Un modelo de ratón para Patógenos inducida inflamación crónica en los sitios locales y sistémicos

Resumen

Los modelos animales han demostrado ser herramientas muy valiosas en la definición de mecanismos de acogida y de patógenos específicos que contribuyen al desarrollo de la inflamación crónica. Aquí se describe un modelo de ratón de infección oral con el patógeno humano Porphyromonas gingivalis y metodologías detalle para evaluar la progresión de la inflamación en sitios locales y sistémicos.

Resumen

La inflamación crónica es un importante motor de daño tisular patológica y una característica unificadora de muchas enfermedades crónicas en los seres humanos incluyendo neoplásicas, autoinmunes y enfermedades inflamatorias crónicas. Nuevas pruebas implica la inflamación crónica inducida por patógenos en el desarrollo y la progresión de enfermedades crónicas con una amplia variedad de manifestaciones clínicas. Debido a la etiología compleja y multifactorial de la enfermedad crónica, el diseño de experimentos para la prueba de la causalidad y el establecimiento de vínculos mecanicistas es casi imposible en los seres humanos. Una ventaja de la utilización de modelos animales es que tanto los factores genéticos y ambientales que pueden influir en el curso de una enfermedad en particular pueden ser controlados. Por lo tanto, el diseño de modelos animales relevantes de la infección representa un paso clave en la identificación de patógenos de acogida y mecanismos específicos que contribuyen a la inflamación crónica.

Aquí se describe un modelo de ratón de infla crónica inducida por patógenosmmation en sitios locales y sistémicas después de la infección con el patógeno Porphyromonas gingivalis vía oral, una bacteria estrechamente asociada con la enfermedad periodontal humano. La infección oral de ratones libres de patógenos específicos induce una respuesta inflamatoria local que resulta en la destrucción de hueso alveolar de soporte del diente, un sello distintivo de la enfermedad periodontal. En un modelo de ratón establecido de la aterosclerosis, la infección con P. gingivalis acelera deposición de la placa inflamatoria dentro del seno y innominada arteria aorta, acompañada por la activación del endotelio vascular, un aumento del infiltrado de células inmunes, y elevada expresión de mediadores de la inflamación dentro de las lesiones. Nos metodologías de detalle para la evaluación de la inflamación en los sitios locales y sistémicos. El uso de ratones transgénicos y mutantes bacterianas definidas hace que este modelo particularmente adecuados para identificar tanto huésped y factores microbianos implicados en la iniciación, progresión, y el resultado de la enfermedad. AdditionallY, el modelo puede ser utilizado para la detección de nuevas estrategias terapéuticas, incluyendo la vacunación y la intervención farmacológica.

Introducción

La inflamación crónica es un importante motor de daño tisular patológica y una característica unificadora de muchas enfermedades crónicas en los seres humanos. Estas enfermedades incluyen neoplásicas, autoinmunes, y enfermedades inflamatorias crónicas ^1. La etiología de muchas enfermedades crónicas no está clara, pero se entiende que es complejo y multifactorial, que involucra tanto la predisposición genética y la introducción de factores ambientales. Mientras que los perpetradores de la inflamación siendo difícil de alcanzar, los perfiles celulares y moleculares de la activación inmune se solapan considerablemente con los patrones observados en las respuestas del huésped a patógenos ^2.

La evidencia creciente implica la infección con patógenos microbianos en el desarrollo y progresión de la inflamación crónica y la diversidad de sus manifestaciones clínicas ^2,3. Los patógenos pueden inducir y mantener la inflamación crónica directamente por subvertir el sistema inmune del huésped y el establecimiento de infecciones persistentes ^{4. En la ausencia de persistencia microbiana, la infección puede precipitar inflamación crónica de las reacciones autoinmunes provocadas por mimetismo molecular a auto-antígenos, cambios en la auto-antígenos que las hacen inmunogénica, o el daño que libera antígenos del huésped previamente enmascarados. Rara vez, sin embargo tienen patógenos específicos sido identificados como la causa universal de una enfermedad crónica particular. Más bien, la mayoría de los datos disponibles sugieren que los patógenos usan distintos mecanismos para provocar la inflamación crónica con un amplio espectro de manifestaciones clínicas y de las enfermedades de la genéticamente susceptibles host 3. Por lo tanto, una comprensión detallada de los mecanismos por los que los agentes patógenos específicos inducen la inflamación crónica puede tener importantes implicaciones para la salud pública, así como el tratamiento y la prevención de muchas enfermedades crónicas.}

Aunque los mecanismos específicos de acogida y de patógenos que contribuyen a la inducción y mantenimiento de la inflamación crónica sonpoco conocidos, los avances en la modelización de la inflamación crónica inducida por patógenos han comenzado a avanzar en nuestra comprensión de estos procesos. El P. gingivalis modelo de infección oral es un modelo de ratón único, bien caracterizado de la inflamación crónica inducida por patógenos que permite el análisis de patógenos de acogida y mecanismos específicos que contribuyen a la inflamación crónica en el (la pérdida de hueso bucal) locales y sitios sistémicos (aterosclerosis) ^5,6.

P. gingivalis es un patógeno anaerobio oral de Gram-negativos implicados en la enfermedad periodontal humano, una enfermedad inflamatoria crónica infección impulsada caracterizado por la destrucción de los tejidos de soporte del diente ^7. Además de la patología en el sitio inicial de la infección, acumulación de pruebas implica P. gingivalis inducida por la inflamación crónica en el desarrollo y progresión de enfermedades sistémicas, incluyendo la aterosclerosis ^5, una enfermedad caracterizada por inflammatio crónican de la pared del vaso arterial. La infección oral de patógenos específicos ratones libres con P. gingivalis induce una respuesta inflamatoria local que resulta en la destrucción de hueso alveolar de soporte del diente ^8. P. gingivalis puede recuperarse de las bocas de los ratones infectados hasta 42 días después de la infección ⁸ y ratones desarrollar altos niveles de títulos de anticuerpos séricos específicos de patógenos ^9. En un modelo de ratón de la aterosclerosis establecida usando la apolipoproteína-E ^{- / -} ratones (ApoE ^{- / -),} la infección oral con P. gingivalis induce inflamación crónica que conduce a la deposición de placas inflamatoria dentro del seno aórtico ¹⁰ y la arteria innominada ^11. Inflamación progresiva dentro de la arteria innominada de P. gingivalis infectados ratones pueden ser controlados en animales vivos que utilizan en la RM vivo. Histológicamente, las lesiones arteriales de P. gingivalis infectados ratones muestran una mayor acumulación de lípidos acomacompañada de la activación del endotelio vascular, un aumento del infiltrado de células inmunes, y elevada expresión de mediadores inflamatorios ^12. El uso de este modelo en ratones knockout ha dilucidado el papel de los componentes de señalización de acogida y mediadores de la inflamación, así como la célula interacciones específicas que impulsan P. gingivalis inducida inmunopatología ^{12 - 14.} Además, los experimentos que utilizan mutantes bacterianas definidas han identificado P. crítico gingivalis factores de virulencia que contribuyen a la inflamación crónica en los sitios locales y sistémicos ^15.

Este artículo detalla metodologías para la evaluación de P. gingivalis inducida por la inflamación crónica en los sitios locales y sistémicos. Proporcionamos un protocolo detallado para el análisis de la pérdida de hueso alveolar por microCT utilizando el software Amira. Además, se define la utilidad de la serie vivo MRI animal vivo en la evaluación de progresivo eninflamación dentro de la arteria innominada. Incluimos metodologías para la visualización y cuantificación de placa inflamatoria en las lesiones arteriales, y describimos su caracterización histológica. El uso de ratones transgénicos y mutantes bacterianas definidas hace que este modelo particularmente adecuados para identificar tanto huésped y factores microbianos implicados en la iniciación, progresión, y el resultado de la enfermedad. Además, el modelo se puede utilizar para la detección de nuevas estrategias terapéuticas, incluyendo la vacunación y la intervención farmacológica.

Protocolo

1. Crecimiento y cultivo de bacterias

1. Racha congelado existencias de P. gingivalis 381 en placas de agar sangre anaerobio y se incuba durante 3 - 5 días en una cámara anaeróbica (10% H _2/10% CO _2/80% N ₂₎ a 37 ° C.
2. Usa los organismos de placa crecido para inocular 5 ml de cultivos líquidos de infusión de cerebro y corazón caldo (BHI) suplementado con extracto de levadura (0,5%), hemina (10 g / ml), y la menadiona (1 g / ml). Tras el crecimiento O / N, transferir las culturas 5 ml en 45 ml de BHI.
3. Incubar los 50 ml de cultivos líquidos en condiciones anaerobias para un additional18 - 24 hr y la cosecha a mediados de la fase logarítmica tardía. NOTA La pureza de la cultura siempre debe ser verificada mediante tinción de Gram antes de introducir bacterias en animales.
4. Cosechar las bacterias por centrifugación a 7000 xg durante 10 min. Aspirar el sobrenadante y resuspender completamente el sedimento celular bacteriano en 5 ml de PBS utilizando una pipeta serológica. Añadir un adicional45 ml de PBS y centrifugar a 7000 xg durante 10 min. Repita este paso dos veces para un total de tres lavados.
5. Después del último lavado, resuspender el sedimento celular en PBS tal que una dilución 1:10 de la cultura tiene una densidad óptica de 1,0 a 660 nm (un OD ₆₆₀ de 1 es equivalente a 10 ⁹ UFC / ml). Pesar suficiente carboximetilcelulosa (viscosidad media) para lograr un 2% w solución / v (por ejemplo, 0,1 g por 5 ml de cultivo). Agregar lentamente la carboximetil celulosa de la suspensión bacteriana mientras vórtex a fin de evitar la formación de grumos.

2. Infección Oral

NOTA: Como se ilustra en la Figura 1, utilizando el modelo de ratón apropiada y el régimen de la infección oral, P. gingivalis induce la inflamación crónica y la inmunopatología al (cavidad oral) local y sitios sistémicos (arterias).

1. Administrar sulfametoxazol (0,87 mg / ml) y trimetoprim (0,17 mg / ml) (Sulfatrim) a seis a 8 semanas-old ratones machos ad libitum en el agua de bebida durante 2 semanas para reducir la flora normal. Mantenga la solución de antibióticos en frascos de vidrio ámbar y protegerlo de la luz para evitar la degradación.
2. Para evitar la sedimentación de la solución de antibiótico, agitar las botellas una vez o dos veces al día (es decir, por la mañana y por la tarde). Reemplace con una solución recién preparada cada 3 - 5 días.
3. Después de dos semanas, sustituir la solución de antibiótico con el agua potable convencional. Permitir un período de descanso de antibióticos de 2 días antes de la infección oral.
4. Cargue el P. gingivalis / vehículo de suspensión en una jeringa de tuberculina de 1 ml con una aguja de alimentación adjunto. Restringir manualmente el ratón por el pescuezo en la parte posterior de su cuello. Asegúrese de que el agarre sea lo suficientemente firme para restringir la movilidad de la cabeza del ratón.
5. Infectar ratones por aplicación tópica de P. gingivalis en la superficie bucal de los maxilares. Coloque la aguja de alimentación tales That está alineado con la superficie bucal de los molares superiores derecho e expulsar 50 ul de la suspensión bacteriana. Dispersar la solución suavemente a lo largo de la encía durante 1 min utilizando el balón de la aguja de alimentación.
6. Deje que el ratón para descansar por un período de 30 segundos a 1 minuto antes de repetir el procedimiento en el maxilar superior izquierdo. Los ratones de control reciben el pretratamiento con antibióticos y sonda oral con vehículo solo (2% de carboximetilcelulosa en PBS).
7. Para examinar la inflamación crónica inducida por patógenos en los sitios locales inducidas pérdida de hueso alveolar mediante la infección de ratones 3 veces a intervalos de 2 días. Sacrificar los ratones 6 semanas más tarde para la evaluación de la pérdida de hueso por microCT.
8. Para examinar la inflamación crónica inducida por patógenos en los sitios locales y sistémicos, infectar-aterosclerosis propensos ApoE ^{- / -} ratones 5 veces a la semana durante 3 semanas.
   NOTA: La progresión de la enfermedad en la arteria innominada es monitoreado por MRI en serie in vivo. Ratones de la imagen en diferentes puntos de tiempo y sacrificio 6-16 wks tarder. En el momento del sacrificio, evaluar la carga aterosclerótica global en el análisis de la cara y determinar la pérdida de hueso alveolar por microCT. Caracterizar las lesiones ateroscleróticas por histología e inmunohistoquímica.

3. Micro-tomografía computarizada (microCT)

1. Preparación de Muestras
   1. Sacrificar los ratones en el punto de tiempo deseado después de la infección. La eutanasia a los ratones por CO ₂ asphyxation o por otro método aprobado por el animalario de la institución.
      NOTA: Recoger la sangre por punción cardiaca, separar el suero, y almacenar a -80 ° C para el análisis de IgG anti-P.gingivalis como se describe en otro lugar ^9.
   2. Utilice un gran par de tijeras de decapitación a severo de la cabeza del ratón en la base del cráneo. Retire la carne con un par de pinzas y colocar el cráneo en un tubo cónico de 50 ml que contiene 30 ml de paraformaldehído al 4% tamponada. Fijar la muestra durante 24 - 48 horas a 4 ° C.
   3. Tras la fijación, rinse la muestra a fondo con PBS.
   4. Crear biopsias bloque maxilares.
   5. Guarde el hemi-maxilar en el grado histológico 70% EtOH a 4 ° C hasta su evaluación por microCT.
2. Adquisición de imágenes
   1. Realizar adquisiciones de imágenes utilizando un escáner microCT escritorio. Ajuste la fuente de rayos X a una corriente de 114 μA y un voltaje de 70 kV. Cargue hemi-maxilares individuo en el recipiente de formación de imágenes y escanear con una resolución de 12 micras en las tres dimensiones espaciales.
      NOTA: Cargue varias-maxilares hemi simultáneamente dentro de la vasija de formación de imágenes.
   2. Realizar un análisis preliminar de baja resolución que permite al usuario para delinear los límites para la adquisición de imágenes y restringir la exploración a la región de interés (ROI) utilizando el sistema.
      NOTA: La intensidad del esmalte hace que la corona de los molares maxilares fácilmente distinguibles. El uso de los molares como una guía que está suelta sobre las fronteras de imagen para abarcar los tres molares y el bon alveolar que rodeae. Esta función también se utiliza para discriminar entre hemi-maxilares individuo al escanear múltiples muestras dentro del mismo recipiente.
   3. Cuando haya finalizado la digitalización, convertir los archivos de imagen RAW (.ISQ) en DICOMs de alta calidad (.dcm).
3. Análisis de Imagen
   En este protocolo, se realiza el análisis de imágenes usando una visualización de datos, el procesamiento y el software de análisis. En primer lugar, utilice hitos morfológicos para crear un plano de mejor ajuste para la unión cemento-esmalte (CEJ). A continuación, utilice el de transformar el hemi-maxilar en una orientación estándar para la posterior medición de volumen de hueso alveolar.
   1. Abra el programa y haga clic en el icono "Open Data" que se encuentra en la esquina superior izquierda de la piscina. Como alternativa, utilice Archivo> Abrir datos.
   2. Seleccione la imagen de pila DICOM y haga clic en Cargar. Aparecerá la ventana DICOM Loader. Haga clic en Aceptar.
   3. Observe el conjunto de datos como un icono verde en la piscina. Tenga en cuenta que al hacer clic en el objeto de datos provoca adicional, perotoneladas que se mostrarán en el área de botones en la parte superior de la piscina. Al seleccionar el icono también causa cierta información sobre el registro de datos que se mostrarán en el área Propiedades.
   4. Cada icono de la piscina ofrece un menú desplegable desde el que se pueden seleccionar diferentes módulos. Activar el menú emergente, haga clic en la flecha blanca en la esquina derecha del icono de datos. En el marco del módulo de la pantalla, seleccione Isosuperficie (Pantalla> Isosuperficie). El Icono Isosuperficie aparecerá en la zona de la piscina. Cuando se selecciona, aparecen más ajustes en el área de Propiedades.
   5. Defina el estilo de dibujo para transparente y el Umbral de 2000. Asegúrese de que el compactar y reducir la resolución de los botones se seleccionan en Opciones. Bajo Normal, asegúrese de x, y, z son todos establece en 2 Haga clic en Aplicar para generar la isosuperficie.
      NOTA: Se deben observar una reconstrucción 3D transparente de la hemi-maxilar en el visor 3D. El beneficio de usar un estilo sorteo transparente para la reconstrucción de imágenes es que las raíces de los molares puedeser fácilmente identificados. Esto será importante al poner la muestra en la orientación normal.
   6. Seleccione el icono verde de datos y en el Área de Propiedades seleccione el icono de recorte. Observar una ventana que muestra las dimensiones y coordenadas de los datos. Establezca este lado por ahora. Observe que un cuadro de delimitación aparece en el visor 3D con lengüetas verdes en cada esquina.
   7. Seleccione el botón Interact en la barra de herramientas del visor. Modificar el tamaño del cuadro delimitador haciendo clic y arrastrando las esquinas verdes. Asegúrese de que el cuadro abarca la región de interés (ROI) y elimina todo el espacio muerto y otros desechos como sea posible. Esto reducirá la demanda computacional en el equipo.
   8. Utilice el botón Trackball en la barra de herramientas espectador a girar el objeto en el visor 3D asegurando el retorno de la inversión está completamente abarcada por el cuadro delimitador. Una vez satisfecho, haga clic en Aceptar en la ventana de recorte a un lado en el paso 8.
   9. Seleccione el icono de los datos y en el módulo de visualización seleccione Oblique rebanada (OBS). (Pantalla> OBS)
   10. Seleccione la OBS. En el área de propiedades, establezca el tipo de asignación a lineal, el rango de la ventana de datos de -200 a 10.000, y la toma de muestras para mejor. Ahora seleccione Girar en las opciones. Observar una palanca de rotación en el centro de la OBS.
   11. Seleccione el botón interactúan en la barra de herramientas espectador y utilizar los mangos de la palanca para ajustar el plano de corte de la loncha. Crear un plano sagital que corre paralela a las raíces de los dientes y perpendicular a la superficie oclusal de los dientes. El plano debe dividir en dos de los tres molares (M1-M3), como se ilustra en la Figura 2.
   12. Apague rotar y duplicar la OBS (object> objeto duplicado). Un nuevo OBS aparece nombrado OBS 2 Encienda rotar durante OBS 2.
   13. Utilice el controlador de giro para reorientar OBS 2 de modo que quede perpendicular con OBS 1 (ver Figura 2).
   14. Encienda girar fuera de OBS 2 y 3 rebanadas crear duplicados. Estos serán nombrar OBS 3, 4, y 5.
4. Recogiendo Puntos para el Plano de Best Fit
   NOTA: Los pasos 3.4.1-3.4.5 describen la ubicación de 8 puntos a lo largo del CEJ crea un plano de mejor ajuste. Elige cuatro de los puntos de cortes sagitales y los otros cuatro de cortes coronales (ver Figura 3). Al escoger puntos situados en cortes sagitales en 3.4.6, puede ser necesario ajustar OBS 1.
   1. Alinear OBS 1 con el centro de la raíz mesial más de M1 en el plano sagital. Alinear OBS 2 con el centro de la raíz mesial más de M1 en el plano coronal.
   2. Alinear OBS 3 con el centro de la raíz distal del buco-M1 en el plano coronal. Si es necesario, ajustar OBS 1 de modo que es de aproximadamente centrada con la raíz buco-distal del M1 en el plano sagital en la selección de puntos en el Paso 20.
   3. Alinear OBS 4 con la furca de las raíces vestibulares de M2. OBS 4 debe estar centrado entre las raíces buco-mesiales y buco-distales de M2. Si es necesario, ajuste el ingenio OBS 1 para que quede aproximadamente centradoh la raíz buco-distal de M2 ​​en el plano sagital en la selección de puntos en el Paso 20
   4. Ajuste OBS 5 para que se ejecute en el centro de M3 en el plano coronal. Si es necesario, ajustar OBS 1 de modo que es de aproximadamente centrada con la raíz más distal de M3 en el plano sagital en la selección de puntos en el Paso 20.
   5. Duplicar cualquiera de los OBSS (OBS 6) y seleccione Ajustar a puntos en la ventana de propiedades. El ajuste de los puntos de alternar permite al investigador a recoger 3 o más puntos en 2D o 3D objetos dentro del visor y luego calcula un plano de mejor ajuste. En este caso, los OBSS 2D descritos en los pasos anteriores se utiliza para seleccionar 8 puntos a lo largo de la UAC.
   6. Ocultar OBS 6 del visor 3D haciendo clic en el cuadro de color naranja en la esquina derecha del icono de datos. Ocultar la isosuperficie del visor 3D para que el CEJ visible en todas las cortes 2D. Mayús + clic y seleccione los 8 puntos a lo largo del CEJ como se describió anteriormente.
      NOTA: Si la tecla Mayúsculas no se mantiene pulsada la hora de seleccionarpuntos, un avión automáticamente se calculará después de los tres primeros puntos.
   7. Después de seleccionar los 8 puntos, hacer visible OBS 6. Tenga en cuenta que este es un corte axial que discurre aproximadamente paralela al plano oclusal.
5. Transformación y Reorientación NOTA: El plano de mejor ajuste se utiliza para transformar los datos en una orientación estándar para mediciones volumétricas posteriores.
   1. Haga clic en Icono de datos> Calcular> ApplyTransform. El icono ApplyTransform aparece en el área de la piscina. Haga clic en el cuadrado blanco en la esquina del icono ApplyTransform, seleccione de referencia, y haga clic en OBS 6.
   2. En el área Propiedades, seleccione estándar para el método de interpolación y prorrogado por el modo. Aplicar la transformación.
   3. Crear una isosuperficie y OBS coronal para el nuevo archivo de datos. Girar las OBS en la dirección axial tal que es aproximadamente perpendicular con M1 (que se muestra en la Figura 2). Utilice las cúspides de los molares y la oclusal curvatures como guía.
   4. Utilice este plano para transformar los datos como en los pasos 3.5.1 y 3.5.2. Guarde el archivo de datos transformados.
6. Segmentación y volumen óseo Medición
   NOTA: Los pasos siguientes describen la segmentación y medición del hueso alveolar. La porción correspondiente al plano de mejor ajuste para la CEJ se identifica y se elige un plano de referencia. El hueso alveolar entre el CEJ y el plano de referencia en la cara vestibular de los molares se segmenta y mide. La raíz más mesial de M1 y la raíz más distal de M3 sirven como puntos de referencia de punto final. Ajuste del plano de referencia 15-20 rebanadas por debajo de la CEJ produce resultados óptimos. Inclusión de las rebanadas adicionales introduce variabilidad que máscaras diferencias en el volumen de hueso entre los grupos de tratamiento.
   1. Abra el Editor Segmentación y crear una nueva etiqueta para los datos transformados.
   2. Crear un nuevo material y el nombre del hueso alveolar.
   3. Bajo Zoom ventana y datos, el conjunto de datos Las pm -200 a 10.000.
   4. En Mostrar Masking y seleccionar el punto de mira en 2D, 3D MPR, y los iconos de volumen renderizado 3D. Ajuste el rango de datos de 2.500 a 8.000. Habilitar enmascaramiento de datos.
   5. Seleccione el ajuste de la barra de herramientas de visor de pantalla Cuatro espectadores. La pantalla se divide en cuatro cuadrantes que permiten el examen simultáneo de sagital, coronal y axial pilas de imágenes, así como el volumen 3d prestados.
   6. Utilice los cuatro cuadrantes para identificar el último segmento en el esmalte es visible en las caras vestibulares de M1 y M3. Esta ubicación se corresponde con el plano de mejor ajuste para la UAC. Anote el número de corte axial.
   7. En el plano axial, continúe 15-20 rebanadas hacia la cresta ósea alveolar. Esto representa el plano de referencia.
   8. Utilizar cualquier combinación de herramientas de segmentación para seleccionar hueso alveolar en la cara bucal de los molares entre el CEJ y el plano de referencia. Utilice la raíz más mesial de M1 y la raíz distal más de M3 como punto final de puntos de referencia.
   9. Una vez satisfecho, añadir la selección al hueso alveolar en la lista de materiales.
   10. Regresar a la agrupación de objetos. Un nuevo icono con la extensión ".Labels" se debe anexar al icono de datos de la imagen. Seleccione el icono de las etiquetas y en el menú desplegable, seleccione Materiales> MaterialStatistics.
   11. En el área de propiedades, seleccione Material y pulse Aplicar. Aparece una tabla que muestra varios parámetros para cada material en la lista de materiales. Registre el volumen de hueso alveolar.

4. Evaluación de aterosclerosis

1. Disección aórtica
   1. Sacrificar el ratón por asfixia de CO ₂ en el punto de tiempo deseado después de la infección.
   2. Coloque el ratón en la parte dorsal, cinta hacia abajo y limpie el ratón con EtOH al 70%. Cortar la piel en el lado ventral desde el centro del abdomen justo por encima del proceso xifoides.
   3. Cortar la piel abdominal hasta que el proceso xifoides es visible. Levante el proceso xifoides con una pequeña paIR de fórceps, hacer cortes a cada lado de la caja torácica, y se corta el diafragma. A continuación, hacer dos cortes a cada lado de la caja torácica para exponer el corazón.
   4. Exsanguinate el ratón utilizando una jeringa de insulina 27 T colocado en el ápice del ventrículo derecho. Durante la recogida de sangre, rotar periódicamente la aguja para evitar el bloqueo de la abertura por la pared ventricular. Típicamente, 0,8 a 1 ml de sangre se pueden obtener utilizando este método.
   5. sup> NOTA: Separar el suero y se almacenan a -80 ° C para el análisis de IgG anti-P.gingivalis como describen en otra parte ⁹
   6. Use las tijeras para quitar la aurícula derecha.
   7. Localice el ventrículo izquierdo en el lado posterior del corazón. Introducir una aguja de calibre 21 en el ápex del ventrículo izquierdo, con el bisel de la aguja hacia el centro de la cámara y enjuagar lentamente el sistema circulatorio con 3 - 5 ml de fijador de tejidos.
   8. Recorte la grasa y el timo que rodea el corazón.
   9. Retire el luNGS.
   10. Localice el arco aórtico con las tres ramas y despejar rodean las capas de grasa para una mejor exposición.
   11. Continuar la disección de la aorta del arco a la base del diafragma.
   12. Retire el hígado y desplazar el tejido intestinal para exponer la aorta descendente. Diseccionar los aorta distal a las ramas de la arteria renal.
   13. Cortar las arterias renales y continuar la disección hasta la bifurcación ileal.
   14. Una vez que la aorta está libre de la mayoría de los tejidos conectivos, vuelva a la parte superior de la aorta y cortar la parte superior de las tres ramas de la aorta por encima del corazón.
   15. Peel corazón hacia arriba, cortando los tejidos subyacentes de grasa a fin de separar el corazón del cuerpo.
   16. Sostenga el corazón con unas pinzas y tire hacia arriba, cortando el tejido conectivo que todavía puede estar unido, y continuar hasta los riñones y seguir hasta las piernas y cortar en el punto más bajo posible.
   17. Fijar aorta en 10% de formalina durante 1 hora con un subsiQuent PBS lavar durante 1 hora. Alternativamente, tienda de aorta en el 10% formalina O / N, enjuague en PBS el día siguiente y continuar con la disección.
   18. Coloque aorta en una placa Petri de 10 cm que contiene PBS.
   19. El uso de un microscopio de disección, retire con cuidado el tejido de la adventicia de la aorta.
   20. Cuando aorta es libre de exceso de grasa y tejido, corte inferior dos tercios de corazón. Iniciar la peladura músculo del corazón de distancia en el extremo del corazón opuesto del arco aórtico. El bulbo de la aorta debe aparecer lentamente, que será blanco en la coloración.
   21. Continuar disección cuidadosa utilizando dos pinzas hasta bombillas aórticos son libres de tejido del músculo cardíaco.
   22. Coloque aorta limpiado en una bandeja de disección negro y cubrir con PBS.
2. Fijación de Aorta
   1. Mantenga aorta cubierto de PBS en todo el fijar.
   2. Coloque aorta en posición anatómica con bombillas de aorta a la izquierda.
   3. Coloque pasadores minutien temporales en 5 lugares a partir de 1) la parte superior de la aorta, 2) por debajo de la tercerarama del arco, 3) a mitad de camino de la aorta descendente 4) cerca del extremo inferior de la aorta descendente 5) por encima de la rama de la arteria femoral.
   4. Usando tijeras de primavera extrafinos, cortado lado izquierdo de la aorta, a partir de la rama izquierda de la arteria femoral hasta llegar hasta la aorta a la rama más baja por debajo de la aorta ascendente.
   5. Cortar hacia la izquierda desde el lado más bajo de bulbo de la aorta en la grieta y continuar corte para llegar a la intersección de corte a lo largo corte vertical de la aorta.
   6. Córtese la aorta horizontalmente para llegar al punto de la rama más baja de la aorta ascendente
   7. Cortar hacia arriba en el lado derecho de arriba más alta rama de la aorta.
   8. Corte cada rama para exponer su superficie interna.
   9. Quite algunos de pasadores temporales y reemplazar con alfileres permanentes con el objetivo de la fijación abajo todo aorta en la localización anatómica y sin doblar, estirar de la aorta. El objetivo es exponer a la superficie interior de la aorta.
   10. Continuar fijando hasta toda la superficie interior de la aorta está expuesta y claramente visible desde arriba y sin int visualerference de alfileres.
3. Lipid tinción y cuantificación de la lesión
   1. Prepare la solución de tinción Sudan IV (5 mg / ml en el 70% de isopropanol). Mezclar bien y filtrar para asegurar que no están presentes cristales.
   2. Cubierta aorta fijado en solución IV Sudán durante 50 min.
   3. Lavar con 70% de isopropanol durante 1 - 5 min. Enjuague suavemente aorta con ddH20 hasta que el agua que sale de la aorta ya no es rojo.
   4. Cubra aorta con PBS. Captura imágenes de la aorta con una cámara de alta resolución que se adjunta a un microscopio de disección y guardar archivos de imagen como digitales (.TIFF). Coloque una regla al lado de la imagen para ayudar en la calibración.
   5. Utilice el software ImageJ para determinar el área de la íntima y el área de las lesiones. Trazar manualmente la superficie de la íntima para determinar el área. Área de la lesión puede ser calculado usando umbralización automatizada color. Esto requiere el establecimiento de un umbral para definir una intensidad de color que discrimina las lesiones de las zonas normales.
   6. Calcular el porcentaje de lasuperficie de la íntima cubierta por lesiones ateroscleróticas.

5. evaluación histológica de las lesiones ateroscleróticas

1. Coseche arco aórtico con el tejido del corazón y sumergirse en octubre en un molde base desechable.
2. Recoger 5 micras cryosections serie cada 50 micras en el seno y innominada aorta arteria utilizando un criostato puesta a -17 ° C y montar las secciones de tejido en el microscopio. Tienda desliza a -20 ° C hasta su uso posterior.
3. Para la evaluación histológica, tinción con hematoxilina y eosina utilizando los procedimientos adecuados.

6. inmunohistoquímica Caracterización de las lesiones ateroscleróticas.

Los pasos siguientes describen un protocolo basado en anticuerpos general empleada rutinariamente para evaluar las lesiones ateroscleróticas en P. gingivalis infectados ratones. Este protocolo requiere la optimización para cada anticuerpo o reactivo.

1. Retirar los portaobjetos del congelador y fijardurante 2 min en fijador enfriado con hielo (acetona u otro fijador).
2. Permitir diapositivas vengan a RT y etiquetar con un lápiz resistente a los solventes.
3. Enjuague desliza 3x en PBS para eliminar la matriz de congelación de tejido
4. Bloquear la actividad peroxidasa endógena por incubación de los portaobjetos en 0,3% de H ₂ O ₂ solución en PBS durante 10 min.
5. Enjuague desliza 3x en PBS durante 2 minutos cada vez.
6. Bloquear la unión no específica mediante incubación en tampón de bloqueo (10% de suero de conejo en PBS) durante 30 min a TA.
7. Diluir el anticuerpo primario 1:50 en 10% de suero de conejo.
8. Aplicar el anticuerpo diluido a las secciones de tejido en la diapositiva.
9. Incubar durante 1 hora a TA.
10. Enjuague desliza 3x en PBS durante 2 minutos cada uno.
11. Diluir anti-rata biotinilado anticuerpo secundario 1: 100 en 10% de suero de conejo.
12. Aplicar a las secciones de tejido en la diapositiva y se incuba durante 30 minutos a temperatura ambiente.
13. Enjuague desliza 3x en PBS durante 2 minutos cada uno.
14. Prepare la solución de sustrato DAB agregando1 gota de cromógeno DAB a cada tampón DAB 1 ml.
15. Escurrir PBS de las diapositivas y aplicar la solución de sustrato DAB. Permitir diapositivas incubar durante 5 min o hasta que se alcanza la intensidad de color deseada.
16. Lave 3 veces en agua durante 2 minutos cada uno.
17. Mancha Contador con hematoxilina.
18. Deshidratar a través de 4 cambios de alcohol (95% 1 min, 95 min, 1% 100% 1 min y 100% 5 min).
19. Claro en 3 cambios de xileno.
20. Cubreobjetos usando solución de montaje y analizar cualitativamente por microscopía. Para el análisis cuantitativo, adquirir imágenes y calcular el área de tinción con ImageJ usando un umbral automatizado.

7. MRI

1. Preparación de los animales para la RM
   1. Anestesiar a los ratones antes de los experimentos de resonancia magnética. Realice la inducción inicial de la anestesia utilizando 4% isofluorane vaporizado durante 2-3 minutos en una cámara de inducción. Mantener la anestesia durante el período de formación de imágenes utilizando un flujo continuo de 0,5 a 2% vaporiza delivere isofluoranod a través de una configuración de cono de la nariz o una máscara.
   2. Después de alcanzar el plano quirúrgico de anestesia (es decir, no hay respuesta pizca dedo del pie), coloque el ratón en un titular de animal con su nariz se inserta en un cono de la nariz. Hay varios tipos de soportes de animales disponibles comercialmente que se pueden utilizar para minimizar el movimiento potencial durante la exploración. Utilizamos un soporte diseñado a medida con una barra de bocado.
   3. Monitorear la respiración y el ciclo cardíaco y sincronizar con la adquisición de imágenes usando una almohada respiración (colocado en el abdomen del ratón) equipado con un pequeño sistema de vigilancia de los animales y gating.
   4. Asegure el sistema de monitoreo del ratón y en el soporte de los animales con la película de laboratorio.
2. Adquisición de datos MRI
   1. Coloque el soporte de animal con la cabeza primero en una posición supina del ratón en una sonda vertical de 30 mm (Micro 2,5) mantenida a 23 ° C y en la vertical, de ánima 11,7 T escáner de resonancia magnética.
   2. Alinear el soporte con el centro de tque DLD bobina.
   3. Llevar a cabo un proceso de calce utilizando una única secuencia de pulsos.
   4. Mediante una secuencia RARE, adquirir imágenes de scouts a lo largo de tres orientaciones ortogonales para crear imágenes axiales, coronales y sagitales.
   5. Realice una angiografía por resonancia magnética de baja resolución (MRA) utilizando una secuencia de eco de gradiente 3D ungated con los siguientes parámetros: espesor de la losa = 1,5 cm; ángulo de inclinación = 45 °; tiempo de repetición = 20 ms; tiempo de eco = 2,2 ms; campo de visión = 1,5 × 1,5 × 1,5 cm; matriz = 64 × 64 × 64; número de Media = 1 tiempo de exploración Total: 2~3 min. El propósito de este análisis es asegurar que las imágenes se adquieren en la región de destino (la arteria innominada).
   6. Realice una alta resolución MRA de la arteria innominada con una secuencia de eco de gradiente 3D ungated usando los siguientes parámetros: espesor de la losa = 1,5 cm; ángulo de inclinación = 45 °; tiempo de repetición = 20 ms; tiempo de eco = 2,2 ms; campo de visión = 1,5 × 1,5 × 1,5 cm; matriz = 128 y# 215; 128 × 128; número de Media = 4. tiempo de exploración total fue de ~ 25 min.
   7. Obtener imágenes axiales continuas de la arteria innominada 0.5mm debajo de la bifurcación de la subclavia.
3. Análisis de datos de resonancia magnética
   1. Realizar reconstrucción de la imagen y el análisis usando software de imagen asociado con el escáner. Lograr la reconstrucción 3D de las imágenes de MRA por Proyección de intensidad máxima.
   2. Utilice la bifurcación subclavia como un marcador anatómico para alinear los datos adquiridos a partir de diferentes ratones o el mismo ratón en diferentes puntos temporales. Elija la sección transversal del objetivo de la arteria innominada en 0.3- a 0,5 mm de distancia por debajo del subclavianbifurcation.
   3. Definir y calcular el área luminal de la sección transversal elegida con ImageJ. Las mediciones deben ser realizadas de manera ciega por dos observadores independientes. Verifique reproducibilidad de medición mediante el cálculo de los coeficientes de correlación entre clases.
   4. Para los estudios longitudinales con imag serialING, normalizar área luminal a la zona de la luz obtenida en la línea base (la primera lata en el estudio) para cada ratón. Exprese los resultados como cambio en el área luminal a través del tiempo.
   5. Realizar los análisis estadísticos apropiados (es decir, prueba t de Student) para determinar las diferencias significativas entre los grupos experimentales.

Resultados

Usando el modelo de ratón apropiada y el régimen de la infección oral, P. gingivalis induce la inflamación crónica y la inmunopatología al (cavidad oral) local y sitios sistémicos (arterias) (Figura 1).

En ratones, la infección oral con P. gingivalis induce una respuesta inflamatoria local que conduce a la destrucción de hueso alveolar de soporte del diente ^8. P. gingivalis infectados ratones desarrollan respuestas de anticuerpo...

Discusión

El P. gingivalis modelo infección oral proporciona una valiosa herramienta para el estudio de la inflamación crónica inducida por patógenos en los sitios locales y sistémicos. Este modelo único permite la caracterización de ambos mecanismos específicos de acogida y patógenos que contribuyen a la inflamación crónica y la inmunopatología. Además, el modelo puede ser utilizado para la detección de nuevas estrategias terapéuticas, incluyendo la inmunización y la intervención farmacológica. Los pas...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amira analysis software	Visualization Sciences Group
Anaerobic chamber DW Scientific Model MG500	Microbiology International
BHI	Becton-Dickinson	211059
Hemin	Sigma-Aldrich	51280-5G
Menadione (Vitamin K)	Sigma-Aldrich	M5625-25G
Yeast Extract	Becton-Dickinson	212750
Carboxymethyl cellulose (medium viscocity)	Sigma-Aldrich	C-4888
Sulfamethoxazole and trimethoprim oral suspension 200 mg/40 mg per 5 ml	Hi-Tech Pharmacal	NDC 50383-823-16
μCT 40	Scanco
HistoChoice Tissue Fixative	Sigma-Aldrich	H2904
Sudan IV	Sigma-Aldrich	S4261-25G
Vertical-bore 11.7T Avance spectrometer	Bruker
Paravision	Paravision
ImageJ	NIH
Rat anti-mouse F4/80	Serotec	MCA497R
Rat anti-mouse TLR2	eBioscience	13-9021-80
Leica S4 dissecting scope	Leica
Microm HM 550 cryostat	Microm