Aislamiento y caracterización funcional de Human ventricular cardiomiocitos a partir de muestras quirúrgicas recientes

Resumen

Los conocimientos actuales sobre las bases celulares de las enfermedades cardiacas se basa principalmente en estudios sobre modelos animales. Aquí describimos y validar un nuevo método para obtener cardiomiocitos viables individuales de pequeñas muestras quirúrgicas de miocardio ventricular humano. Miocitos ventriculares humanos pueden ser utilizados para estudios electrofisiológicos y las pruebas de drogas.

Resumen

Los cardiomiocitos de corazones enfermos son sometidos a procesos de remodelación de complejos que implican cambios en la estructura celular, contracción de acoplamiento excitación y corrientes iónicas de membrana. Esos cambios son probable que sea responsable del aumento del riesgo arritmogénica y las alteraciones contráctiles conducen a la disfunción sistólica y diastólica en pacientes cardíacos. Sin embargo, más información sobre las alteraciones de la función de los miocitos en enfermedades cardíacas ha llegado a partir de modelos animales.

Aquí describimos y validar un protocolo para aislar miocitos viables desde pequeñas muestras quirúrgicas de miocardio ventricular de los pacientes sometidos a operaciones de cirugía cardiaca. El protocolo se describe en detalle. Mediciones electrofisiológicas y de calcio intracelulares se presentan para demostrar la viabilidad de un número de mediciones de células individuales en cardiomiocitos ventriculares humanos obtenidos con este método.

El protocolo informó élre pueden ser útiles para futuras investigaciones sobre las bases celulares y moleculares de las alteraciones funcionales del corazón humano en la presencia de diferentes enfermedades cardiacas. Además, este método puede ser usado para identificar nuevas dianas terapéuticas a nivel celular y para probar la eficacia de nuevos compuestos en cardiomiocitos humanos, con valor de traslación directa.

Introducción

La disección de las propiedades electrofisiológicas del miocardio ha progresado notablemente después el desarrollo de técnicas para el solo aislamiento de miocitos cardiacos. También se han hecho posible los avances recientes en la comprensión de la excitación cardíaca contracción de acoplamiento (EC-Acoplamiento) por la capacidad de aislar los cardiomiocitos viables individuales que conservan todas las propiedades fisiológicas del tejido intacto. Métodos de fijación Patch se emplean rutinariamente para estudiar la función y la modulación farmacológica de las corrientes de iones sarcolema cardíaco. Grabaciones de la dinámica del calcio intracelular con Ca ^{2 +} tintes sensibles también se llevan a cabo regularmente en los miocitos cardíacos individuales de una variedad de modelos sanos y enfermos, proporcionar datos vitales sobre la fisiología de la CE-acoplamiento, así como en las alteraciones patológicas de la intracelular de Ca ^{2 +} homeostasis que conlleva un deterioro mecánico y aumento de la carga de las enfermedades cardíacas arritmogénica. Información de estos estudios es fundamental para la comprensión de los efectos mecánicos y electrofisiológicos de las drogas en el ámbito clínico. Sin embargo, hay diferencias entre especies específicas en las corrientes transmembrana y en las proteínas CE-acoplamiento que dan cuenta de las características específicas de potencial de acción cardíaco y la mecánica cardíaca. Por lo tanto, mientras que los estudios de miocitos aislados de mamíferos no humanos han dilucidado las propiedades biofísicas y funciones fisiológicas de los canales iónicos transmembrana específicos y proteínas CE-acoplamiento, que no proporcionan necesariamente modelos pertinentes de miocitos cardiacos humanos. Por lo tanto, el aislamiento de miocitos viables de miocardio humano es esencial para entender completamente la fisiopatología de las enfermedades cardíacas y validar nuevos enfoques terapéuticos.

Tejido auricular humano es fácilmente disponible como apéndices auriculares son a menudo descartados durante los procedimientos quirúrgicos. Estudios cuantitativos iniciales de los potenciales de acción cardiaco humanos adultos y cu iónicarrents emplean células auriculares enzimáticamente aislados ^1-4. Las grabaciones de los potenciales o corrientes a partir de células humanas adultas ventriculares aislados de acción han sido posteriormente reportado ^3,5-10. La mayoría de estos estudios se han utilizado células obtenidas de corazones explantados y utilizados ya sea colagenasa de perfusión de un segmento de la arteria coronaria o la exposición de cantidades relativamente grandes de tejido extirpado a la colagenasa para obtener células aisladas. Estos estudios permiten una caracterización detallada de un número de corrientes de iones transmembrana de los cardiomiocitos ventriculares humanos de corazones sanos y de pacientes con insuficiencia cardiaca terminal. Grabaciones de L-tipo Ca ^{2 +} actual (I _Ca-L) ^5-7, corriente hacia el exterior de potasio transitoria _(I) ^8, la corriente de entrada del rectificador de potasio (I _κ1) ^8, los diferentes componentes de la corriente de potasio rectificadora retardada (I _κ ) ⁹ han sido reportados. Avances y refinación deel procedimiento de aislamiento ^10, permite una caracterización clara de la base iónica del aumento del potencial arritmogénica en la insuficiencia cardíaca terminal, que comprende la acción potencial de prolongación ^11, retrasó después de despolarizaciones ¹² y aumentó divertido corriente ¹³ que conduce a la despolarización diastólica y latidos prematuros.

Miocitos cardíacos adultos normalmente están aislados de animales pequeños por perfusión retrógrada de todo el corazón con diferentes mezclas de enzimas, una técnica que produce altos rendimientos de Ca ^{2 +-células} tolerantes ^14. Aislamiento de miocitos cardiacos a partir de fragmentos de tejido es inherentemente menos éxito probablemente a causa de la limitación del acceso de las enzimas a miocitos individuales en comparación con la alcanzada por la perfusión de las arterias coronarias. Debido a la limitada disponibilidad de los corazones de donantes no utilizadas, la única forma práctica de obtener células ventriculares humanos normales sobre una base regular es por digestio enzimátican de los fragmentos muy pequeños a menudo tejidos extirpados durante los procedimientos quirúrgicos electivos. El único modelo de enfermedad humana que se ha caracterizado a fondo a nivel celular es la insuficiencia cardíaca terminal, debido a la accesibilidad a los corazones trasplantados. Sin embargo, la insuficiencia cardíaca terminal se produce en una minoría de los pacientes y a menudo implica una vía común de la remodelación severa de las células del miocardio, que es relativamente independiente de la causa subyacente ^15. La capacidad de evaluar la función de los cardiomiocitos individuales de los pacientes en una etapa anterior no no de la enfermedad es crucial para entender la patofisiología específica de diferentes enfermedades hereditarias o adquiridas. La miocardiopatía hipertrófica (MCH) es un ejemplo elocuente. HCM es un frecuente (1/500 personas) condición cardiaca hereditaria caracterizada por hipertrofia cardiaca, aumento de alteraciones de riesgo y contráctiles arritmogénicas debido a la obstrucción del tracto de salida y la disfunción diastólica ^16. Los cardiomiocitos de corazones HCM undergo unos complejos procesos de remodelación que implican cambios en la estructura celular (hipertrofia, desorganización miofibrilar) y CE-Acoplamiento ^17. Sin embargo, la mayoría de la información de la disfunción de los miocitos en HCM ha venido de modelos animales transgénicos. Dado que sólo una minoría de pacientes con MCH evoluciona hacia la insuficiencia cardíaca terminal y requiere de un trasplante cardíaco, el corazón de HCM son muy rara vez están disponibles para el aislamiento de células con los métodos estándar. Sin embargo, al menos el 30% de los pacientes con MCH presentan síntomas obstructivos debido al flujo de sangre del tracto de salida alteración hipertrofia septal masiva durante la sístole (HCM) ^18. La opción terapéutica disponible más eficaz para el alivio de la obstrucción en la MCH es la miectomía septal quirúrgica: durante este procedimiento quirúrgico, una porción de tamaño variable del tabique superior se elimina por vía aórtica trans. Esta porción de tabique hipertrofiado es, por tanto, disponible para el aislamiento de células del tejido fresco.

Un método para el aislamiento de ventricula humanar miocitos de pequeñas muestras endomiocárdicas individuales, transvenosos biopsia se ha desarrollado y publicado previamente ^19. Hemos implementado un método para aislar miocitos septales individuales de las muestras de miocardio ventricular de los pacientes sometidos a cirugía cardíaca, incluyendo pacientes con HCM sometidos miectomía septal y los pacientes sometidos a procedimientos de reemplazo de válvulas. Además de una descripción detallada del protocolo de aislamiento, electrofisiológicos representativa y Ca ^{2 +} fluorescencia se presentan las mediciones, lo que demuestra la viabilidad de los miocitos ventriculares aislados humanos y la viabilidad de patch clamp e intracelulares de Ca ^{2 +} Estudios.

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Protocolo

Los protocolos experimentales sobre el tejido humano fueron aprobados por el comité de ética de la Universidad de Careggi Hospital (2006/0024713; renovada mayo de 2009). Cada paciente dio su consentimiento informado por escrito.

1. Soluciones y Preparación del equipo

Las soluciones se describen en la Tabla 1. Un diagrama de flujo simplificado del procedimiento de aislamiento de células se encuentra en la Figura 1.

Solución		CP	DB	KB	Tuberculosis	PS	EB1	EB2
Reactivo (mM)	KH 2 PO 4	50
	MgSO4	8	1.2	5			1.2	1.2
	HEPES	10			10	10
	adenosina	5
	glucosa	140	10	20	10		10	10
	manitol	100
	taurina	10	20	5			20	20
	NaCl		113		136		113	113
	KCl		4.7	85	5.4	25	4.7	4.7
	MgCl 2				1.2	5
	KH 2 PO 4		0.6	30			0.6	0.6
	Na 2 HPO 4		0.6				0.6	0.6
	De NaHCO3		12				12	12
	KHCO3		10				10	10
	Na-piruvato		4				4	4
	BDM		10				10	10
	BHBA			5
	ácido succínico			5
	EGTA			0.5
	K 2-ATP			2
	ácido pirúvico			5
	creatina			5
	KMES					115
Enzimas (U / ml)	La colagenasa Tipo V						250	250
	Proteasa Tipo XXIV						4
pH		7.4 KOH	7,3 NaOH	7.1 KOH	7.35 NaOH	7.2 KOH	7,3 NaOH	7,3 NaOH

. Tabla 1 Las soluciones utilizadas para la recogida de muestras, el aislamiento de células y caracterización funcional de los miocitos CP = solución cardiopléjica.; DB = tampón de disociación; KB = solución de Kraft-Brühe; TB = tampón de Tyrode; PS = solución de la pipeta; EB1 = tampón de enzima 1; EB2 = tampón de enzima 2.

1. Preparar cardioplégica solución (CP). Solución de CP se puede almacenar a 4 ° C durante hasta 1 semana.
2. Preparar Ca ^{2 +} libre de tampón de disociación (DB). Esta solución se debe usar en el día.
3. Preparar Kraft-Brühe (KB) solución. Solución KB se puede almacenar a 4 ° C durante hasta 1 Week.
4. Preparar Ca ^{2 +-tampón} Tyrode libre (TB). Esta solución se debe usar en el día.
5. Filtrar todas las soluciones usando filtros de jeringa antes de su uso.
6. Preparar el dispositivo de digestión (Figura 2), un recipiente de raspado hecho de dos cepillos enfrentadas de elastómero de silicona, uno de los cuales hace girar por un motor eléctrico. El dispositivo de la digestión es por encargo. Los detalles sobre el dispositivo de la digestión son en la Figura 8; imágenes del dispositivo son en las figuras 2 C y 2D. Lavar la cámara de tejido con etanol al 70% y agua.

2. Recopilación y procesamiento de muestras de miocardio

1. Verter 40 ml de solución cardiplegic (CP) en un tubo de 50 ml y almacenarlo en el hielo para el transporte de muestras desde la sala operativa para el laboratorio de aislamiento de células.
2. Recoger la muestra de miocardio ventricular de la sala operatoria inmediatamente después de la escisión, lávelo con heladaSolución de PC y guárdelo en el tubo. Utilice especímenes endocárdicos escindió del tabique ventricular entre superior durante la cirugía a corazón abierto, la ponderación> 100 mg.
3. Rápida transferencia de la muestra al área de laboratorio; iniciar el procesamiento de la muestra dentro de los 10 min de la escisión de la muestra.
4. Mientras se mantiene la muestra en tampón enfriado con hielo CP, retire con cuidado la capa fibrótica del endocardio con tijeras finas bajo un microscopio estereoscópico; después, cortar el tejido miocárdico para piezas pequeñas (2-3 mm de largo). Dependiendo de tamaño de la muestra de tejido, cortar una cantidad total de miocardio ventricular entre 100 mg y 1 g para cada aislamiento.
5. Al terminar de picar carne de tejidos, la transferencia de los trozos de miocardio en el dispositivo de la digestión, con hielo limpio solución CP frío. Evitar llenar todo el volumen entre los dos cepillos de silicio (3-4 ml) con trozos de miocardio, usando no más que 1 g de tejido total.

3. Lavado y digestión de Miocardio Trozos

1. En popaer los trozos se transfieren a la cámara de raspado del dispositivo de digestión, cambiar el tampón CP en la cámara de frío Ca ^{2 +-tampón} de disociación libre (DB).
2. Coloque el dispositivo de digestión en un baño termostático, a fin de que la cámara para estar en contacto con el agua caliente en el baño (Figura 1). Ajuste el baño maría a 37,5 ° C y encenderlo, a fin de elevar lentamente la temperatura de la cámara de tejido. Encienda el motor del dispositivo de la digestión, el establecimiento de la velocidad de rotación a 1 revolución / segundo.
3. Realizar 3 ciclos de lavado con DB, cambiando la solución en la cámara limpia con DB cada 8 min. La DB se calienta (37 ° C) y oxígeno saturado antes de entrar en contacto con los trozos de miocardio.
4. Preparar tampón de enzima 1 (EB1) mediante la adición de 250 U / ml de colagenasa Tipo V y 4 U / ml de proteasa tipo XXIV solución DB. Prepare el tampón de la enzima 2 (EB2) mediante la adición de 250 U / ml de colagenasa tipo V a la solución de base de datos. Calentamiento (37 ° C) y oxygenate EB1 y EB2.
5. Realizar dos ciclos de 12 min de la digestión en el dispositivo de la digestión de rotación con 100% EB1 oxigenada (a 37 ° C). En cada ciclo, usar ~ 3 ml de EB1. Eliminar la solución por aspiración de la pipeta y desecharla después de cada ciclo.
6. Preparar 6 tubos de 15 ml para la recogida de células y ~ 80 ml de solución KB frío (4 ° C) para eluir los tampones.
7. Lleve a cabo un primer ciclo de digestión de 15 minutos con 3 ml 100% EB2 oxigenada a 37 ° C. Después de que el ciclo de digestión, recoger la solución que contiene los primero miocitos disociadas en un tubo de 15 ml y diluir la suspensión celular con 12 ml de solución KB frío. Guarde la plana tubo a temperatura ambiente.
8. Diluir la solución EB2 restante con una cantidad igual de DB con el fin de reducir a la mitad la concentración de colagenasa V para los siguientes ciclos de digestión.
9. Lleve a cabo otros ciclos 5 12 min de digestión con 3 EB2 ml a 37 ° C; después de cada uno de ellos recoger de los miocitos que contiene tampón en un tubo cónico de 15 ml y sediluir con 12 ml de solución de KB. Guarde los tubos de células que contiene 6 a temperatura ambiente durante 30 min.

4. Resuspensión celular y Ca ^{2 +} Readaptación

1. Añadir 1 mg de albúmina / ml de suero bovino (BSA) a 20 ml de tampón de Ca ^{2 +-Tyrode} libre (TB). Se filtra la solución.
2. Centrifugar los seis tubos cónicos de miocitos que contiene a 100 xg durante 5 minutos a la fuerza para resolver los miocitos. Eliminar el sobrenadante y resuspender las células en cada tubo con una cantidad variable (1-3 ml, dependiendo del rendimiento) de BSA que contiene la TB a TA.
3. Aumente gradualmente concentración de ^{Ca2 +} en el tampón de células que contiene añadiendo pequeñas alícuotas de 100 mmol / L de solución de _CaCl2. En los primero y segundo pasos concentración de ^{Ca2 +} se eleva hasta 50 mmol / L y 100 mmol / L, respectivamente. Los siguientes pasos Ca ^{2 +} de adición se llevan a cabo cada 5 min y la concentración se eleva por 100 mol / L en cada paso tOA concentración final de 0,9 mmol / L.
4. Evaluar el rendimiento del procedimiento de aislamiento. Transferir 0,5 ml de solución de los miocitos que contiene en la cámara de fondo de vidrio de un microscopio. Evalúe 15 campos microscópicos aumento de 10x objetivo y calcular el porcentaje de miocitos sanos (por ejemplo, células con forma de bastón con estrías claras y sin inclusiones importantes, Figura 2). El rendimiento esperado es de alrededor de 20%.

5. Evaluación funcional de los cardiomiocitos aislados.

El siguiente protocolo es un ejemplo de la evaluación funcional de los cardiomiocitos humana incluyendo registros simultáneos de los potenciales de acción y intracelular de Ca ^{2 +} flujos.

1. Preparar la solución de la pipeta (PS) para los experimentos de patch clamp en la configuración de parche perforado. La solución puede ser almacenada a -20 ° C durante hasta 3 meses.
2. Añadir 1,8 mmol / L _CaCl2 al Ca ^{2 +} tampón Tyrode libre (TB). Usí esta solución para superfusion de los cardiomiocitos durante los experimentos de patch clamp / fluorescencia.
3. Transferencia de 1 ml de suspensión celular a un tubo de 1,5 ml y añadir 10 mmol / L de Fluoforte y 10 l Powerload Concentrado. Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente. A continuación, ajuste el tubo en posición vertical y salir de la celda que conformarse con 5 min; resuspender las células en Ca ^{2 +} que contiene la tuberculosis.
4. Transferir 0,25 ml de suspensión de células a una pequeña (0,5 ml), microscopio de temperatura controlada montado cámara de registro, superfused por gravedad con un sistema de microperfusor se calentó a una velocidad de flujo de 0,3 ml / min (temperatura: 37 ± 0,5 ° C).
5. El uso de un extractor de micropipeta, preparar pipetas patch clamp con un diámetro de la punta de 3 a 5 micras y una resistencia de 3 a 4,5 M cuando se llena con PS.
6. Añadir anfotericina B a un lote de PS (250 mg / ml) y utilizarla para rellenar los electrodos.
7. Seleccione una celda en forma de barra con estrías claras, libre de inclusiones, form el sello giga y esperar 5 a 10 minutos, hasta que la resistencia de acceso es inferior al 20 MΩ.
8. Obtener los potenciales de acción en el modo de pinza de corriente utilizando pulsos cortos (<3 ms) a diferentes frecuencias de estimulación (0,2 Hz, 0,5 Hz y 1 Hz, 1 min en cada frecuencia). Durante la fase de grabación, encender iluminación de campo brillante a 492 ± 3 nm y detectar Fluoforte fluorescencia a 505-520 nm. Adquirir la fluorescencia y la membrana señales potenciales utilizando Digidata 1440A y software de ordenador pClamp 10.0. Repita la secuencia de la grabación varias veces si es necesario; sin embargo, mantener el tiempo de grabación total por debajo de 15 min para cada celda.

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Resultados

Se empleó el método descrito anteriormente para caracterizar las anormalidades funcionales de cardiomiocitos aislados del tabique interventricular de pacientes con miocardiopatía hipertrófica (MCH) que se sometieron a la operación miectomía, en comparación con los pacientes no quirúrgicos que fallan no hipertróficas ^21. Los resultados que figuran en esta sección se derivan de que el trabajo ²¹ y se muestra aquí como un ejemplo de cómo esta técnica se puede utilizar para caracterizar la...

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Discusión

Hemos descrito y validado un método para aislar miocitos viables a partir de muestras quirúrgicas de miocardio ventricular humano. A partir de los protocolos descritos anteriormente que había sido utilizado con éxito para células aisladas a partir de muestras quirúrgicas auriculares, la técnica para permitir la separación de los miocitos viables individuales de miocardio ventricular enferma fue desarrollado y afinado. Los primeros informes mostraron que el aislamiento de los cardiomiocitos individuales de trozos...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P9791
Magnesium sulfate heptahydrate(MgSO4*7H2O)	Sigma-Aldrich	M1880
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Adenosine	Sigma-Aldrich	A9251
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
Mannitol	Sigma-Aldrich	M4125
Taurine	Sigma-Aldrich	T0625
Potassium hydroxide (KOH)	Sigma-Aldrich	P5958
Sodium chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S7653
Potassium chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P9333
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)	Sigma-Aldrich	S7907
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S6297
Potassium bicarbonate (KHCO3)	Sigma-Aldrich	237205
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P2256
2,3-Butanedione monoxime	Sigma-Aldrich	B0753
Sodium hydroxide(NaOH)	Sigma-Aldrich	S8045
L-Glutamic acid monopotassium salt monohydrate	Sigma-Aldrich	49601
Pyruvic acid	Sigma-Aldrich	107360
3-Hydroxybutyric acid	Sigma-Aldrich	166898
Adenosine 5′-triphosphate dipotassium salt dihydrate (K2-ATP)	Sigma-Aldrich	A8937
Creatine	Sigma-Aldrich	C0780
Succinic Acid	Sigma-Aldrich	S3674
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA)	Sigma-Aldrich	E0396
Albumin from bovine serum	Sigma-Aldrich	A0281
Magnesium chloride (MgCl2)	Sigma-Aldrich	M8266
Collagenase from Clostridium histolyticum, Type V	Sigma-Aldrich	C9263
Proteinase, Bacterial, Type XXIV	Sigma-Aldrich	P8038
Calcium chloride solution, ~1 M in H2O	Sigma-Aldrich	21115
Calcium chloride 0.1 M solution	Sigma-Aldrich	53704
Potassium methanesulfonate	Sigma-Aldrich	83000
FluoForte Reagent	Enzo Life Sciences	ENZ-52015
Powerload concentrate, 100X	Life Technologies	P10020
Perfusion Fast-Step System	Warner Instruments	VC-77SP
Amphotericin B solubilized	Sigma-Aldrich	A9528
Multiclamp 700B patch-clamp amplifier	Molecular Devices
Digidata 1440A	Molecular Devices
pClamp10.0	Molecular Devices
Digestion Device	CUSTOM	CUSTOM	The device is custome made in our laboratory using plastic tubes, cast Sylgard and a motor; it is described in detail in Figure 1C-1D and in Figure7. We can provide further details if requested.
Silicone elastomer for the digestion device's brushes	Dow Corning	SYLGARD® 184
Variable speed rotating motor for the digestion device	Crouzet	Crouzet 178-4765
Mold for brushes casting	N.A.	N.A.	The mold is custom made from standard PTFE 2.5 cm diameter rods.