, en consecuencia, para garantizar la conservación de ARN.

Aquí se describe un protocolo para la obtención humanos las células beta pancreáticas a partir de especímenes quirúrgicos para su uso para los estudios de transcriptomic ^5. Pequeños trozos de páncreas de aproximadamente 0.5-1 c³ m se cortaron de los márgenes sanos que aparecen de páncreas especímenes resecados, embebidos en Tissue-Tek compuesto OCT, se congeló inmediatamente en 2-metilbutano enfriado, y se almacenó a -80 ° C hasta el corte. Cuarenta secciones en serie de 10 m de espesor se cortaron en un criostato en virtud de un ajuste de -20 ° C, se transfirieron individualmente a portaobjetos de vidrio, se seca el interior del criostato durante 1-2 min, y se almacenaron a -80 ° C.

Inmediatamente antes de que el procedimiento de microdisección por láser, las secciones fueron fijadas en hielo frío, recién preparada 70% de etanol durante 30 segundos, se lavó por 5-6 inmersiones en hielo frío agua tratada con DEPC, y se deshidrató por dos incubaciones de un minuto en hielo frío 100% etanol seguido de xileno (que se utiliza para la deshidratación de los tejidos) durante 4 min; secciones de tejido fueron entonces secados al aire después de 3-5 min. Es importante destacar que todas las etapas, excepto la incubación en xileno, se realizaron con reactivos de agua helada - una modificación más de un protocolo descrito previamente ^6. Utahilization de reactivos de hielo frío resultó en un aumento pronunciado de la autofluorescencia intrínseca de las células beta, y facilitar su reconocimiento. Para la microdisección, cuatro secciones se deshidrataron cada vez: dos fueron colocados en un tubo de ml envueltas en papel aluminio 50, para proteger el tejido de la humedad y el blanqueo; los dos restantes se microdissected inmediatamente. Este procedimiento se realizó con un PALM MicroBeam instrumento (Zeiss) que utiliza el láser de presión automático Catapulting (AutoLPC) de modo. La finalización de las células beta / islotes disección a partir de cuatro secciones criogénicas requeridos no más de 40-60 min. Las células se recogen en una AdhesiveCap y se lisaron con 10 l de tampón de lisis. Cada espécimen único ARN para el análisis transcriptomic se obtuvo mediante la combinación de 10 muestras de células microdisecadas, seguido de extracción de ARN usando el Pico Pure RNA Isolation Kit (Arcturus). Este protocolo mejora la autofluorescencia intrínseca de las células beta humanas, lo que facilita su reconocimiento rápido y preciso y collection. Nuevas mejoras en este procedimiento podría permitir la disección de las células beta fenotípicamente diferentes, con posibles consecuencias para la mejor comprensión de los cambios asociados con la diabetes tipo 2.

Protocolo

1. La congelación de tejido pancreático humano

1. Quitar el tejido adiposo, vasos sanguíneos, nervios y tejido no parenquimatoso con un bisturí y pinzas, y cortar el tejido pancreático en trozos (cubos ~ 0.5-1 cm).
2. Colocar una pieza de tejido pancreático en el centro de un criomolde, y se cubre completamente con frío Tissue-Tek Compuesto octubre Ponga el criomolde en un frasco cuya parte inferior está cubierta con pre-enfriado 2-metilbutano y complemento de congelación en nitrógeno líquido. La tienda de la muestra congelada a -80 ° C.

2. Preparación de secciones congeladas

1. Use guantes durante todas las medidas necesarias para evitar la desnaturalización del ARN.
2. Limpie el cuchillo criostato, portamuestras y el pincel con etanol frío al 100% y RNasa Away. Coloque el tejido congelado dentro del criostato.
3. Espere hasta que el tejido, un cuchillo y un cepillo llegar a -20 º C. Etiquetar el SuperFrost Plus diapositivas y preenfriar ellos dentro de la cámara del criostato a la esperapara el tejido para llegar a -20 ° C.
4. Aplique el compuesto Tissue-Tek PTU en el soporte de la muestra y coloque el tejido congelado en la parte superior.
5. Una vez que el compuesto Tissue-Tek OCT se congelaron recortar el cryoblock y eliminar cualquier exceso de compuesto Tissue-Tek OCT con una hoja de afeitar.
6. Cortar un total de 40 consecutivos 10 rebanadas mu m del bloque de tejido pancreático. Adicionalmente se recomienda cortar una rebanada primer y segundo para ser salvo para los dibujos de vista general de la sección del páncreas que puede facilitar la identificación de islotes dentro de los cortes durante el proceso de microdisección.
7. Transferir las secciones de la hoja del cuchillo en el centro de un SuperFrost Plus presentación al tocar la parte trasera de la corredera con el dedo (cubierta con un guante) para calentar sólo la región a la que la sección se adhieren.
8. Seque el min secciones 1-2 dentro del criostato a -20 ° C, después de lo cual los pone en una caja de portaobjetos se colocaron en hielo seco. Almacene las seccionesa -80 º C.
9. Si es necesario, limpie la hoja del cuchillo con toallas de papel y etanol frío al 100%.

3. Deshidratación de las secciones congeladas

1. Preparar los reactivos: verter 30 ml de etanol recién preparada 70%, 30 ml de agua tratada con DEPC, 2x30 ml de etanol 100% y 30 ml de xileno en 50 ml tubos Cellstar (Falcons), frío y mantener todos los reactivos (excepto xileno) en hielo.
2. Limpie el área de trabajo bajo el capó con 100% de etanol y RNaseZAP.
3. Proceso de dos secciones criogénicas como sigue: fijar en hielo etanol frío al 70% durante 30 s, se lava con 5-6 inmersiones rápidas en hielo frío agua tratada con DEPC, se deshidrata dos veces durante 1 min en hielo frío etanol 100%, incubar durante 4 min en xileno a temperatura ambiente (25 ° C) y secar al aire durante 3-5 min. Repita este paso con otro par de secciones criogénicas.
4. Insertar dos secciones criogénicas secas espalda con espalda en un tubo de 50 ml Cellstar envuelto con papel de aluminio para protegerlo de la luz y la humedad.

4. Microdisección láser de las células beta con PALM MicroBeam, Zeiss

1. Limpie el microscopio con RNaseZAP y montar la tapa adhesiva en la RoboMover.
2. Establezca los siguientes ajustes: conjunto de filtros 09 (excitación: 450-490 nm, emisión> 515 nm), el modo AutoLPC, el 50% de la energía láser, el 65% de enfoque láser, 100% de velocidad láser, 5 m distancia entre disparos AutoLPC, 6 m distancia a la línea, altura de trabajo: -10.100.
3. Inserte una diapositiva en el escenario.
4. Localizar las células beta autofluorescentes bajo visualización microscópica (5x o 10x).
5. Cambie a la lente de 40x, seleccionar las células beta con la herramienta de selección "Mano alzada" y microdissect utilizando el láser.
6. Capturar el tejido de cuatro secciones criogénicas deshidratados en una AdhesiveCap.
   Comentario 1: el tiempo necesario para analizar las células beta de un criosección deshidratada no deberá ser superior a 10-20 minutos para evitar la rehidratación de las secciones de tejido que daría lugar aLa degradación del ARN.
   Comentario 2: verificar exitoso proceso de microdisección mediante inspección visual después de mover el escenario para el punto de control.

5. La lisis de las células del tejido microdissected Beta enriquecido

1. Retire el AdhesiveCap del RoboMover.
2. Pipetear 10 l de tampón de extracción (XB, PicoPure RNA Isolation Kit, Arcturus) en la tapa de la AdhesiveCap e incubar en posición invertida a 42 ° C durante 30 min.
3. Centrifugue a 10.000 xg y poner el lisado en hielo seco. Almacénelo a -80 ° C hasta la extracción de ARN se lleva a cabo.
4. Repita los pasos 3.) A 5.) Con todas las otras secciones.

6. La extracción de RNA

1. Combine los diez lisados ​​10 mu l
2. Proceder con el aislamiento de ARN, trabajando a temperatura ambiente de acuerdo con el protocolo de la PicoPure RNA Isolation Kit, Arcturus, usando una proporción de 1:1 tampón de extracción (XB) a 70% de etanol (incluyendo tratamiento con DNasa).

7. Análisis de ARN

1. Utilice un ARN l durante el análisis de la calidad y cantidad por medio de un Agilent 2100 Bioanalyser (PicoChip). La evaluación cuantitativa se realiza en referencia a un RNA estándar cargados en paralelo en el chip.

Resultados

Como se muestra en la Figura 1, el protocolo modificado de deshidratación conduce a una mejora de la autofluorescencia células beta en comparación con el anterior protocolo publicado ^6. Aplicando el protocolo descrito, cada una de 39 muestras pancreáticas quirúrgicas se utilizó para generar 40 criosecciones en serie para un promedio de ³ micras 31'544'704 tejido / muestra de páncreas (rango: 8'742'390 - 81'522'153 m ³⁾ como se muestra en la...

Discusión

Se describe un método fiable para la microdisección láser (LMD) de los islotes de páncreas espécimen quirúrgico. Siempre que un microscopio LMD está disponible, este procedimiento podría aplicarse a cualquier institución de investigación la realización de pancreatectomías parciales, lo que aumenta el acceso a material de islotes humanos de ambos no diabéticos y diabéticos de tipo 2. Esto es especialmente relevante dada la escasez de páncreas ofrecido para el aislamiento de los islotes. Aspectos favorables...

Materiales

Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
2-metilbutano (isopentano)	ROTH	3927.1
AdhesiveCap (opaco, 500 l)	ZEISS	415190-9201-000
Cellstar Tubos (50 ml)	Greiner Bio-One	210 261	falda con apoyo
Cellstar Tubos (50 ml)	Greiner Bio-One	227,261
Pirocarbonato de dietilo (DEPC)	SIGMA	D 5758
El hielo seco
Etanol absoluto	VWR	20821.310
Nitrógeno líquido
Pincel
PALM MicroBeam	ZEISS
Peel-a-Way incrustación de moldes (truncado), 12 x 12 mm	ProSciTech	RR12	Top interna 22x22 mm, profundidad 21 mm
Arcturus PicoPure Frozen RNA Isolation Kit	Applied Biosystems	KIT 0204
Abrazadera de plástico
Maquinilla de afeitar
RNasa libre de DNasa Set	Qiagen	79254
RNaseZAP	SIGMA	R 2020
Scalpel /cuchilla quirúrgica	Techno Corte	2800111
Superfrost Plus diapositivas adhesión microscopio	Thermo Scientific	J1800AMNZ	25x75x1.0 mm
Tissue-Tek octubre Compuesto	Sakura	4583 o 0807000022
Pinzas	BRAUN	BD168R
Xileno	VWR	28975.291