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Resumen

Cocultivo de amebas es un sistema de cultivo celular usando amebas adherente a crecer selectivamente a los patógenos intracelulares capaces de resistir las células fagocíticas tales como amebas y macrófagos. Por lo tanto, representa una herramienta clave para descubrir nuevos agentes infecciosos. Enriquecimiento amebas permite el descubrimiento de nuevas especies de amebas y de sus bacterias intracelulares específicos.

Resumen

Los patógenos intracelulares tales como legionella, micobacterias y organismos Chlamydia como son difíciles de aislar porque a menudo crecen poco o nada en absoluto en un medio selectivo que por lo general se utilizan para cultivar bacterias. Por esta razón, muchos de estos patógenos fueron descubiertas sólo recientemente o después de los brotes importantes. Estos patógenos se asocian a menudo con las amebas, que sirven como la célula huésped y permitir la supervivencia y el crecimiento de las bacterias. Pretendemos aquí para proporcionar una demostración de dos técnicas que permiten el aislamiento y caracterización de patógenos intracelulares presentes en muestras clínicas o ambientales: el co-cultivo de amebas y el enriquecimiento de amebas. Cocultivo de amebas permite la recuperación de bacterias intracelulares mediante la inoculación de la muestra investigada en un césped de amebas que puede ser infectado y se lisaron por las bacterias intracelulares presentes en la muestra. Enriquecimiento de amebas permite la recuperación de las amebas presente en una muestra clínica o ambiental. Thse puede conducir al descubrimiento de nuevas especies de amebas, pero también de nuevas bacterias intracelulares que crecen específicamente en estas amebas. Juntas, estas dos técnicas ayudan a descubrir nuevas bacterias intracelulares capaces de crecer en las amebas. Debido a su capacidad para infectar las amebas y resistir la fagocitosis, estas bacterias intracelulares también pueden escapar de la fagocitosis por los macrófagos y, por tanto, ser patógenos para los eucariotas superiores.

Introducción

Antes de la llegada del diagnóstico molecular, los microorganismos presentes en los nichos ambientales o en las muestras clínicas se detectan generalmente mediante su cultivo en diferentes medios selectivos, principalmente en agar en placas de Petri. El fenotipo de las colonias bacterianas y su actividad metabólica después se dejó clasificación bacteriana a nivel de especies. Caldo también puede utilizarse para aumentar la sensibilidad de detección. Sin embargo, ambas técnicas no permiten la recuperación de bacterias que crecen lentamente o en absoluto en estos medios. Esta es la razón por qué los enfoques moleculares se usan tan ampliamente hoy en día. Sin embargo, la detección de ADN no proporciona ninguna pista sobre la viabilidad de las bacterias. Por otra parte, contrariamente a la cultura, enfoques moleculares no dan lugar a una cepa que puede caracterizarse adicionalmente.

El estudio de los patógenos que crecen pobremente en medios sólidos o que las células necesitan para crecer es complicado. La mayoría de estos "difíciles de cultivar" las bacterias son intr fastidiosobacterias acelulares, a menudo descubiertas y caracterizadas siguiente brotes grandes como lo fue el caso de la Legionella pneumophila. Esta bacteria se caracterizó después de un brote que se produjo durante una convención de la Legión Americana. Nada menos que 182 personas fueron infectadas y 29 murieron a causa de una neumonía grave 1,2. Se demostró más tarde que las amebas son los huéspedes naturales de esta bacteria y que su presencia en las redes hotel de sistemas de aire acondicionado y el agua estaba en el origen del brote de la enfermedad de la llamada del legionario 3.

Las amebas están presentes en todo el mundo y fueron aisladas de suelo, el aire, el agua y la mucosa nasal de voluntarios humanos (revisado en 4). Estas amebas "vida libre" generalmente se divide de forma autónoma en el medio ambiente, pero en ocasiones puede invadir anfitriones permisivas 5. Las amebas de alimentación en varios microorganismos a través de la fagocitosis y la posterior digestión lisosomal por Hydrolases 6. Muchas bacterias intracelulares facultativas o obligar son capaces de resistir la digestión y así infectar y dividir en amebas como por ejemplo bacterias o micobacterias relacionadas con clamidia Legionella, (revisado en 7 y 8). Amebas de vida libre, probablemente, representan un importante reservorio potencial de bacterias intracelulares que aún no han sido descubiertos. Esto llevó a nuestro grupo para implementar en Lausana dos técnicas principales, llamados co-cultivo de amebas amebas y enriquecimiento, lo que permitió los diferentes grupos para aislar varios nuevos microorganismos intracelulares obligados de diversas muestras ambientales 9-15.

Desde amebas son fagocitos profesionales que pastan en las bacterias, una bacteria capaz de resistir la fagocitosis y de crecer dentro de estos protistas también puede colonizar los fagocitos humanos y ser patógeno para los seres humanos. Esto fue parcialmente demostrada por algunas bacterias relacionadas con la clamidia, como Waddlia chondrophila. W. chondrophila puede crecer no sólo en las amebas, sino también en varios tipos de células, tales como células de mamífero epiteliales, macrófagos, y las líneas celulares de peces 16-18. El cocultivo de amebas también aparece relevante para la detección de bacterias intracelulares en muestras clínicas 19,20, incluyendo las heces, que están fuertemente contaminados con diferentes especies bacterianas 21.

Aquí se describen los pasos principales de cocultivo de amebas y el enriquecimiento de amebas, incluyendo (a) el tratamiento de muestras ambientales o clínicos; (b) el crecimiento de las amebas en medios axénicos y en un césped bacteriano de Escherichia coli y (c) la selección y caracterización de bacterias intracelulares.

Protocolo

1. Amebas Coculture

1.1 Preparación de la muestra

  1. Muestra Ambiental
    1. Las muestras de agua
      Se filtra la muestra de agua (500 ml a 1 L) a través de una membrana de tamaño de poro 0,22 micras. Luego, sacuda la membrana en solución salina ameba medianas PAS de Página (120 mg de NaCl, 4 mg de MgSO4 • 7H 2 O, 4 mg de CaCl2 • 2H 2 O, 142 mg de Na 2 HPO 4, y 136 mg de KH 2 PO 4 en 1 L de agua destilada).
    2. Las muestras sólidas
      Resuspender muestras sólidas como muestras de suelo o de arena y las muestras semi-sólidas, tales como lodos activados en agua destilada o PBS y filtrar a través de una membrana de tamaño de poro 0,22 micras. Luego, sacuda la membrana en el PAS.
    3. Las muestras altamente contaminadas con amebas endógeno y protozoos
      Primera sedimentar las muestras mediante centrifugación a baja velocidad (180 xg) foR 10 minutos o por filtración a través de una membrana de tamaño de poro 5 micras. Además procesar el sobrenadante (filtrado, respectivamente), como en 1.1.1.
      Nota: Otras técnicas de descontaminación podrían utilizarse para descontaminar más muestras ambientales: Se calienta la muestra a 50 ° C durante 30 minutos o tratar con soluciones ácidas o básicas 14.
  2. Muestra clínica
    Procesar las muestras clínicas en función de sus propiedades físico-químicas. Filtrar o centrifugar líquidos para eliminar las impurezas grandes. Resuspender muestras sólidas. Para utilizar los tejidos, se muelen, por ejemplo mediante el uso de un homogeneiser Dounce o perlas de vidrio, y lisar las células para liberar las bacterias intracelulares.

1.2 Preparación Amebas

  1. Preparación Caldo
    Prepare los siguientes medios: a ricos medios que contienen peptona, extracto de levadura y glucosa (PYG; 100 g de peptona proteasa, 10 g de extracto de levadura, 4,9 g de MgSO4 • 7H 2O, 5 g de citrato de sodio • 2H 2 O, 0,1 g de Fe (NH4) 2 (SO4) 2 • 6H 2 O, 1,7 g de KH 2 PO 4, 1,97 g de Na 2 HPO 4 • 7H 2 O , 45 g de glucosa, y 0,295 g de CaCl2 en 5 L de agua destilada) y un medio no nutritivo tales como el PAS para las especies de Acanthamoeba.
  2. Cultura amebas
    1. Cultivar amebas (preferentemente Acanthamoeba castellanii ATCC 30010 o A. polyphaga Linc-AP1) a 25 ° C en frascos de cultivo de células que contienen 30 ml de medio PYG.
    2. Se recoge el amebas por agitación vigorosa del matraz y se centrifuga la suspensión celular durante 10 min a 1500 x g. Lavar el pellet dos veces con medio PAS. Contar las células en un portaobjetos Kova y ajustar el volumen para obtener una suspensión de 5 x 10 5 células por ml.
    3. Transferir la suspensión de amebas en microplacas. Utilice 1 ml por pocillo de 12 - y 24-wplacas de ELL, 500 l de placas de 48 pocillos y 300 l de placas de 96 pocillos. Incubar la microplaca durante al menos 2 horas a 25 ° C. Esto permite la sedimentación y la fijación de las amebas a la parte inferior de cada pocillo.

1.3 Coculture

  1. La inoculación de la muestra
    1. Inocular la placa de 2.3.3 con diluciones seriadas de la muestra de 1,1 o 1,2, por lo general con la serie de dilución de 10 veces, comenzando con 100 l de muestra no diluida.
    2. Centrifugar la microplaca a 1800 xg durante 10 min a sedimentos en el césped de amebas los microorganismos potencialmente presentes en la muestra. Esto aumenta el contacto y la fagocitosis de los microorganismos por amebas.
    3. Las placas se incuban durante 45 minutos a 25 ° C y lavar tres veces con PAS mediante la sustitución de los medios de comunicación con el PAS fresco. Añadir 1 ml por pocillo de PAS con o sin adición de antibióticos (estreptomicina, penicilina, gentamicina y / o vancomicina), dependiendo de las bacteriuriacol especies que se buscan.
    4. Incubar la microplaca a 32 ° C en una atmósfera humidificada para evitar el enquistamiento de las amebas. Observar cada pocillo a diario con un objetivo 20X para detectar la presencia de bacterias invasoras y de lisis amebas.
    5. En el caso de la lisis, realizar un subcultivo en amebas fresco mediante la inoculación de 100 l de cocultivos a una monocapa de aproximadamente 10 5 amebas / cm 2. Para aislar específicamente una determinada especie bacteriana, inocular también medios de agar específico diseñado para estas bacterias (por ejemplo, agar BCYE por Legionella spp.).
    6. En ausencia de lisis, tome 100 l de cocultivos cuatro a siete días después de la primera inoculación y inocular un cultivo fresco de amebas de 900 l en una placa de 24 pocillos. Si se observa la lisis rápida de las amebas sin proliferación de bacterias, un virus puede estar presente. En este caso, se filtra el sobrenadante a 0,22 micras y utilizar la suspensión se filtró para infectar amebas fresco.

1.4 Aislamiento bacteriano y caracterización

  1. Tinción bacteriana
    Realice cocultivos directamente en cubreobjetos de vidrio en 24-así microplacas. Retire el medio y llevar a cabo la tinción o inmunofluorescencia.
    1. Tinción de Romanowsky Modificado
      1. Deje que el portaobjetos seco. Sumergir el cubreobjetos cinco veces en la solución de fijación (2 mg / L de Fast Green en metanol).
      2. Sumergir el cubreobjetos cinco veces en la solución de tinción I (1,22 g / L de Eosina G en tampón fosfato pH 6.6)
      3. Finalmente, sumerja el cubreobjetos 5 veces en la solución de tinción II (1,1 g / L de tiazina en tampón fosfato pH 6,6).
      4. Enjuague la muestra con agua destilada. Dejar secar y observar por microscopía.
    2. La tinción de Ziehl-Neelsen
      1. Deje que el portaobjetos seco. Cubra la muestra con Ziehl fucsina. Calentar el tinte con una llama hasta que aparezcan vapores.
      2. Enfriar a temperatura ambiente durante al menos 5 miny enjuague con agua destilada. Cubra la muestra con solución de ácido clorhídrico al 3% en isopropanol durante 2 minutos y enjuagar con agua destilada.
      3. Cubra durante 30 segundos con azul de metileno y enjuague con agua destilada. Dejar secar y observar por microscopía 22.
    3. Tinción Gimenez
      1. Preparar una solución de fucsina básica de stock mediante la mezcla de 100 ml de 10% fucsina básica (10 g de fucsina básica en 100 ml de etanol al 95%), fenol acuosa 250 ml de 4% y 650 ml de agua destilada. Incubar a 37 ° C durante 48 horas antes de su uso.
      2. Deje que el portaobjetos se seque y fije haciéndolo pasar a través de la llama. Cubra la muestra con fucsina básica recién filtrada (4 ml de solución de fucsina básica de stock en 10 ml de 0,1 M de tampón de fosfato de sodio, pH 7,45) durante 2 min.
      3. Enjuague la muestra con agua y se incuban en verde de malaquita (0,8% en agua destilada) durante 10 seg. Enjuagar nuevamente con agua y repita la tinción de verde malaquita. Enjuagar nuevamente con agua. Deje que el cubreobjetos secos, mporte, y observar por microscopía 23.
    4. Inmunofluorescencia
      1. Fijar el cubreobjetos incubando en metanol durante 5 min o con paraformaldehído al 4% durante 10 min.
      2. Lavar tres veces con PBS y se incuba durante 2 horas en solución de bloqueo (5% de BSA, 0,1% de saponina en PBS) a temperatura ambiente.
      3. Incubar el portaobjetos durante 1 hora en solución de bloqueo que contiene anticuerpos producidos contra el microorganismo de interés.
      4. Lavar de nuevo tres veces en PBS e incubar durante 1 hora con un anticuerpo secundario dirigido contra el anticuerpo primario y enlazada a un fluoróforo. Lavar tres veces con PBS, montar el cubreobjetos y observar por microscopía de fluorescencia.
  2. La detección de ADN por PCR
    Extracto de ADN de 100 a 200 l de cocultivo de amebas. Detectar microorganismos con cebadores universales dirigidos al gen 16S rRNA o cebadores específicos para especies de interés tales como micobacterias 24, Legionella 25 o los miembros de la 26 Chlamydiales.

2. Enriquecimiento amebas

2.1. Preparación de la muestra

Resuspender muestras sólidas y semi-sólidos en el PAS por agitación. Centrifugar la suspensión a baja velocidad (180 xg) durante 10 min. Esto permite el enriquecimiento de las amebas de vida libre en el sedimento. El sobrenadante puede ser utilizado para el cocultivo de amebas y el sedimento para el enriquecimiento de amebas 21.

2.2. Preparación Mediana

  1. Añadir 1,5 g de agar a 100 ml de PAS y autoclave el medio 15 minutos a 121 ° C. Verter el medio caliente en placas de Petri y dejar que se solidifique a temperatura ambiente.
  2. Crecer Escherichia coli (ATCC 25922) en LB o caldo de tioglicolato la noche a 37 ° C. Lavar las bacterias dos veces con PBS y resuspender en medio de PAS. Diluir 10 veces en PAS y difundir 2-3 ml de esta dilución en una placa de agar PAS y dejar secar.

2.3. La inoculación de la muestra

Añadir una gota de muestra (o un trozo de filtro) en un lado de la placa y dejar que fluya sobre la placa de Petri para formar una línea en el centro del plato.

2.4. Crecimiento amebas amebas y la subcultura

  1. Observar la placa de Petri diaria. Si se detecta un frente de migración amebas, cortar un pequeño trozo de agar en el frente de migración e inocular un fresco plato de Petri NNA cubierto con un césped de E. coli.
  2. Repita la reinoculación varias veces dependiendo de la pureza de la muestra, con el fin de tener un cultivo puro de una cepa de amebas dado.

2.5. Las amebas y bacterias caracterización

  1. Raspar las células y resuspender en PAS.
  2. Extraer el ADN y determinar la identidad de las amebas y / o endosimbiontes bacterianos por PCR y secuenciación (amplificación de 16S rRNA para las bacterias, resp. 18S ARNr de las amebas y secuenciación, por ejemplo).
  3. Utilice estas células tomadas por raspado en PAS para inocular amebas nuevo y hacer una co-cultivo de amebas para detectar bacterias posiblemente presentes en la muestra.

Resultados

Uso de cocultivo de amebas y el enriquecimiento de amebas, toda una gama de bacterias del medio ambiente y / o patógenos se descubrió (Tabla 1).

Cocultivo amebas fue utilizado por nuestro grupo y otros para analizar las muestras ambientales, plantas de tratamiento de agua y sistemas de distribución de agua. Una amplia gama de microorganismos puede ser aislado con esta técnica. Las bacterias más comunes aisladas por cocultivo amebas son miembros del género Mycobacte...

Discusión

Cocultivo amebas y enriquecimiento amebas son métodos eficientes que permitieron el aislamiento de muchas nuevas especies de bacterias y amebas. Los resultados obtenidos con estos métodos confirman la presencia ubicua de los dos amebas y bacterias ameba-resistencia en el medio ambiente, y lo más interesante de las redes de agua artificiales que se consideran para ser controlada por tratamientos químicos tales como cloración y ozonización. Cocultivo amebas y enriquecimiento amebas son herramientas esenciales para a...

Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Agradecimientos

Agradecemos Pr. Bernard La Scola para consejos técnicos útiles y discusión interesante sobre el co-cultivo de amebas y enriquecimiento de amebas. También agradecemos a la Dra. Vincent Thomas por su ayuda en la implementación de la técnica en nuestro laboratorio.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Glucose monohydrateMerck, Darmstadt, Germany108342
0.22 μm pore size membraneMerck Millipore, Darmstadt, GermanySCVPU11RE
proteose peptoneBecton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ211693
yeast extractBecton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ212750
Cell culture flasksBecton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ353135
Kova slideHycor, Indianapolis, IN87144
cell culture microplatesCorning Inc, Corning, NY3524
Diff-Quik staining kitSiemens Healthcare diagn., Munich, Germany130832
Ziehl fuchsinFluka, St-Louis, MI21820
basic fuchsinSigma, St-Louis, MI857843
PhenolSigma, St-Louis, MIP1037Corrosive and mutagenic
malachite green oxalateFluka, St-Louis, MI63160
Paraformaldehyde 16% solutionElectron Microscopy Sciences, Hatfield, PA15710
SaponinSigma, St-Louis, MI84510

Referencias

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