Rescate del virus de la enfermedad de Newcastle recombinante a partir de cDNA

Resumen

Virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) se ha estudiado ampliamente en los últimos años con el fin de desarrollar nuevos vectores para la vacunación y la terapia, entre otros. Estos estudios han sido posible debido a las técnicas para rescatar virus recombinante a partir de cDNA, tales como las que se describen aquí.

Resumen

Virus de la enfermedad de Newcastle (NDV), el miembro prototipo del género Avulavirus de la familia Paramyxoviridae ^1, es una, de sentido negativo no segmentado, de cadena única, envuelto ARN del virus (Figura 1) con aplicaciones potenciales como un vector para la vacunación y tratamiento de enfermedades humanas. Exploración en profundidad de estas aplicaciones sólo ha sido posible después de que el establecimiento de técnicas de genética inversa para rescatar a los virus recombinantes a partir de plásmidos que codifican sus genomas completos como cDNA ^2-5. ADNc viral puede ser convenientemente modificado in vitro mediante el uso de procedimientos de clonación estándar para alterar el genotipo del virus y / o para incluir nuevas unidades de transcripción. Rescate de estos virus modificados genéticamente proporciona una valiosa herramienta para entender los factores que afectan a múltiples etapas de la infección, así como permite el desarrollo y la mejora de los vectores para la expresión y entrega de antígenospara la vacunación y la terapia. Aquí se describe un protocolo para el rescate de NDVs recombinantes.

Introducción

Virus de la enfermedad de Newcastle (NDV), un paramixovirus aviar perteneciente al género Avulavirus ^1, es un agente zoonótica económicamente relevante y por lo tanto ampliamente investigado y vigilado, que pueden afectar gravemente a la cría de aves en todo el mundo. Aunque no es un patógeno humano, NDV también se ha estudiado a fondo más allá del campo veterinario tanto como un modelo de paramixovirus y debido a sus propiedades altamente interesantes oncolíticos naturales, ^6. Investigación sobre el NDV se benefició en gran medida del desarrollo de técnicas de genética inversa para los virus de una sola cadena, no segmentados de sentido negativo de ARN, descrito por primera vez por el virus de la rabia por Conzelmann y coleagues ^2. Una variedad de NDVs modificados genéticamente con genes extraños o modificaciones de su tipo salvaje genoma se ha estudiado ampliamente desde entonces. Trabajar con estos virus recombinantes ha sido fundamental para caracterizar los diferentes factores de virulencia no sólo de NDV, sino también de otros huma relevanten patógenos, tales como virus de influenza A ⁷ - o la emergente Nipah virus ^8. Además, un número de diferentes estudios han explorado el uso de estas técnicas para mejorar la actividad antitumoral innata de NDV ^6,9,10, sobre todo mediante la mejora de las propiedades inmunoestimulantes del virus. Otro ámbito de investigación en NDVs recombinantes ha sido la generación de candidatos a vacunas contra otras enfermedades virales como la gripe ^{5,11,12, 13} VIH, sarampión ^{14, 15} SARS o la causada por el virus respiratorio sincytial (VRS) ^16. Entre las diversas ventajas notables prestados por NDV son la falta de inmunidad preexistente en la población humana, la estabilidad de los insertos extranjeros genéticos, la falta de actividad recombinatorios y en general un alto perfil de seguridad combinado con las propiedades inmunoestimulantes naturales antes mencionados ^17. También es digno de mención el uso potencial de las vacunas bivalentes recombinantes en poultry, la influenza aviar de protección tanto contra el NDV y altamente patógeno virus de ^11,12. Esto puede ser una excelente manera de reducir las posibilidades de que este último se diseminan desde silvestre a los animales domésticos, por lo que también ayuda a prevenir un posible salto inter-específica de la temida gripe aviar a los humanos. Por último, el reportero-expresando NDV se han utilizado para la evaluación de la respuesta inmune innata, así como la identificación de antagonista de interferón codificada por múltiples virus ^18-27.

El proceso de rescate de un recombinante, no segmentado, virus de ARN de cadena negativa consiste básicamente en forzar artificialmente un ciclo de replicación viral en una célula que produce mediante la transfección de ADNc que codifican la maquinaria molecular infecciosa mínima, conocida como ribonucleoproteína o RNP (Figura 2). Los RNPs consisten de la polimerasa viral (P y proteínas L), la nucleoproteína (NP) y de la longitud completa de ARN antigenómico del virus. Este ARN + antigenoma es the plantilla requerida para la generación de los genomas de ARN-complementarios, los cuales, también asociados con el resto de las proteínas de la RNP viral, recapitula el mismo complejo infecciosa que un virus natural sería liberar en el citoplasma de la célula después de la infección (Figura 2A ). A partir de este paso adelante, el ciclo viral puede proceder de forma natural y viriones recombinantes, encapsidadoras los genomas modificados, será generado (Figura 2B). Sorprendentemente, la transfección del ADNc genómico en lugar del cDNA antigenómico perjudica en gran medida o completamente suprime la eficiencia de rescate ^2,28-30. Incluso cuando se transfectó ADNc antigenómico, la eficiencia de la encapsidación del ARN recombinante en RNPs en células transfectadas es probablemente muy baja. Debido a esto, los protocolos de rescate para NDV a menudo incluyen diferentes pasos para la amplificación de las pocas partículas virales liberadas por las células transfectadas originalmente por cocultivo con células permisivas y / o por elinfección de huevos embrionados.

Antes de rescate, el ADNc se puede manipular por procedimientos de clonación estándar con el fin de generar las modificaciones deseadas. Mientras que las mutaciones específicas de los diferentes productos de los genes y las secuencias reguladoras del virus se pueden lograr sin rodeos esta manera, muchos de los trabajos publicados que involucran NDV recombinante ha requerido la adición de una nueva unidad de transcripción en el genoma de NDV. Al igual que otros miembros de la familia de los paramixovirus, el genoma de NDV codifica ocho proteínas diferentes en seis unidades de transcripción, que se expresan diferencialmente dependiendo de su ubicación respecto al extremo 3 'en un gradiente decreciente crítico para el ciclo de vida viral ^1. Debido a esto, la ubicación de la nueva unidad de transcripción dentro del genoma debe ser cuidadosamente seleccionado para lograr un equilibrio entre la expresión del transgén y el deterioro de la replicación viral. De inserción entre los genes P y M se ha utilizado la mayor parte, tHough otros sitios también se han probado ^13,31.

Cualquiera que sea la pieza de inserción, la clonación en ADNc de NDV tiene que seguir algunas reglas para generar un constructo rescatable: (i) cualquier nuevo gen que se incluirán en el genoma de NDV tiene que estar bajo control de las señales apropiadas para la viral dependiente de ARN-ARN polimerasa. Estas secuencias deben ser añadidos aguas arriba del nuevo marco de lectura abierto (ORF) de modo que la polimerasa puede reconocer el final del gen anterior (GE) y el comienzo de la nueva transgén (GS), separados por una sola secuencia de nucleótidos intergénica (IG) . También se recomienda la adición de un Kozak válida (K) de secuencia para mejorar la traducción eucariótica ribosómico para una mejor expresión de la proteína extranjera ^32; (ii) la replicación eficiente de NDV, como para la mayoría de los miembros de la familia Paramyxoviridae, es dependiente de la longitud del genoma de ser múltiplo de seis ^{de 33,} por lo tanto, cualquier inserción en el NDV tiene que seguir esta "regla de los seis". Si es necesario, se reqnucleótidos adicionales pedirá otra se pueden añadir aguas abajo de la ORF de nuevo, y (iii) la secuencia de transgén deben ser evaluados para encontrar posibles GE y GS como secuencias que puedan perjudicar la eficiencia del rescate, la expresión del transgen y / o la viabilidad del virus. Si está presente, estas secuencias deben ser removidos mediante mutagénesis silenciosa. La generación de ADNc de longitud completa recombinante siguiendo las reglas anteriormente mencionadas es la primera etapa con el fin de producir eficientemente un NDV genéticamente modificado como se detalla aquí.

En el sistema de todas las construcciones de ADN se encuentran bajo el control del promotor de T7 ARN polimerasa (Figura 3). Esta polimerasa citoplásmica se proporciona en trans por la coinfección con un vaccinia modificado Ankara del virus recombinante (MVA-T7) ^34. Figura 3A muestra el plásmido pNDV-B1, que codifica el ADNc de longitud completa antigenómico ^5. Figura 3B muestra los plásmidos pTM1 que codifica NP, ORFs P y L. Los plásmidos pCITE-GFP, que codifica, uajo el promotor T7, la proteína verde fluorescente (GFP), y pCAGGS GFP ^18, que codifica la misma ORF bajo el promotor de beta-actina de pollo ^35, se utilizan como controles. En este protocolo se muestra el procedimiento para rescatar NDV recombinante a partir del ADNc de la cepa lentogénica de NDV Hitchner B1 ⁵ (Figura 4).

Protocolo

1. Preparación de células de mamíferos (Figura 4A, Día 1)

Dividir HEp-2 o células A549 el día antes de la transfección en placas de 6 pocillos. Densidad de las células debe alcanzar el 80-90% de confluencia el día siguiente. Por lo general, un confluente 100 mm plato se puede dividir en 8 pozos (alrededor de 1 x 10 ⁶ células por pocillo). Para cada virus para ser rescatado, 2-4 pozos diferentes deben incluirse, además de 2 pozos adicionales para los controles pCAGGS-GFP y GFP-pCITE ^18, con el objetivo de monitorear la transfección y MVA-T7 eficiencia de infección, respectivamente.

2. La infección de células de mamífero con el recombinante modificado del virus vaccinia Ankara Expresando el bacteriófago T7 RNA polimerasa (MVA-T7) (Figura 4A, Día 2)

1. Calentar PBS 1x/BA/PS y medios a 37 ° C.
2. Lavar las células dos veces con 1 ml de PBS 1x/BA/PS.
3. Infectar las células de mamífero en cultivo con el virus MVA-T7 a una multiplicidad de infección (moi) De 1 ufp / célula en un volumen final de 200 l en PBS / BA / PS durante 1 hora a temperatura ambiente.
4. Durante la incubación infección viral, preparar la mezcla de transfección como se describe en 3.

3. La transfección de células de mamíferos (Figura 4A, Día 2)

1. Preparación de Lipofectamine: Mezclar 1-2 g de LPF2000 con 250 l de OptiMEM por intento de rescate e incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente.
2. Preparación de ADN: Hacer un cóctel para cada plásmido de rescate en 50 l de OptiMEM. Añadir 0,4 g de pTM1-NP, 0,2 g de pTM1-P, y 0,2 g de pTM1-L por tubo. Añadir 1 g de los de larga duración cDNA clon de NDV que ser rescatados a cada tubo. También hay que preparar dos transfecciones de control, uno con 2 g de pCAGGS-GFP (para comprobar la eficacia de transfección) y el otro con 2 g de pCITE-GFP (para verificar la polimerasa T7 impulsada expresión por la MVA-T7).
3. Después de la solución LPF2000-OptiMEM ha preincubaron durante 5 min (paso 3.1), añadir 250l de la solución a los tubos de ADN (paso 3,2) y se incuba durante 20-30 minutos a temperatura ambiente.
4. Después de la incubación con MVA-T7, retire el inóculo de virus por aspiración y reemplazarla con la mezcla de transfección de ADN LPF2000 (paso 3.3).
5. Añadir 1 ml de DMEM 10% FBS / PS para cada plato.
6. Se incuban las células infectadas / transfectadas para 6-8 horas (o durante la noche) a 37 ° C, 5% de CO ₂ y luego reemplazar el medio de transfección con 1,5 ml de DMEM fresco 10% de SFB / PS.
7. A las 24 h después de la transfección, los pocillos de control se pueden observar bajo un microscopio de fluorescencia para evaluar la eficacia de transfección (pCAGGS-GFP) y la actividad de la polimerasa de T7 (pCITE-GFP) (Figura 5A). Continúe con el co-cultivo de las células infectadas / transfectadas con fibroblastos aviar descritas a continuación.

4. Co-cultivo de células de mamífero con células de aves (Figura 4A, Día 3)

Por lo general, una confluencia de 100 mm de cultivo de tejidos plato de pollo (CEF) or pato (DEFs) fibroblastos de embrión se utiliza por dos pozos transfectadas. Asegúrese de preparar, con antelación, suficientes 100 mm placas de cultivo tisular de células de aves por todos los intentos de rescate. Para el rescate eficiente del virus, medio DMEM 10% de FBS / PS se complementa con 5% de fluido alantoideo y 30 mM de MgCl _2. En este punto, 24 horas pi, células de mamífero pueden empezar a mostrar el efecto citopático (CPE) debido a la infección de MVA-T7, asevident en la Figura 5A.

1. Calentar 1x PBS y medios de comunicación a 37 ° C.
2. Lavar las células de mamíferos, 2x, con 1 ml de PBS 1x.
3. Tripsinizar las células de mamífero con 0,2 ml de EDTA-tripsina hasta que se desprendieron. Resuspender las células en 1 ml de DMEM 10% de FBS / PS, 5% de fluido alantoideo, 30 mM de MgCl ₂ y la transferencia a un 100 mm de placa de cultivo de tejido. Añadir 3 ml de los mismos medios de comunicación.
4. Lavar las células aviares, dos veces, con 4 ml de PBS 1x.
5. Trypsinize células aviares con 1 ml de EDTA-tripsina y se incuba durante 1-2 min a 37 ° C hasta que las células se separan. ª Resuspendercélulas e la adición de 8 ml de DMEM 10% de FBS / PS, 5% de fluido alantoideo, 30 mM de MgCl ₂ y añadir 4 ml de las células tratadas con tripsina a las células de mamíferos en la co-cultivadas 100 mm de placa de cultivo de tejido para un volumen total de 8 (4 ml de mamíferos, 4 ml células de aves) ml.
6. Agitar suavemente a mano las células co-cultivadas en la placa de 100 mm con el fin de tener una distribución uniforme y luego colocar en la incubadora a 37 ° C durante 3-4 días. Los criterios para infectar los huevos de 3 o 4 días después de la co-cultivo de células de mamíferos y aves depende de la cantidad de efecto citopático (redondeo celular, la muerte, el desprendimiento de la superficie, etc.) Se observa en la infección viral MVA-T7.

5. La infección de los huevos embrionados de pollo (Figura 4A, días 6-7)

1. Después de 3-4 días de co-cultivo de células de mamíferos y aves, extraiga 1 ml del sobrenadante de cultivo de tejidos y agregar a un tubo Eppendorf.
2. Centrifugar el sobrenadante de cultivo de tejidos durante 1 min a 12.000 rpm en un bancocentrífuga para eliminar restos celulares.
3. Candle los huevos usando una caja de mirar al trasluz la luz para ver la interfaz entre el saco de aire y la cavidad alantoideo. Haga una marca en la frontera evitando interfaz de localización de los vasos sanguíneos. Pulverizar etanol al 70% sobre los huevos para establecer condiciones estériles. Hacer suavemente un agujero en la cáscara del huevo en el lugar marcado y inocular 500 l del sobrenadante usando una insulina (1 ml) de la jeringa, la aguja apuntando verticalmente y directamente en la cavidad alantoidea. (Figura 4B).
4. Sellar el corte en la cáscara de huevo con cera derretida o parafina.
5. Incubar los huevos durante 2-3 días a 37 ° C.

6. Cosecha de fluido alantoideo de huevos embrionados de pollo infectados (Figura 4A, días 8-10)

1. Incubar los huevos infectados durante 2 a 4 horas o durante la noche a 4 ° C con el fin de matar al embrión de pollo y coagular la sangre.
2. Pulverizar los huevos con etanol al 70% (para mantener las condiciones estériles).
3. Cuidadosamente la sección apical del huevo, sobre la cavidad de aire, con una cuchara. Una vez que la cáscara está agrietada, retire los fragmentos con unas pinzas y totalmente exponer la membrana alantoidea.
4. Exponer la cavidad alantoidea mediante la escisión de la membrana alantoideo con pinzas y tijeras, evitando daños a los vasos sanguíneos y la yema.
5. Con cuidado, empujar hacia abajo el embrión con una espátula y se recoge el fluido alantoideo que fluye hacia arriba (8-12 ml por huevo) con una pipeta de 10 ml. Evitar daños en la membrana de la yema. Transferir el fluido alantoideo a un tubo de centrífuga de 15 ml en hielo (utilizar un tubo por huevo).
6. Aclarar el fluido alantoideo mediante centrifugación durante 5 min a 1500 rpm. Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo y sin perturbar el sedimento.
7. Muestras a 4 ° C durante un máximo de 1 semana, hasta comprobar que la presencia de NDV por ensayo de hemaglutinación.

7. Hemaglutinación (HA) Ensayo

La presencia de virus en el allantfluido oico a partir de huevos infectados se puede determinar macroscópicamente por su capacidad para hemoaglutinar pavo glóbulos rojos (RBC). En el caso de la enfermedad de Newcastle, de aproximadamente 10 ⁶ unidades formadoras de placa (ufp) por ml son necesarios para dar una señal positiva en el ensayo de HA. Ensayos de HA se llevan a cabo en placas de 96 pocillos de fondo en V. Negativo (PBS 1x, fluido alantoideo infectado), así como positivo (fluido alantoideo de cualquier virus NDV) muestras de control siempre se deben incluir en cualquier ensayo de HA para validarlo. Para llevar a cabo un ensayo de HA:

1. Pipetear 50 l de PBS 1x por pocillo en una placa de 96 pocillos de fondo en V.
2. Pipetear 50 l de las muestras de fluido alantoideo en los pocillos de la primera columna de la placa. Realizar diluciones seriadas de 2 veces por el resto de la placa y desechar la última, extra 50 l de pozos en la última columna.
3. Dispensar 50 l de 0,5% pavo RBC en PBS 1x por pocillo. Agitar suavemente la placa tocando.
4. Incubar la placa a 4 ° C (o hielo) fo 30-45 minutos o hasta que un pellet claro se forma en los pocillos de control negativo.

Resultados

Rescate de NDV es un procedimiento bien establecido, realizada de forma rutinaria en los laboratorios que tienen acceso a la ADNc completo del virus. Sin embargo, la naturaleza estocástica intrínseca del método hace que sea difícil de lograr la eficiencia de rescate 100%. El seguimiento de los primeros pasos del proceso, especialmente la eficacia de la transfección y la infección con MVA-T7, ayuda a la identificación de posibles problemas. Figura 5A muestra la transfección estándar y las eficie...

Discusión

Hay varios factores que deben ser considerados para lograr buenos resultados, mientras que el rescate de NDV. En primer lugar, la construcción de ADNc de longitud completa para ser utilizado tiene que ser diseñado para permitir la incorporación funcional de los nuevos transgenes / modificaciones en el genoma NDV. Esto significa que, como se ha dicho, que las secuencias de (i) de gama apropiada gen (GE), intergénica (IG) y el inicio del gen (GS) se deben añadir, si es necesario, (ii) no hay secuencias de GE o GS put...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	CORNING Cellgro	10-013-CV	Any supplier
OptiMEM	GIBCO	31985-070
Lipofectamine 2000 (LPF2000)	Invitrogen	11668-019
35% Bovine Albumin (BA)	Sigma	232-936-2	Any supplier
Trypsin-EDTA	CORNING Cellgro	25-052-CI	Any supplier
Penicillin/Streptomycin (PS) 100x	CORNING Cellgro	30-002-CI	Any supplier
Fetal Bovine Serum (FBS)	Hyclone	SH30070.03	Any supplier
Cell lines A549 cells (catalogue number CRL-185), HEp-2 cells (catalogue number CRL-185), chicken embryo fibroblasts (catalogue number CRL-12203) and duck embryo fibroblasts (catalogue number CCL-141) are available from the American Type Culture Collection (ATCC, 10801 University Boulevard, Manassas, VA. 20110-2209 USA). All cell lines are maintained in a 37 °C incubator with 5% CO2 in DMEM 10% FBS, 1% PS. Embryonated chicken eggs Embryonated chicken eggs can be obtained from Charles River Laboratories, Specific Pathogen Fee Avian Supply (SPAFAS) Avian Products and Services (Franklin Commons, 106 Route 32, North Franklin, CT 06254, USA) and are maintained at 37 °C. Viability of the embryos is assessed with an egg candler. Eggs are infected when they reach 8-10 days old. Both infection and harvest of the allantoic fluid takes place under sterile conditions. All eggs are autoclaved and discarded following standard laboratory biosafety protocols. Turkey red blood cells (RBC) Turkey RBC can be purchased from Truslow Farms (201 Valley Road, Chestertown, Md 21620, USA)and stored at 4 °C. To prepare RBC for HA assay, wash 5 ml of the commercial stock with 45 ml of PBS 1x in a 50 ml conical tube. Centrifuge for 5 min at 1,000 rpm and carefully discard the supernatant. Dilute pelleted RBC 1:1,000 in PBS 1x for a final 0.5-1.0% concentration. Washed RBC can be stored at 4 °C for several days. Plasmids Plasmid preparations are obtained with any commercially available maxiprep kit following manufacturer's instructions, diluted in ddH20 to a final concentration of 1 μg/μl and stored at -20 °C. DNA concentration and purity are assessed by spectrophotometry at 260 and 280 nm. Preparations with a 260/280 ratio higher than 1.8 are considered of acceptable quality for the rescue. Plasmid DNA quality is also routinely double-checked by agarose gel chromatography. Viruses The described protocol for rescue of the lentogenic NDV strain Hitchner B1 can be performed under biosafety level (BSL) 2 conditions. The Modified Vaccinia Ankara expressing the T7 RNA polymerase (MVA-T7) was described34 and obtained from Dr. Bernard Moss. This virus is growth in confluent monolayers of chicken embryo fibroblasts and titrated in mammalian (A549 or HEp-2) cells. NDV stocks are grown in embryonated chicken eggs and titrated by IFA using polyclonal serum raised against purified virions. All contaminated material should be safely sterilized and disposed according to standard biosafety procedures. Tissue culture media and solutions: DMEM 10% FBS 1% PS: Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and Penicillin/Streptomycin (P/S): 445 ml of DMEM, 50 ml of heat-inactivated FBS, 5 ml of 100x commercial P/S solution. Store at 4 °C. 10x Phosphate buffered saline (PBS): 80 g of NaCl, 2 g of KCl, 11.5 g of Na2HPO4.7H2O, 2 g of KH2PO4. Add ddH2O up to 1 L. Adjust pH to 7.3. Sterilize by autoclave. Store at room temperature. 1x PBS: Dilute 10x PBS 1:10 with ddH2O. Sterilize by autoclave and store at room temperature. 100x Ca/Mg : 1.327 g CaCl2.2H2O, 2.133 g MgCl2.6H2O and add ddH2O up to 100 ml. Autoclave and store at room temperature. 1x PBS/BA/PS: 50 ml of 10x Phosphate buffered saline (PBS) in 437 ml ddH2O. Autoclave and when cooled down to room temperature, add 5 ml 100x Penicillin/Streptomycin 3 ml 35% Bovine and 5 ml of 100x Ca/Mg. Store at 4 °C.