Guiada por ecografía transtorácica intramiocárdica inyección en ratones

Resumen

Inyección intramiocárdica percutánea guiada por ecocardiografía representa una modalidad eficiente, fiable, y objeto de orientación para la entrega de agentes de transferencia de genes o células en el corazón murino. Siguiendo los pasos descritos en este protocolo, el operador puede convertirse rápidamente competente en esta técnica versátil, mínimamente invasivo.

Resumen

Los modelos murinos de enfermedad cardiovascular son importantes para la investigación de los mecanismos fisiopatológicos y la exploración de potenciales terapias regenerativas. Los experimentos que implican la inyección miocárdica se llevan a cabo actualmente por el acceso quirúrgico directo a través de una toracotomía. Aunque esto es conveniente cuando se realiza en el momento de otra manipulación experimental como la ligadura de la arteria coronaria, la necesidad de un procedimiento invasivo para la entrega intramyocardial limita posibles diseños experimentales. Con cada vez mejor resolución ultrasonido y técnicas de imagen no invasivas avanzadas, ahora es factible realizar rutinariamente guiada por ecografía, la inyección intramiocárdica percutánea. Esta modalidad ofrece eficiente y fiable agentes a una región específica del miocardio. Las ventajas de esta técnica son evitar la morbilidad quirúrgica, la facilidad para las regiones objetivo de miocardio selectivamente bajo control ecográfico, y la oportunidad de ofrecer a inyectar a la myocardium en múltiples intervalos de tiempo, predeterminadas. Con técnica practicada, complicaciones de la inyección intramiocárdica son raros, y los ratones regresar rápidamente a la actividad normal en la recuperación de la anestesia. Siguiendo los pasos descritos en este protocolo, el operador con experiencia básica ecocardiografía puede convertirse rápidamente competente en esta técnica versátil, mínimamente invasivo.

Introducción

La enfermedad cardíaca es la principal causa de muerte tanto para hombres y mujeres en los Estados Unidos, lo que representa 600.000 muertes al año ^1. Los modelos murinos de enfermedad cardiovascular son de importancia crítica para la investigación de los mecanismos fisiopatológicos y para explorar posibles terapias. Infarto de entrega de vectores de terapia génica, las células, los ARN modificados, y otros agentes terapéuticos permisos de investigación de su potencial terapéutico para la enfermedad cardíaca ^2-7 tallo. En la actualidad, hay opciones limitadas para la entrega infarto de agentes terapéuticos en modelos de ratón ^6. Inyección intramiocárdica bajo visualización directa se usa comúnmente, pero requiere una esternotomía o toracotomía y se limita a la región expuesta del corazón. Aunque esto es conveniente cuando se realiza en el momento de otra manipulación experimental, como la ligadura de LAD, la necesidad de un procedimiento invasivo para la entrega intramyocardial limita posibles diseños experimentales e introduce unefectos adicionales A partir del procedimiento (por ejemplo, la fibrosis debido a toracotomía). Entrega pericárdico percutáneo de vectores virales se ha informado, pero el sitio y la distribución de agente terapéutico no es homogénea y es difícil de controlar ^8. Resultados de inyección percutáneo de distribución más homogénea de material inyectado, pero la entrega coronaria eficiente y reproducible es un reto en modelos murinos.

A continuación, describimos una técnica de inyección cerrado pecho intramyocardial que permite al operador controlar la orientación mínimamente invasiva, de agentes terapéuticos bajo guía ecográfica. La técnica es fácil de aprender, evita la necesidad de toracotomía o esternotomía y sus complicaciones experimentales concomitantes, y proporciona una mayor flexibilidad en el calendario y los sitios de la inyección intramiocárdica. Por lo tanto, la inyección intramiocárdica ecocardiografía asistida representa un método técnicamente simple y altamente efectiva de manipular elmiocardio en modelos experimentales murinos.

Protocolo

Todos los pasos descritos se realizaron bajo los protocolos aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional del Hospital Infantil de Boston.

1. Preparación

1. Realizar la evaluación anatómica y funcional cardiaca por ecocardiografía línea de base antes de comenzar el protocolo de inyección, ya que la posición del transductor fijo óptimo para la inyección intramiocárdica puede no producir las vistas estándar óptimas para delinear la anatomía y la evaluación de la función.
2. La configuración de la inyección se muestra en las Figuras 1A-1C. Coloque una jeringa vacía con una aguja enfundada, orientada bisel hacia arriba, en la abrazadera de la jeringa (ver Figura 1C) y asegurar la sonda de transductor de ultrasonidos en la abrazadera de exploración de la cabeza (véase la Figura 1B). Aflojar el scan-cabeza de la articulación de bloqueo de bolas abrazadera (Figura 1B) y manipular la orientación del transductor de manera que está alineado en paralelo al eje de la aguja. Fijar el SCAN-posición de la cabeza apretando el conjunto de bloqueo de bolas abrazadera exploración de cabeza.
   NOTA: Para la inyección en ratones adultos, una aguja de 30 G con un 1 in / 2,5 cm de longitud es óptima. Una jeringa de 1 ml se puede utilizar para volúmenes más grandes, mientras que una jeringa estanca a los gases puede ser utilizado para un control más preciso de volúmenes más pequeños (5-10 l).
3. Aplicar gel de ultrasonido liberalmente a la punta del transductor con una espátula para cubrir la cabeza a lo largo de su totalidad. Desenvainar cuidadosamente la aguja y el uso de la aguja de montaje controles para avanzar la aguja justo debajo del transductor y en el gel de ultrasonido para la visualización. Hacer ajustes menores utilizando la aguja de montaje de control de modo que la aguja se visualiza claramente a lo largo de su longitud en la imagen de ultrasonido. Si el transductor se correctamente alineado paralelo a la aguja en el paso 1.4, a continuación, la aguja debe permanecer dentro del plano de la imagen a medida que avanza y se retira con el mando de control de la inyección (Figura 1C).
4. En etapas posteriores, no molestar la necesidadLE / transductor alineación horizontal moviendo ya sea en el eje horizontal. Más bien, apuntar a áreas específicas del corazón para inyección cambiando la posición vertical (eje y) de la aguja de montar y moviendo la plataforma animal.
5. Mueva el transductor superiormente desde la plataforma animal, mediante la exploración de control de altura (Figura 1B) para permitir la posterior colocación del ratón anestesiado en la plataforma animal. Esto no perturbar la alineación del eje x del transductor al eje largo de la aguja.
6. Retire la jeringa que se utilizó para la alineación de la abrazadera de la jeringa y desechar cuidadosamente. Cargue la aguja y jeringa con la sustancia inyectada al volumen de destino final, teniendo en cuenta el espacio muerto en la punta de la jeringa. Tenga cuidado de eliminar las burbujas de aire. Coloque la jeringa en la abrazadera de la jeringa sin ajustar su alineamiento eje x. Retraer completamente la jeringa con el control de la inyección.
   NOTA: Para los propósitos iniciales de formación, el uso de azul de Evanscolorante (1%), mancha azul tripán (0,4%) o una suspensión de microesferas fluorescentes como el inyectado puede ayudar al operador a confirmar la competencia y el éxito de la inyección objetivo.

2. Inyección

1. Encienda el calentador integrado de la plataforma de calefacción y configurarlo para 37 ° C. Coloque la plataforma de animales 180 ° de la orientación de imagen de rutina, con la abrazadera de la manguera de anestesia y la cabeza del animal más próximo al operador. Esto permite que el corazón (en el lado izquierdo del pecho) para ser ipsilateral a la abrazadera de la jeringa y la aguja. Nota: Los ajustes de rotación menor en sentido horario, además, a la plataforma de los animales pueden ser necesarios para orientar correctamente el corazón para el plano paraesternal eje corto de imagen que se utilizará para la inyección (Figura 2A).
2. Preparar los ratones para la ecocardiografía como se informó anteriormente ^9. Anestesiar el ratón en una cámara de inducción con 2% de isoflurano. Eliminar el vello del pecho con el pelo crema de eliminación de und aplicar gel lubricante a ambos ojos para evitar el secado de la esclerótica.
3. Elevar el transductor mediante la exploración de control de altura de la cabeza (Figura 1B). Coloque la supina anestesiado ratón encima de la plataforma de los animales se calienta con el hocico dentro de un cono de la nariz entrega 1-3% isoflurano (Figuras 2A-2B). Suavemente inserte una sonda rectal y la cinta de las cuatro patas a los electrodos de ECG, la aplicación de gel de electrodos para el contacto eléctrico.
   NOTA: El nivel adecuado de anestesia se debe garantizar un trato humanitario de los animales. No debe haber ningún cambio en la frecuencia cardíaca y sin respuesta a la colocación de la aguja a través de la pared torácica. Controles de temperatura homeostática integradas de la plataforma de los animales deben ser utilizados para manutención de la temperatura (37 ± 0,5 ° C), como la hipotermia dará lugar a bradicardia relativa, dilatación ventricular, y posibles molestias.
4. Una vez que el ratón es seguro en la plataforma animal, bajar el transductor sobre la depilaTed pecho usando el análisis de control de altura de la cabeza (Figura 1B). La configuración de ultrasonido óptimo para la inyección es para el corazón para ser visualizado en la orientación del eje corto paraesternal, según la técnica ecocardiográfica estándar. Gire la plataforma animales 20-30 ° hacia la derecha para obtener la ventana acústica óptima para la inyección en el plano de imagen de eje corto (Figuras 2A-2B). Nota: Como alternativa, la inyección se puede realizar a partir de una orientación del eje longitudinal paraesternal en sentido contrario a las agujas del reloj de la plataforma de los animales (Figura 2C).
5. Use los controles de ajuste de la plataforma de animales para ajustar el campo de visión y para dirigirse a cualquier sitio de la inyección deseada en el miocardio del ventrículo izquierdo. Pan de ida y vuelta desde el ápice a la base de corazón para apuntar a la ubicación de inyección deseado en el miocardio del ventrículo izquierdo (Figuras 3A-3C). Nota: El paraesternal de eje corto midpapillary (Figura 3A) ofrece reproducible hitos que permiten imágenes de seguimiento del sitio de la inyección. Nota: Como alternativa, el eje largo paraesternal se puede utilizar para llegar a un sitio predefinido inyección (Figura 3D).
6. Comenzando con la jeringa en la abrazadera de la jeringa completamente retraído, avanzar lentamente la jeringa hacia el pecho del animal girando las agujas del reloj de control de la inyección (Figura 4A). Para permitir la visualización clara de ultrasonido de tanto el corazón y la punta de la aguja a medida que se acerca al pecho, utilizar un montón de gel de ultrasonido sobre el lado izquierdo del pecho y optimizar la ventana acústica mediante el establecimiento de un amplio campo de visión en los controles ecocardiográficos. Ajuste el punto / zona focal en el sitio diana para la inyección. Los ajustes menores a la aguja de montaje controles pueden optimizar la imagen de la aguja a lo largo de su longitud.
   NOTA: Algunas máquinas de ultrasonido tienen una función de software de guía de la aguja para ampliar digitalmente una línea a lo largo del eje largo de la aguja a través de al miocardio objetivo(Figura 4B). Esta herramienta de software puede ser útil, pero no es esencial.
7. Con el animal sedado adecuadamente (1-3% de isoflurano mezclado con 0,5-0,8 L / min 100% de oxígeno), avanzar la aguja a través de la pared torácica del ratón y en el miocardio, observando cuidadosamente la posición de la punta de la aguja biselada en absoluto veces. Detener el avance cuando la punta de la aguja está dentro del miocardio objetivo (Figura 4C). La punta biselada entera debe ser segura dentro del miocardio, para evitar la fuga de la sustancia inyectada en el espacio pericárdico.
8. Cuando la punta está en la ubicación deseada, entregar el inyectado empujando el émbolo de la jeringa. Entregar el producto a inyectar lentamente, durante 5 a 30 segundos (dependiendo del volumen que se entrega). Hasta 50 l de solución inyectada se pueden entregar sin comprometer la función ventricular. Un aspecto echobright transitoria a la región del miocardio inyectado puede ser evidente después de la inyección con éxito. Un período breve (segundos) de bradycard relativaia en ocasiones se observó con la inyección en el miocardio y rápidamente se resuelve.
9. Una vez que se ha administrado la sustancia inyectada, retirar rápidamente la aguja por el giro hacia la izquierda de la perilla de control de la inyección. El ratón debe mantenerse bajo anestesia durante varios minutos de observación ecocardiográfica para confirmar la función ventricular preservada y sin complicaciones después del procedimiento. Si está indicado, múltiples regiones de miocardio pueden ser inyectados en serie mediante el reposicionamiento del ángulo de la aguja de enfoque mediante el ajuste de la plataforma animal. Después de la inyección intramiocárdica, el ratón se coloca en una jaula en su propia y permitió recuperarse de la anestesia bajo observación.
10. No deje un animal sin vigilancia hasta que se haya recuperado el conocimiento suficiente para mantener decúbito esternal. No devuelva un animal que ha sufrido la inyección intramiocárdica de la compañía de otros animales hasta que se recupere completamente. La jaula debe ser colocado sobre una almohadilla de termorregulación con ready provisión de agua y el ratón dieta. No se espera que las molestias después del procedimiento y el fracaso para reanudar adecuadamente el comportamiento normal poco después de la intervención sugiere una posible complicación (ver Discusión).
11. Deseche cuidadosamente la aguja inmediatamente después de la finalización de la inyección intramiocárdica para minimizar el riesgo de lesiones cortopunzantes al operador oa terceros. La reutilización de una aguja puede resultar en embotamiento de la punta por lo que es más difícil de perforar el miocardio y que resulta en un mayor riesgo de complicación.

Resultados

Inyección intramiocárdica murino con colorante azul o microesferas fluorescentes

La inyección de colorante azul de Evan es útil para fines de capacitación. Pronto después de la inyección, la eutanasia el ratón y quitar el corazón para visualizar la ubicación de la inyección de colorante azul. Figura 5 muestra un ejemplo de una inyección de éxito, con colorante azul de infiltrarse en el miocardio a nivel muscular mediados papilares (Figura 5A, regi?...

Discusión

Los biológicos se pueden entregar al miocardio por inyección intramiocárdica directa, inyección intrapericárdica, o administración indirecta a través del torrente sanguíneo. Ensayos de terapia basados ​​en células recientes en modelos de infarto de miocardio han descrito un enfoque de toracotomía abierta a la entrega de la sustancia inyectada ^12-14. Un factor importante en el éxito de una intervención terapéutica de miocardio depende de la elección de la ruta de entrega. La dosis más alta d...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vevo 2100 ultrasound imaging system	Visualsonics
Vevo Integrated Rail System III	Visualsonics
Microscan MS400 transducer	Visualsonics
Microscan MS550D transducer	Visualsonics
PrecisionGlide needles	BD	305128	30 G x 1 in/2.5 cm
1 cc slip tip syringe	Exel International	26048	or equivalent
Gastight 50 μl glass syringes	Hamilton	1705
Trypan blue stain (0.4%)	Gibco	15250	or equivalent
Isoflurane	Baxter	AHN3640	or equivalent
Aquasonic 100	Parker Laboratories	(01-08)	or equivalent
Polystyrene microspheres (red fluorescent)	Life Technologies	F-8842	or equivalent