Lineal Amplificación Mediada por PCR - Localización de elementos genéticos y caracterización de ADN que flanquean Desconocido

Resumen

Lineal-amplificación mediada (LAM)-PCR es un método desarrollado para identificar las posiciones exactas de los vectores de integración viral en el genoma. La técnica ha evolucionado a ser el método superior para estudiar la dinámica clonales en los pacientes de terapia génica, la bioseguridad de las tecnologías de nuevo vector, la diversidad de células T, los modelos de células madre de cáncer, etc

Resumen

Linear-amplification mediated PCR (LAM-PCR) has been developed to study hematopoiesis in gene corrected cells of patients treated by gene therapy with integrating vector systems. Due to the stable integration of retroviral vectors, integration sites can be used to study the clonal fate of individual cells and their progeny. LAM- PCR for the first time provided evidence that leukemia in gene therapy treated patients originated from provirus induced overexpression of a neighboring proto-oncogene. The high sensitivity and specificity of LAM-PCR compared to existing methods like inverse PCR and ligation mediated (LM)-PCR is achieved by an initial preamplification step (linear PCR of 100 cycles) using biotinylated vector specific primers which allow subsequent reaction steps to be carried out on solid phase (magnetic beads). LAM-PCR is currently the most sensitive method available to identify unknown DNA which is located in the proximity of known DNA. Recently, a variant of LAM-PCR has been developed that circumvents restriction digest thus abrogating retrieval bias of integration sites and enables a comprehensive analysis of provirus locations in host genomes. The following protocol explains step-by-step the amplification of both 3’- and 5’- sequences adjacent to the integrated lentiviral vector.

Introducción

Lineal-amplificación mediada por PCR (LAM-PCR) permite la identificación y caracterización de ADN que flanquea desconocida adyacente a ADN conocido de cualquier origen. Más específicamente, LAM-PCR se ha desarrollado para localizar los sitios de integración de vectores virales (IS) dentro del genoma del huésped ^1,2. Los elementos genéticos como retrovirus o transposones integrar su genoma en el genoma huésped en un (semi-) de forma aleatoria ^3-6. En muchos casos es decisivo para saber exactamente la posición en que estos vectores integrados. LAM-PCR se ha demostrado ser superior a las técnicas alternativas como la ligadura mediada por PCR ⁷ y sus variantes o PCR inversa ^8. La sensibilidad y la robustez de este método surge de la etapa previa de amplificación inicial de las uniones de vector y el genoma de la selección magnética de los productos de PCR amplificados. Al igual que los métodos alternativos mencionados, LAM-PCR se basa en el uso de enzimas de restricción, la introducción de un sesgo en la capacidad de recuperación de IS ^9-11. Por lo tanto,sólo un subconjunto del repertorio ESTÁ (la integrome) se puede detectar en una reacción. Este sesgo se minimiza por el análisis paralelo de una muestra dada usando combinaciones óptimas de las enzimas de restricción ^9. Recientemente, una variante de la tecnología denomina no restrictiva LAM-PCR (nrLAM-PCR) se ha desarrollado que evita el uso de enzimas de restricción y permite el análisis de todo el genoma imparcial de una muestra en una sola reacción ^9,12.

En el pasado, LAM-PCR se ha utilizado para identificar el causante retroviral está dando lugar a la leucemia en algunos pacientes en los ensayos clínicos de terapia génica ^13-15. Desde entonces, LAM-PCR ha sido adaptado para identificar es de otros vectores de integración (vectores lentivirales, transposones) y también para identificar patrones de integración de la integración de pasivamente vectores como vectores adeno-asociados (AAV) o vectores lentivirales-integrasa defectuosa (IDLV) ^{16 -21.} Aplicaciones de la LAM-PCR son de amplia expansión: tradicionalLY, la técnica se usa ampliamente para estudiar la composición clonal de células de genes modificados en los pacientes que han sido sometidos a la terapia génica o para evaluar la seguridad de la biotecnología de sistemas de vectores novedosos por desentrañar su comportamiento integración ^15,16,22-24. Recientemente, LAM-PCR permitió determinar la especificidad y la actividad fuera del objetivo de las nucleasas de diseño mediante un ensayo de captura de IDLV ^25.

Por otra parte, LAM-PCR permite seguir fácilmente el destino de una célula transducida con el tiempo en un organismo. Esto permite identificar los proto-oncogenes, así como genes supresores de tumores y también para estudiar la hematopoyesis o madre de cáncer biología celular ^26-28. Por último, pero no menos importante, LAM-PCR fue adaptado para estudiar la diversidad de receptores de células T en seres humanos ⁽²⁹ y datos no publicados).

La potencia intrínseca de la tecnología se ve reforzada por la vinculación el método a las tecnologías de secuenciación profundas que permiten la caracterización de millones de ADN desconocido que flanquea con solo nucleótido resolución de genomas enteros. En el siguiente protocolo, se describe paso a paso la amplificación e identificación de ADN flanqueante desconocido a modo de ejemplo para identificar vector lentiviral ES. Los oligonucleótidos utilizados en el protocolo se enumeran en la Tabla 1. Extrajeron el ADN o el ADNc de cualquier fuente se pueden utilizar como plantilla de ADN para LAM-PCR y nrLAM-PCR.

Protocolo

1. Preparación del vinculador Cassettes (LC)

1. Mezclar 40 l de LC1 oligonucleótido (Tabla 1), 40 l de LC2 oligonucleótido (Tabla 1, con la enzima de restricción apropiada voladizo), 110 l de Tris-HCl (100 mM, pH 7,5), y 10 l 250 mM de MgCl _2.
2. Incubar a 95 ° C durante 5 minutos y dejar que la reacción se enfríe lentamente a temperatura ambiente. Añadir 300 l de H ₂ O y concentrarse dsLinker-ADN en un filtro de centrifugación. Añadir 80 l H ₂ O al eluato y alícuotas de 10 l de casete de engarce dispuesto en 0.2 tubos de PCR.

2. Preamplificación del genoma del vector Uniones

1. Para cada muestra a analizar preparar una reacción de PCR de 50 l.
   1. Determinar la concentración de las muestras de ADN. Pipeta x l (1-1.000 ng para LAM/100-1, 000 ng para nrLAM) de ADN en un tubo de PCR de 0,2 ml. Volumen de ADN debe ser igual en cada muestra y en la RANGE de 0,5 a 25 l.
   2. Preparar mezcla maestra de PCR como se describe en la Tabla 2 de la mezcla (50 - x). L de la mezcla maestra con cada muestra de ADN en 0,2 ml tubos de PCR.
2. Preamplificar vector uniones genoma utilizando condiciones de PCR ejemplificados en la Tabla 2. Después de la terminación de la PCR añaden 0,5 l de Taq polimerasa a cada tubo de PCR y vuelva a ejecutar el programa de PCR. Los productos de PCR se pueden almacenar a 4 ° C durante un máximo de 4 días o largo plazo a -20 ° C.

3. Separación Magnética de la PCR Producto

1. Preparación de perlas magnéticas
   1. Pipetear 20 l (200 g) de perlas magnéticas recubiertas con estreptavidina en un tubo de 1,5 ml y se exponga durante 1 min en el separador de partículas magnéticas (MPS) a temperatura ambiente. Desechar el sobrenadante.
   2. Saque el tubo del MPS y volver a suspender las perlas magnéticas en 40 l PSB / BSA al 0,1% (pH 7,5). La exposicion a MPS durante 1 min y desechar el sobrenadante. Repita este paso una vez.
   3. Lavar perlas wiº 20 l de solución de LiCl 3 M (3 M LiCl, 10 mM de Tris-HCl, 1 mM EDTA) exponer a MPS durante 1 minuto y desechar el sobrenadante. Resuspender las perlas en 50 l de solución 6 M de LiCl (6 M de LiCl, mM de Tris-HCl 10, EDTA 1 mM).
2. Mezcla de reacción PCR entera de la etapa 2.2 con 50 l de perlas magnéticas preparadas. Incubar en un agitador horizontal (300 rpm) a menos de 2 horas a temperatura ambiente. Este paso permite la unión del producto de PCR biotinilado a estreptavidina perlas recubiertas (complejo ADN-Bead). Complejo de grano de ADN se puede incubar en un agitador durante la noche o se almacenó a 4 ° C durante hasta 4 días.
3. La exposicion complejo ADN-Bead para MPS durante 1 minuto a temperatura ambiente, quite el sobrenadante y resuspender complejo ADN-bolas en 100 l de H ₂ O. Proceder inmediatamente con el paso 4 para LAM o el paso 5 para nrLAM.

4. LAM-Procedimiento

1. ADN de doble cadena (dsDNA) Síntesis (LAM solamente)
   1. La exposicion complejo ADN-Bead desde el paso 3.3 para MPS por 1 min y dissobrenadante tarjeta. Añadir 8,25 l de H ₂ O, 1 l de tampón 10x hexanucleótido, 0,25 mu l dNTPs (10 mM) y 0,5 l (2 U) Klenow polimerasa. Incubar a 37 ° C durante 1 hora.
   2. Añadir 90 l de H ₂ O y se exponga a MPS durante 1 min. Desechar el sobrenadante y complejo ADN-Bead resuspender en 100 l de H ₂ O.
2. Digestión de restricción
   1. La exposicion complejo ADN-Bead para MPS por 1 min y desechar el sobrenadante. Añadir 8,5 l de H ₂ O, 1 l de 10x tampón de enzima de restricción y 0,5 l de enzima de restricción y se incuba la reacción durante 1 hora. Repita el paso 4.1.2.
      NOTA: Se incuba la reacción a la temperatura recomendada por el fabricante de la enzima de restricción. Asegúrese de que no hay ningún sitio de restricción presentes dentro o aguas abajo del sitio de unión del cebador utilizado para la preamplificación en el ADN de interés. Para la elección de combinaciones de enzimas enzimas de restricción / limitación adecuados referirse a ^9.
3. La ligación de DS Linker (LK)
   1. La exposicion complejo ADN-Bead para MPS por 1 min y desechar el sobrenadante. Añadir 5 l de H ₂ O, 1 l de tampón 10x FastLink, 1 l de ATP (10 mM), 2 l vinculador casete desde el paso 1.2 y 1 l Fast-Link ADN ligasa (2 U / l). Incubar a temperatura ambiente durante 5 min. Repita el paso 4.1.2.
4. La desnaturalización de ADN de doble cadena sintetizado
   1. La exposicion complejo ADN-Bead para MPS por 1 min y desechar el sobrenadante. Resuspender complejo ADN-bolas en 5 l 0,1 N NaOH. Incubar 5 min a temperatura ambiente en un agitador horizontal.
   2. Exponer complejo de ADN-Talón a MPS durante 1 min y recoger unión vector de genoma-preamplificada que contiene sobrenadante en nuevo tubo de 1,5 ml. Proceder de inmediato con el paso 6 o tienda sobrenadante a -20 ° C.

5. NrLAM-Procedimiento

1. La ligación del enlazador de cadena sencilla (SSLC) (nrLAM solamente)
   1. La exposicion complejo ADN-Bead desde el paso 3.3 para MPSdurante 1 min y el sobrenadante de descarte. Añadir 6,5 l de H ₂ O, 1 l CircLigase 10x tampón de reacción, 0,5 l de _MnCl2 (50 mM), 0,5 l de ATP (1 mM), 1 l de oligonucleótido ssLinker y 0,5 l CircLigase (100 U / l). Incubar a 60 ° C durante 1 hora.
   2. Añadir 90 l de H ₂ O y se exponga a MPS durante 1 min. Desechar el sobrenadante y lavar complejo ADN-bolas en 100 l de H ₂ O. Una vez más exponer a MPS por 1 min, el sobrenadante y resuspender descarte complejo ADN-Bead de 10 l H ₂ O.

6. Exponencial de amplificación me

1. Para cada muestra a analizar preparar una reacción de PCR de 50 l.
   1. Pipetear 2 ADN molde l (del paso 4.4.2 (LAM) o 5.1.2 (nrLAM)) en un tubo de PCR de 0,2 ml.
   2. Preparar mezcla maestra de PCR como se describe en la Tabla 3. Añadir 48 l de mezcla maestra a cada muestra de la etapa 6.1.1 y amplificar las uniones genoma del vector por PCR conditions ejemplificados en la Tabla 3. productos de la PCR se pueden almacenar a 4 ° C durante un máximo de 4 días o largo plazo a -20 ° C.

7. Separación Magnética de la PCR Producto

1. Preparar perlas magnéticas como se ejemplifica en los pasos 3.1.1 - 3.1.3. Resuspender las perlas en 20 l (para LAM) o 50 l (para nrLAM) de solución 6 M de LiCl (6 M de LiCl, mM de Tris-HCl 10, EDTA 1 mM). Mezclar 20 l (LAM) o 50 l (nrLAM) de reacción de PCR de la etapa 6.1.2 con perlas magnéticas preparadas (paso 7,1) e incubar en un agitador horizontal (300 rpm) durante 2 horas a temperatura ambiente. Complejo de grano de ADN se puede incubar en un agitador durante la noche o se almacenó a 4 ° C durante hasta 4 días.
2. La exposicion complejo ADN-Bead para MPS por 1 min, retirar el sobrenadante y resuspender complejo ADN-bolas en 100 l de H ₂ O. La exposicion complejo ADN-Bead para MPS por 1 min y desechar el sobrenadante.
3. Resuspender complejo ADN-Bead de 20 l (LAM) o 5 l (nrLAM) 0,1 N NaOH. Incubate durante 10 min a temperatura ambiente en un agitador horizontal, exponga a MPS durante 1 min y recoger el ADN que contiene sobrenadante amplificado en nuevo tubo de 1,5 ml. Proceder de inmediato con el paso 8.1 o tienda sobrenadante a -20 ° C.

8. Exponencial de amplificación II

1. Para cada muestra a analizar preparar una reacción de PCR de 50 l.
   1. Pipetear 2 l de ADN plantilla (de la etapa 7.3) en un tubo de PCR de 0,2 ml.
   2. Preparar mezcla maestra de PCR como se describe en la Tabla 4. Añadir 48 l de mezcla maestra a cada muestra de la etapa 8.1.1 y amplificar las uniones genoma del vector por las condiciones de PCR ejemplificados en la Tabla 4. Productos de la PCR se pueden almacenar a 4 ° C durante hasta 4 días o largo plazo a -20 ° C.
2. Para visualizar (NR) productos LAM-PCR, carga de 10 l del producto de PCR de la etapa 8.1.2 en un gel de agarosa al 2%. Si las bandas son visibles, analizar 10 l de producto de LAM-PCR en gel de alta resolución. PRECAUCIÓN: Etbromuro hidium es mutagénico. Trabaje con mucho cuidado y siempre use guantes apropiados.

9. Preparación para la secuenciación de alto rendimiento

1. Purificación de (nr) productos LAM-PCR
   1. Mezclar 40 l PCR-producto del paso 8.1.2 con 44 l de temperatura ambiente AMPure XP perlas magnéticas. Incubar 5 minutos a temperatura ambiente y exponerlo a MPS durante 2 min.
   2. Desechar el sobrenadante y lavar dos veces con 200 l 70% de EtOH en las MPS.
   3. Desechar el sobrenadante y complejo ADN-Bead resuspender en 30 l H ₂ O. Incubar 1 min y transferir el sobrenadante a fresco tubo 0,2 ml. Determinar la concentración de ADN purificado.
2. Fusionprimer PCR para añadir la secuenciación de adaptadores específicos.
   1. Para cada muestra a analizar preparar una reacción de PCR de 50 l.
   2. Pipeta x l (40 ng) de ADN en un tubo de PCR de 0,2 ml. Volumen de ADN debe ser igual en cada muestra y en el intervalo de 0,5 a 25 l.
   3. Prepare la mezcla maestra de PCR como se describe en la tabla 5 Agregar (50 - x). L de mezcla maestra a cada muestra a partir del paso 9.2.2 e introducir adaptadores de secuenciación a (nr) productos LAM-PCR por PCR condiciones ejemplificados en la Tabla 5 los productos de PCR. puede almacenarse a 4 ° C durante un máximo de 4 días o largo plazo a -20 ° C.
   4. Para visualizar Fusionprimer-PCR productos de carga 10 l de producto de PCR de la etapa 9.2.3 en un gel de agarosa al 2%. Purificar el producto remanente PCR como se describe en los pasos 9.1.1 - 9.1.3. Analizar 1 l producto de PCR purificado de la etapa 9.4 en un dispositivo de electroforesis de alta resolución automatizado para cuantificar con precisión la concentración y el fragmento de tamaño de los productos Fusionprimer-PCR.

Resultados

LAM-PCR resulta en la amplificación de las uniones genoma de vector con un tamaño de fragmento definido para cada unión. El tamaño de los fragmentos individuales de PCR depende de la distancia entre la ubicación de la ADN conocida en el genoma y el sitio de reconocimiento de enzima de restricción más cercano. Esto permite la visualización de la diversidad de uniones amplificados en muestras analizadas por electroforesis en gel, por ejemplo., Aunque sólo sea sola (monoclonales), varios (oligoclonales), ...

Discusión

La técnica de LAM-PCR permite la identificación de secuencias de ADN desconocidas que flanquean una región de ADN conocida. Debido a la alta sensibilidad resultante de preamplificación de las uniones con cebadores específicos de hibridación en la secuencia de ADN conocida, es posible amplificar y detectar incluso uniones raras hasta el nivel de una sola célula. Contrariamente, en una situación policlonal LAM-PCR es capaz de amplificar miles de diferentes uniones en una sola reacción.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Taq DNA Polymerase	Genaxxon Bioscience GmbH	M3001.5000	Alternative Taq Polymerases may be used
PCR Buffer	Qiagen	201203	Use of this buffer is recommended
dNTP-Mixture	Genaxxon Bioscience GmbH	M3015.4020	or any other dNTPs
Oligonucleotides (Primers)	MWG Biotech		HPLC purified
Dynabeads M-280 Streptavidin	Invitrogen	11206D
PBS	Gibco	14190-086	0.1% wt/vol BSA
6 M LiCl	Roth	3739.1	10 mM Tris-HCl (pH 7.5)/1 mM EDTA
Tris-HCl, pH 7.5	USB Corporation	22637	or any other supplier
EDTA	Applichem	A1103,0250	or any other supplier
Klenow Polymerase	Roche Diagnostics	10104523001
Hexanucleotide mixture	Roche Diagnostics	11277081001
Restriction endonuclease	NEB		or any other supplier
Fast-Link DNA ligation kit	Epicentre Biotechnologies	LK11025
CircLigase ssDNA Ligase Kit	Epicentre Biotechnologies	CL4111K
NaOH	Sigma-Aldrich	72068	or any other supplier
Agarose LE	Roche Diagnostics	11685660001	or any other supplier
TBE buffer	Amresco	0658	or any other supplier
Ethidium bromide	Applichem	A2273,0005	Ethidium bromide is mutagenic
100 bp DNA Ladder	Invitrogen	15628-050	or any other DNA ladder
20 mM NaCl	Sigma-Aldrich	71393-1L	or any other supplier
Magna-Sep Magnetic Particle Separator	Life Technologies	K158501	for use with 1.5 ml Tubes
Magna-Sep Magnetic Particle Separator	Life Technologies	K158696	for use with 96-well plates
Amicon Ultra-0.5, Ultracel-30 membrane	Millipore	UFC503096
PerfectBlue Gelsystem Midi S	PeqLab	40-1515	or other electrophoresis system
TProfessional 96	Biometra	050-551	or other Thermocycler for 96-well plates
Orbital shaker KS 260 basic	IKA	2980200	or other horizontal shaker
PCR softtubes 0.2 ml	Biozym Scientific GmbH	711082	or other 0.2 ml PCR tubes
1.5 ml tubes	Eppendorf	12682	or other 1.5 ml tubes
Gel documentation system	PeqLab		or any other gel documentation system
Nanodrop ND-1000 spectrophotometer	Thermo Scientific	ND-1000
Spreadex EL1200 precast gel	Elchrom Scientific	3497
Submerged gel electrophoresis apparatus SEA 2000	Elchrom Scientific	2001E
2100 Electrophoresis Bioanalyzer	Agilent Technologies	G2939AA