Agudo Disociación de lamprea reticuloespinal axones para permitir la grabación del estreno de la cara de la membrana de individuales Terminales presinápticos funcionales

Resumen

Recording Ca²⁺ currents at the presynaptic release face membrane is key to a precise understanding of Ca²⁺ entry and neurotransmitter release. We present an acute dissociation of the lamprey spinal cord that yields functional isolated reticulospinal axons, permitting recording directly from the release face membrane of individual presynaptic terminals.

Resumen

La transmisión sináptica es un proceso extremadamente rápido. Potencial de acción impulsado afluencia de Ca ^{2 +} en la terminal presináptica, a través de los canales de calcio dependientes de voltaje (VGCCs) localizados en la membrana cara liberación, es el detonante de la fusión de vesículas y la liberación de neurotransmisores. Crucial para la rapidez de la transmisión sináptica es la sincronía espacial y temporal entre la llegada del potencial de acción, VGCCs y la maquinaria liberación de neurotransmisores. La capacidad de grabar directamente Ca ^{2 +} corrientes de la membrana cara liberación de terminales presinápticas individuales es imperativo para una comprensión precisa de la relación entre presináptica Ca ^{2 +} y la liberación de neurotransmisores. El acceso a la membrana cara liberación presináptica de registro electrofisiológico no está disponible en la mayoría de las preparaciones y Ca ^{2 +} entrada presináptica se ha caracterizado mediante técnicas de imagen y MeasureMe corriente macroscópicaNTS - técnicas que no tienen suficiente resolución temporal para visualizar la entrada de Ca ^{2 +.} La caracterización de VGCCs directamente en las terminales presinápticas individuales no ha sido posible en las sinapsis centrales y hasta el momento se ha logrado con éxito sólo en el tipo cáliz sinapsis del ganglio ciliar de pollo y en los cálices de rata. Hemos abordado con éxito este problema en la sinapsis reticulospinal gigante de la lamprea de la médula espinal mediante el desarrollo de una preparación agudamente disociado de la médula espinal que produce axones reticulospinal aislados con terminales presinápticas funcionales carentes de estructuras postsinápticas. Fluorescencia Podemos etiquetar e identificar las terminales presinápticas individuales y dirigirlos para la grabación. El uso de esta preparación, hemos caracterizado VGCCs directamente en la cara liberación de terminales presinápticas individuales utilizando enfoques de inmunohistoquímica y de electrofisiología. Ca ^{2 +} corrientes se han registrado directamente en la cara de la membrana de liberación of terminales presinápticas individuales, la primera de grabación a ser llevadas a cabo en las sinapsis centrales.

Introducción

La transmisión sináptica es un proceso extremadamente rápido y preciso. Acción potencial invasión de la terminal presináptica conduce a la apertura de VGCCs situados en la membrana cara liberación, el aumento resultante en presináptica Ca ^{2 +} que actúa como el disparador para la fusión de vesículas y liberación de neurotransmisores ^1. Todos estos pasos se dan dentro de cientos de microsegundos ^2, y por lo tanto requieren de acoplamiento espacial estricto de VGCCs a la maquinaria de la fusión de vesículas ^3. Presináptica Ca ^{2 +} flujos se han caracterizado principalmente por medio de imágenes enfoques usando colorantes sensibles al Ca ^{2 + 4.} La incorporación de Ca ^{2 +} tampones que modulan Ca2 ⁺ en las neuronas presinápticas se ha utilizado para caracterizar indirectamente la relación entre el calcio y la neurotransmisión presináptica ^3. Además, la modulación de la presináptica libre de Ca ^{2 +} de concentración por uncaging Ca ^{2 + 5} o grabar macroscopic Ca ^{2 +} corrientes se han usado en conjunción con medidas de la fusión de vesículas y / o liberación; tales como medidas de capacitancia ⁶ o postsináptica respuestas ² para abordar la misma cuestión. Sin embargo, la caracterización de Ca ^{2 +} corrientes directamente en la cara de la liberación, la sección especializada de la membrana presináptica, donde despolarización de la membrana se traduce en Ca ^{2 +} corrientes desencadenan la fusión de vesículas sinápticas y la liberación de neurotransmisores, es esencial para obtener una medida precisa de la Ca ^{2 +} requisito para la fusión de la vesícula sináptica. Además, la capacidad para caracterizar directamente Ca ^{2 +} corrientes en los terminales presinápticos individuales, junto con mediciones simultáneas precisas de la fusión de vesículas y liberación permite una elucidación precisa de la relación de temporización entre el transcurso de tiempo del potencial de acción, presináptica Ca ^{2 +} actual, la fusión de vesículas y la liberación. El acceso a la membrana de liberación carano está disponible en la mayoría de los terminales presinápticos debido a la estrecha aposición por las dendritas postsinápticas. Esta inaccesibilidad ha sido un obstáculo importante en la caracterización de VGCCs ya que impide las mediciones directas de la corriente en las terminales presinápticas individuales. Caracterización directa de presináptica Ca ^{2 +} corrientes en las terminales presinápticas individuales hasta el momento no ha sido posible en las sinapsis centrales y sólo se ha logrado en dos terminales presinápticas tipo cálices; tipo cáliz sinapsis del ganglio ciliar de pollo ^{de 7-10} y de rata cálices ^11,12. En todos los otros terminales presinápticas incluyendo la sinapsis reticulospinal gigante en la lamprea de la médula espinal ^13, la falta de acceso a la membrana cara liberación presináptica ha hecho necesario el uso de enfoques indirectos tales como Ca ^{2 +} de imágenes para estudiar presináptica Ca ^{2 +} flujos.

Figura sinapsis reticulospinal gigante. (A) Sección 1.-Lamprea de lamprea médula espinal que indica la orientación dorso-ventral. Reticuloespinal axones están marcados con el asterisco verde. (B) la reconstrucción 3-D de la sinapsis reticuloespinal en la lamprea de la médula espinal que muestra presináptica del axón reticuloespinal hacer numerosos contactos en passant (marcado por flechas verdes) en la neurona postsináptica ^13. Terminales presinápticas han sido etiquetados con Alexa Fluor 488 hidrazida conjugado faloidina (verde), mientras que la neurona postsináptica se ha llenado con Alexa Fluor 568 hidrazida (rojo).

Axones gigantes reticulospinales lamprea, ubicadas en la región ventral de la médula espinal en paralelo a la rostral-caudal eje Figura 1a, la forma múltiple en passant contactos sinápticos en neuronas de laasta ventral de la médula ¹⁴ Figura 1b ^13. De células enteras macroscópica Ca ^{2 +} corrientes han sido registrados en los axones reticulospinales en la médula espinal intacta ^13,15. Sin embargo, los intentos anteriores ciegos en la medición directa de Ca ^{2 +} corrientes en los axones reticulospinales en la lamprea intacta la médula espinal usando técnica de patch clamp de células inscritos han tenido éxito ¹³ debido a la falta de acceso a la membrana cara liberación presináptica debido a los procesos postsinápticos opuestas la Figura 1b. La membrana cara liberación ha sido previamente hecho accesible por la eliminación de la neurona postsináptica ^11, perturbación mecánica de la sinapsis antes de grabar ¹² o el tratamiento enzimático junto con disociación mecánica ^16. Dada la compleja organización de la médula espinal, que resultaría extremadamente difícil identificar la neurona postsináptica y retraer mecánicamente o perturbar ªe sinapsis. Por lo tanto, hemos decidido utilizar el tratamiento enzimático ¹⁷ seguido por disociación mecánica.

Con este enfoque, hemos desarrollado una preparación agudamente disociado de la lamprea de la médula espinal que produce viables axones reticulospinal aislados con terminales presinápticas funcionales carentes de cualquier proceso de post-sinápticos, proporcionando así un acceso sin restricciones a las terminales presinápticas individuales. En conjunto con un microscopio invertido y estándar de imágenes de fluorescencia, que nos permite identificar y seleccionar los terminales presinápticos con fluorescencia identificado individuales, con una pipeta de parche que contiene una solución de grabación que aísla Ca ^{2 +} corrientes 4c figura y la figura 4d, para la grabación con base celular técnica de fijación de voltaje adjunta. Ca ^{2 +} corrientes se han registrado directamente en la membrana cara liberación presináptica de los terminales presinápticos individuo Figura 4f. Esta es una SIGNIFICAnt avance en el campo de la transmisión sináptica, ya que es la primera grabación que se llevó a cabo en las sinapsis centrales.

Protocolo

1. Preparación de poli-D-lisina bromhidrato

1. Preparar bromhidrato de poli-D-lisina 1 mg / ml en tampón borato 0,1 M (pH 8,5).
2. Alícuota y almacenar a -20 ° C.

Recubrimiento 2. poli-lisina de Cubreobjetos

Nota: Llevar a cabo todos los pasos de limpieza y revestimiento en una cámara de flujo laminar.

1. Coloque los portaobjetos en una placa de Petri que contiene 1 N de ácido clorhídrico (HCl) durante 2 horas.
2. Aspire todo el HCl y enjuague con un 70% de etanol (EtOH) 2-3 veces.
3. Deja en EtOH al 70% durante 1 hora.
4. Aspire todo el EtOH al 70% y enjuague con EtOH al 100% 2-3x.
5. Deja en EtOH al 100% durante 2 horas. Aspirar todo EtOH.
6. Secar con papel de filtro y secar al aire durante unos pocos segundos.
7. Lugar O N en 1 mg solución poli-lisina / / ml.
8. Enjuague cubreobjetos día siguiente con 4-5x agua Millipore.
9. Aire seco poli-lisina recubierto cubreobjetos sobre rodillos de cristal en una placa de Petri limpia.
10. Para immunohistochemistry, utilizar 35 x 10 mm de Petri tapas de los recipientes. Preparar Sylgard (polydimethylsilioxane, PDMS) forrado platos vertiendo PDMS (elastómero y agente de curado de 10: 1 en peso) en el plato con un grosor de 0,3 cm y permita que se asiente en el 30 ° CO / N. Una vez que esto se ha puesto, cortar unos 2 cm por 1 cm emplazada en el PDMS. Limpiar y recubrir la inserción con poli-lisina siguiendo los mismos pasos como se mencionó anteriormente para cubreobjetos.
11. Tienda cubreobjetos y platos recubiertos de poli-lisina cubiertos dentro de la cámara de flujo laminar hasta su uso (hasta 2 semanas, pero lograr mejores resultados mediante la preparación de adhesivos periódicamente cada 3-4 días).
12. Preparar un bloque PDMS, al pin de la médula espinal en la máquina de cortar el tejido que vibra. Mix Elastómero A y B Elastómero 1: 1 en peso. Vierta la mezcla en un plato 100 x 15 mm de Petri y permita que se asiente O / N a 30 ° C. Corte un pedazo rectangular de los PMDS y péguelo en la placa base de corte utilizando pegamento epóxico. Deje que el pegamento se seque la fijación de los PDMS en lugar y cortar varias secciones delgadas de la superficie para obtener un pisosuperficie a la clavija del tejido en.

3. aguda disociación de la lamprea de la médula espinal al rendimiento aislado axones reticuloespinal

1. Anestesiar a un ammoecoete o adulto lamprea (Petromyzon marinus) con metanosulfonato tricaína (MS-222, 100 mg / L). Añadir anestésico en el agua, en un vaso de plástico cubierto por una tapa, que contiene la lamprea para ser sacrificado.
2. Decapitar lamprea en frío (4 ° C) solución de Ringer de la siguiente composición (en mM): 130 NaCl, 2,1 KCl, 2,6 CaCl _2, 1,8 MgCl _2, 4 HEPES, 4 de dextrosa (pH 7,6, osmolaridad 270 mOsm) y retirar el cuerpo músculos de la pared para exponer la superficie dorsal de la médula espinal.
3. Eliminar meninge primitiva de la superficie dorsal de la médula espinal utilizando unas pinzas finas. No retire primitiva meninge ventral en esta etapa.
4. Cortar la médula espinal en trozos de 1 cm de largo.
5. Pin un pedazo de la médula espinal con alfileres de insectos finas, frente a lado dorsal hacia arriba, sobre un PDMS forrado rebanar pla de baseTE (véase 2.12) en una cámara de la máquina de cortar tejido vibrante que contiene la solución de Ringer enfriada con hielo.
6. Eliminar una sección central de la columna dorsal de la médula espinal por corte a lo largo del eje rostro-caudal con la hoja, dejando tras de secciones de columna dorsal intactos en el rostral y caudal termina para servir como asas durante el proceso de disociación Figura 2a y la Figura 2b. Use ajuste de velocidad más lenta que permite cortar y un ajuste de la profundidad que elimina sólo la columna de la dorsal dejando la columna subyacente axón reticulospinal Figura 2b sin daños.
7. Incubar en rodajas piezas de la médula espinal a ta durante 45 min en un cóctel de 1 mg / ml de proteasa (Tipo XIV de Streptomyces griseus) y 1 mg / ml de colagenasa preparado (Tipo IA de Clostridium histolyticum) en solución de Ringer (adaptado de El Manira y Bussières , 1997 17).
8. Piezas de la médula espinal tratados con enzimas Pin utilizando pasadores finos en una placa de Petri de PDMS se alinearon contanando frío (4 ° C) solución de Ringer.
9. Retire primitiva meninge ventral con unas pinzas finas.
10. Cortar secciones laterales de la médula espinal con una hoja de bisturí en el punto medio de la sección dorsal rodajas de salir de la columna central de los axones intactos reticulospinales en la médula espinal Figura 2d.
11. Ponga una gota de aceite de inmersión en el objetivo.
12. Coloque el cubreobjetos poli-lisina recubierto (Figura 3a, la pieza superior, un rectángulo rojo) en la ranura de la cámara de grabación de la figura 3 y aplicar grasa de vacío para todos los bordes (espacio entre los rectángulos rojos y azules en la Figura 3a, para facilitar un sello. Tornillo la parte superior en su lugar. Coloque la cámara en la inserción en el equipo de grabación.
13. Añadir la solución de Ringer en la cámara de grabación usando una pipeta Pasteur.
14. Conectar la tubería de salida de la botella de presión que contiene solución anticongelante a la tubería de entrada del dispositivo de refrigeración termoeléctrica. Conecte el caliut tubo del dispositivo de refrigeración termoeléctrica al extremo de entrada de la camisa de refrigeración exterior y el extremo de salida al depósito de la Figura 3b.
15. Colocar una pieza de la médula espinal a la vez en la cámara de grabación y separar suavemente la médula espinal mantener a lo largo del cubreobjetos en todo momento utilizando fórceps recubiertos de teflón hasta que los axones están aislados Figura 2e y la figura 2f.
16. Llevar la temperatura de la solución de grabación a 10 ° C haciendo pasar la (gas nitrógeno es empujado dentro de la botella) presurizado solución anticongelante (por el desplazamiento), a través del dispositivo de refrigeración termoeléctrica, a través de la camisa de refrigeración externa de la cámara de grabación de la figura 3b.
17. Permitir que los axones se recuperen para el post disociación de 1 hora a 10 ° C.

Figura 2. descripción esquemática de disociación de protocolo para el aislamiento de los axones reticulospinal. (A) La eliminación de la columna dorsal. La flecha indica la dirección de corte del tejido. Los cuernos dorsales están marcados por el alfabeto D (color fuente roja), mientras que los cuernos ventrales por el alfabeto V (color de fuente rojo). (B) de la columna dorsal retira en la porción central de la médula espinal exponer los axones reticulospinales (líneas verdes ). Los cuernos ventrales, que permanecen intactos después del proceso de corte, están marcados por el alfabeto V (color de fuente rojo). (C) tratamiento de 45 minutos con la proteasa y enzimas colagenasa cocktail (1 mg / ml). (D) El corte de vías laterales de la médula espinal; que indica la posición, dirección y extensión de corte lateral. (e) disociación mecánica de la médula espinal. Las flechas indican la posición de fórceps y dirección de la fuerza de separación durante la disociación. (F) Representatihe ejemplo de preparación axón reticuloespinal disociado. Las flechas verdes marcan las regiones de axones reticulospinal agudamente disociado sin ningún proceso de post-sinápticas.

Figura 3. esquemática de cámara para experimentos de electrofisiología grabación. Dimensiones proporcionadas están en pulgadas. Rectángulo rojo muestra en el diagrama basepiece (a) indica el posicionamiento de cubreobjetos en la ranura cubreobjetos en el basepiece. La región entre el rectángulo rojo y azul, que se muestra en el diagrama basepiece (a) es donde se aplica la grasa de alto vacío. (B) muestra la cámara de grabación montado.

4. etiquetado y la identificación de los terminales presinápticos con FM 1-43

1. Etiquetar las terminales presinápticas, mediante la incorporación de FM 1-43 en vesicles durante sináptica exo-endocitosis durante la escuela K + despolarización. Perfundir preparación con 5 M FM 1-43 (en solución 5 ml de Ringer que contiene 30 mM KCl).
2. Perfundir preparación con 1 mg / ml ADVASEP-7 (en solución de Ringer 5 ml) para eliminar el exceso de colorante FM) ^18.
3. Perfundir preparación con solución de Ringer durante 15 min al lavado por cualquier colorante Remant y la ADVASEP.
4. Imagen con 100 X lente de inmersión en aceite (NA 1,25) en un microscopio de fluorescencia invertido, en conjunción con una cámara CCD digital y la adquisición de imágenes micromanager software, utilizando protocolos de formación de imágenes de fluorescencia estándar.
5. Identificar los terminales presinápticos marcados con fluorescencia para apuntar para la grabación de la figura 4c y 4d Figura.

5. inmunohistoquímica de aislados axones reticuloespinal

1. Rellene inserción plato (sección Protocolo 2.10.) Con divalente-ion (Ca ^{2 +} y Mg ^{2 +)} libreSolución de Ringer.
2. Fabrique pipetas de parche en un extractor micropipeta P-87. Colocar una pequeña cantidad de pegamento de sutura en un extremo de la inserción de poli-lisina utilizando una pipeta de parche (1,5 mm de vidrio de diámetro exterior) y de aspiración (usando un tubo de silicona 0,89 mm de diámetro interior con una punta de micropipeta unido al extremo de succión).
3. Realizar disociaciones utilizando el mismo procedimiento que se menciona en la sección de protocolo 3 Figura 2. Coloque un extremo de la médula espinal en la cola de sutura y presione suavemente con unas pinzas para adherirse fuertemente a la superficie. Coloque otra gota de pegamento de sutura en el otro extremo de la inserción y estirar suavemente la médula espinal hasta que se disocian los axones y adherir el extremo libre de la médula espinal arrastrándolo suavemente sobre el pegamento de sutura. Fijar en su lugar por prensado suave hacia abajo con las pinzas.
4. Divalente libre intercambio solución de Ringer con solución de Ringer normal por perfusión.
5. Permitir que los axones se recuperen para el post dissoc 20 miniation a 10 ° C.
6. Fijar los axones disociadas en 4% de paraformaldehído (PFA) {preparado en tampón fosfato salino (PBS, (mM) NaCl 137, KCl 2,7, Na ₂ HPO ₄ 10, KH ₂ PO ₄ 1,8, pH 7,4)} durante 20 min. Filtra solución de PFA antes de su uso mediante el paso a través de un filtro de jeringa de 0,2 mM.
7. Lave la PFA perfundiendo glicina 0,1 M (en PBS) durante 10 min.
8. Incubar en 0,1% de Triton-X (en PBS) durante 10 min.
9. Lavar por perfusión PBS durante 20 min.
10. Se bloquea con leche desnatada al 5% (en PBS) durante 6 horas a 4 ° C.
11. Añadir en el anticuerpo primario a VGCC de interés (dilución 1: 200 en PBS) y se incuba durante 20 horas a 4 ° C.
12. Lavar por perfusión PBS durante 20 min.
13. Bloquear con leche desnatada al 5% (en PBS) durante 10 min a 4 ° C.
14. Añadir en anticuerpo secundario (dilución 1: 400 en PBS) y se incuba en la oscuridad durante 2 horas a 4 ° C.
15. Lavar por perfusión con PBS durante 20 min.
16. Bloque con 1% de suero bovino Albumin (en PBS) durante 20 min.
17. Añadir en Alexa Fluor 488 faloidina (5 unidades / l concentración de trabajo; de stock preparada en metanol 200 Unidades / ml).
18. Lavar por perfusión con PBS durante 20 min.
19. Image usando lente de inmersión 100X agua en el microscopio confocal.

6. electrofisiológico de grabación

1. Fabrique pipetas de parche de vidrio de aluminosilicato (resistencia pipeta 2-5 mW) en un extractor de micropipeta P-87. Diseño parche pipeta de tal manera que la punta de pipeta abarca toda diámetro terminal presináptica.
2. PDMS pipetas de parche capa por inmersión de la pipeta de parche bajo presión de 50-60 psi en PDMS ²³ (adjuntar un tubo de silicona, 0,89 mm de diámetro interior, conectado a un cilindro de gas nitrógeno, a la parte de atrás de la pipeta de parche) y secar usando un calor arma. Alternativamente, la capa manualmente la pipeta con PDMS, la aplicación de recubrimiento tan cerca de la punta como sea posible, bajo un microscopio compuesto.
3. Fuego pipetas parche pulido utilizando un microforge (un filamento de platino a la medida montado sobre la platina de un microscopio compuesto).
4. Identificar los axones aislados que demuestran terminales presinápticos marcados por microscopía de fluorescencia.
5. Llenar solución de grabación (diseñado para aislar Ca ^{2 +} corrientes; 10 mM CaCl ₂ o 90 mM BaCl ₂ como portador de carga, tamponada de HEPES pH 7,6, osmolaridad 270 mOsm) en el parche pipeta usando una jeringa.
6. Inserte parche pipeta en el soporte de la pipeta y posición por encima del baño usando un manipulador motorizado MP225. Baje suavemente la pipeta parche en el baño y la posición contra la cara de un terminal presináptica fluorescente identificado.
7. Avance el parche pipeta lentamente hasta que se haga contacto con la membrana. En este punto, lograr un sellado gigaohmio por succión la boca suave a través de un tubo conectado a la titular de la pipeta.
8. Para alcanzar el fondo extremadamente bajos niveles de ruido requeridos para el registro de un solo canal de Ca ^{2 +} corrientes, utilice una Axopatch 200B con un cabezal de la platina se enfrió durante las grabaciones. Datos de la muestra de 20 a 50 kHz y el filtro utilizando un filtro de Bessel 5 kHz. Llevar a cabo la adquisición de datos utilizando un AxoGraph X.
9. Utilice un protocolo estándar para escaleras, en incrementos de 10 mV como estímulo. Incorporar un pre-pulso en el protocolo, el protocolo anterior etapa, para asegurar la activación máxima de los canales de Ca ^{2 +.} Incorporar una mV paso 10 fugas en el protocolo de paso para un análisis posterior sustracción de corrientes de fuga.

Resultados

Esto produce la disociación de protocolo axones sanos y funcionales aisladas reticulospinal carentes de postsináptica proyecciones Figura 2f, pero que sin embargo retener presináptica terminales funcionales capaces de vesícula sináptica evocada exo-y endocitosis Figura 4c y 4d Figura. Secciones de las regiones aisladas de los axones reticulospinal pueden ser claramente identificados con microscopía de luz para estar libre de cualquier otros procesos neuronal...

Discusión

Nuestro protocolo de disociación es significativa al ceder axones reticulospinal aislados y fuera de postsináptica proyecciones Figura 2f, pero que sin embargo conservan funcional presináptica terminales Figura 4c y 4d Figura. La ausencia de procesos de post-sinápticas se oponen a la terminal presináptica permite el acceso directo a la grabación de la membrana cara liberación presináptica en las terminales presinápticas individuales, antes no era posible en las...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 µm Syringe filter	EMD Millipore	SLGV004SL
22 x 60 mm Coverslips	Fisherbrand	12545J
Advasep-7	Cydex Pharmaceuticals	ADV7
Alexa Fluor 488 Phalloidin	Invitrogen/Life Technologies	A12379
Alexa-633 conjugated goat anti-rabbit secondary antibody	Invitrogen/Life Technologies	A21070
Antifreeze	Prestone
Boric acid	Sigma-Aldrich	B7660
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A7906
Bright field light source	Dolan-Jenner	Fiberlite 180
Calcium chloride	Sigma Aldrich	C4901
Collagenase Type IA from Cloristridium Histolyticum	Sigma-Aldrich	C9891
Cover slip	Fisher-Scientific	12-545-J
Dextrose	Sigma-Aldrich	D9559
Digital CCD Camera	Hamamatsu	C8484-03G01
Dissection fine forceps	Fine Science Tools	91150-20
Dissection forceps	Fine Science Tools	11251-20
Dissection microscope	Leica Biosystems	Leica MZ 12
Dissection scissors	Fine Science Tools	15025-10
Dissection scissors fine	Fine Science Tools	91500-09
Dissection scissors ultra fine	Fine Science Tools	15000-08
FM 1-43	Invitrogen/Life Technologies	T3163
Glycine	Sigma-Aldrich	G7126
HEPES	Sigma-Aldrich	H7523
High vacuum grease	Dow-Corning
Hydrochloric acid	Fisherbrand	SA-56-500
Immersion oil	Fisher-Scientific	M2000
Industrial grade nitrogen gas tank	Praxair	UN1066
Insect pins	Fine Science Tools	26002-10
Liquid suture glue	Braun Veterinary Cair Division	8V0305	The suture glue we used in our experiments was provided to us by another lab. It is no longer manufactured. We have sourced a Histoacryl Suture Glue for future use from Aesculap (Ts1050071FP)
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	M2670
Methanol	Sigma-Aldrich	154903
Non-fat dry milk	Cell Signaling Technology	9999S
P-87 Micropipette puller	Sutter Instruments
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
Perfusion pump	Cole-Palmer	Masterflex C/L
Petri dish 100 x 15 mm	Fisher-Scientific	875712
Petri dish 35 x 10 mm	Fisher-scientific	875712
Poly-D-lysine hydrobromide	Sigma-Aldrich	P1024	MW > 300,000
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P9333
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P5379
Primary antibodies R-type calcium channel	Alomone Labs	ACC-006
Protease Type XIV from Streptomyces Griseus	Sigma-Aldrich	P5147
Scalpel blades	World Precision Instruments	500240
Schot Duran Pressure Bottle	Fisher-Scientific	09-841-006
Silicone tubing for glue application	Cole-Palmer	07625-26
Slicing base plate	Leica Biosystems	14046327404
Slicing chamber	Leica Biosystems	14046230132
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S7653
Sodium hydroxide		S8045
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	S9763
Sodium tetraborate	Sigma-Aldrich	B3545
Sylgard 160 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning	SYLGARD® 160	To prepare, mix elastomer A and elastomer B 10:1 by weight
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning	SYLGARD® 184	To prepare, mix elastomer and curing agent 10:1 by weight
Teflon coated forceps	Fine Science Tools	11626-11
Tricaine methanesulphonate	Sigma-Aldrich	A5040
Vibratome blades	World Precision Instruments	BLADES
Xenon lamp	Nikon