Fisiológicos Grabaciones y RNA Secuenciación de los apéndices gustativas del mosquito de la fiebre amarilla<em&gt; Aedes aegypti</em

Resumen

El uso de dos métodos para estimar la expresión génica en las principales apéndices gustativas de Aedes aegypti, hemos identificado el conjunto de genes supuestamente subyacentes a las respuestas neuronales a compuestos amargos y repulsivas, como se determina por examen electrofisiológico.

Resumen

Electrophysiological recording of action potentials from sensory neurons of mosquitoes provides investigators a glimpse into the chemical perception of these disease vectors. We have recently identified a bitter sensing neuron in the labellum of female Aedes aegypti that responds to DEET and other repellents, as well as bitter quinine, through direct electrophysiological investigation. These gustatory receptor neuron responses prompted our sequencing of total mRNA from both male and female labella and tarsi samples to elucidate the putative chemoreception genes expressed in these contact chemoreception tissues. Samples of tarsi were divided into pro-, meso- and metathoracic subtypes for both sexes. We then validated our dataset by conducting qRT-PCR on the same tissue samples and used statistical methods to compare results between the two methods. Studies addressing molecular function may now target specific genes to determine those involved in repellent perception by mosquitoes. These receptor pathways may be used to screen novel repellents towards disruption of host-seeking behavior to curb the spread of harmful viruses.

Introducción

Compuestos como DEET, Picaridin, citronelal y IR3535 se ha demostrado eficaz para repeler mosquitos, incluyendo las importantes vectores de enfermedades Aedes aegypti ^1,2. Registramos los potenciales de acción de las neuronas sensoriales asociadas con sensilla gustativo específico para determinar las células involucradas con la repelencia de mosquitos. Junto con la secuenciación de aguas abajo de los genes expresados ​​en estos tejidos, podemos identificar los genes más probable que median las respuestas de estas células con el fin de cribar nuevos compuestos para la mejora de las capacidades de repelencia.

RNA-seq es una herramienta poderosa, convirtiéndose rápidamente en estándar para el seguimiento de los cambios temporales y espaciales en la expresión génica. Análisis de RNA-seq de apéndices quimiosensoriales de insectos y los órganos se han utilizado para descubrir receptores moleculares en varias especies de insectos ^3-5, mejorando en gran medida de gen convencional búsquedas basado en la ^PCR-6 por el gen. Los insectos representan la clase de animales más diverso, presenta muchas oportunidades para estudiar la relación entre los genes y fenotipos únicos. Tecnología de RNA-seq se puede emplear en cualquier tejido de insectos que viven. Asimismo, el registro electrofisiológico de las células sensoriales dentro de sensilla gustativa uniporous se puede lograr en muchas especies de insectos diferentes. El emparejamiento de estas dos técnicas permite a los investigadores Para limitar los genes que participan en conjunto un fenotipo observado quimiosensorial. Las diferentes especies presentarán desafíos específicos, pero pueden informar a la conexión entre los genes de los receptores quimiosensoriales y una adaptación quimiosensorial. El tamaño y la morfología de sensilla quimiosensorial es variable y pueden requerir extensa resolución de problemas durante la grabación de los potenciales de acción para reducir el ruido e identificar señales repetibles. Las disecciones de los órganos quimiosensoriales pueden ser triviales o delicada y requiere mucho tiempo, dependiendo de la morfología y el tamaño del insecto. La recuperación de ARN de alta calidad puede requerir alguna solución de problemas, así como evitar ciertos pigmentos durantela recogida de tejidos.

Al tiempo que demuestran los efectos de los compuestos repelentes a través de ensayos de comportamiento es directa e informativo, este enfoque es intensiva en tiempo y amplia con respecto a mecanismo de acción. Electrofisiología junto con RNA-seq permite análisis más específicos de lo que impulsa a comportamientos de evitación en los insectos. Una vez que el "kit de herramientas" de la discriminación químico ha sido identificado en una especie de insecto, los intentos más específicas para mejorar en los repelentes conocidos son posibles. Los receptores y proteínas asociadas en las células sensoriales responsables de estos comportamientos pueden ser expresados ​​de forma heteróloga para la detección química directa. Además, el modelado molecular puede predecir que los productos químicos se provocar respuestas fuertes de estos receptores ^7.

La instantánea de todos los genes activos en un conjunto limitado de tejidos quimiosensoriales también puede ser útil en la identificación de genes similares en otras especies. Usando homología de secuencia y si la expresiónmilarities, los investigadores pueden formar conjuntos de receptores moleculares más probable que median las respuestas a los repelentes que son ampliamente eficaces en insectos. Presentamos el siguiente protocolo para ayudar a los investigadores en la deconstrucción de las vías chemosensory insectos y persuadir más que ahondar en la neuroetología de la no-modelo y los insectos de importancia económica.

Protocolo

1. Crianza Ae. adultos aegypti

1. Los huevos eclosionan en aproximadamente ¾ de pulgada de agua en la bandeja poco profunda. El hacinamiento reducirá el tamaño de los adultos.
2. Larvas posterior a 25 ° C (12 hL: 12-HD) y alimentarlos con comida para peces suelo.
   NOTA: La sobrealimentación puede reducir las tasas de supervivencia.
3. Retire pupas individualmente por pipeta Pasteur diario y transferir a los platos de plástico (9 cm x 5,5 cm) dentro de pequeños cubos de contención con tapas de malla fina, estableciendo así 24 grupos de edad hr.
4. Alimentación mosquitos adultos 10% de solución de sacarosa por bola de algodón colocado en las paredes de pantalla de una carcasa de la jaula de los mosquitos en una cámara ambiental a 27 ° C y humedad relativa del 70% bajo el mismo fotoperiodo como larvas.
5. Para electrofisiología, utilice 5-10 días los animales viejos. En general, los animales más grandes producirán mejores resultados. Para el aislamiento de ARN, utilizar animales que están dentro de un mismo grupo de edad de 24 horas en el rango de edad 5-10 días.

2. Preparación de los Productos Químicos

1. Determinar una concentración adecuada de electrolito (por ejemplo, 1-10 mM) que provoca una mínima actividad de las neuronas sensoriales seleccionados. NaCl 10 mM o 1 mM KCl son electrolitos razonables para poner a prueba la actividad basal al comenzar un experimento.
2. Disolver cada producto químico experimental en un disolvente apropiado (si no el agua, utilizar etanol o DMSO) que tiene poco o ningún efecto sobre la actividad de pico en comparación con electrolito solo. Las concentraciones finales de etanol al 10% o 1% de DMSO son concentraciones de partida razonables.
3. Seleccionar apropiado (por ejemplo la quinina por amargo o sacarosa para dulces) productos químicos de control que están bien descritos disuasorias de la alimentación o estimulantes en los insectos.

3. Electrofisiología (grabación punta ^8. La figura 1)

1. Electrodos de vidrio Forma tirando mecánicamente capilares de vidrio. Optimizar calor y tire ajustes para tirar de vidrio para formar recordi forma apropiadaelectrodos NG. Romper con cuidado extremo del electrodo de vidrio usando pinzas bajo un microscopio de disección para crear electrodo de punta abertura que es lo suficientemente amplia como para envolver sensillum objetivo, pero lo suficientemente pequeño para evitar el contacto con las estructuras vecinas.
2. Bajo el microscopio, identificar visualmente por la morfología y la posición del objetivo sensilla / sensillum para asegurar la repetibilidad de grabación punta. Animales de preparación para permitir el libre acceso a sensilla de ángulo de entrada del electrodo.
3. Insectos anestesiar adultos fríos en el congelador a -20 ° C. Evitar daños a las neuronas periféricas por la sobreexposición a las bajas temperaturas. Cortar tiras angostas de cinta de celofán con hoja de afeitar en portaobjetos de vidrio. Inmovilizar todo insecto en un portaobjetos de vidrio utilizando tiras estrechas.
4. Insertar un alambre de tungsteno afilado químicamente en el tórax dorsal o el ojo para servir como el electrodo (tierra) indiferente.
5. Rellene electrodo de vidrio realizada en el paso 3.1 con una solución estimulante de interés. Usando una jeringa insertada, la tapa de llenadoIllary desde finales tirado al extremo romo. Flick a cabo todas las burbujas de aire, la celebración de fin derribado. Inserte un alambre de plata (cloruración opcional) en el electrodo de vidrio realizada en el paso 3.1 para servir como registro y electrodo de estimulación.
6. Conectar los electrodos a un preamplificador que está diseñado para grabaciones de contacto quimiorreceptora sensilla en los insectos. Este preamplificador (300 Hz-3 filtro de banda kHz) reducirá el tiempo de establecimiento para capturar la actividad neuronal tan cerca a los estímulos introducción posible. Recoger, almacenar y analizar las señales eléctricas utilizando un microordenador equipado con software de grabación de espiga.
   NOTA: Conexión a tierra del sistema de grabación correctamente puede mejorar drásticamente la relación señal-ruido.
7. Estimular sensilla con una solución de control (sólo electrolito) para asegurar la funcionalidad. Cuente picos a partir de 200 ms siguientes el artefacto de estímulo para todas las preparaciones.
8. Selección aleatoria de la orden de sustancias químicas de prueba para todos los experimentos, excepto los estudios de dosis-respuesta,para eliminar los prejuicios. Para los estudios de dosis-respuesta, exponer sensilla a concentraciones crecientes de la sustancia química experimental. Permita un mínimo de 3 minutos entre estímulos para asegurar una adecuada recuperación.
   NOTA: Este requisito puede variar dependiendo de los insectos y sensilla. Umbral se define como la concentración para la cual el error estándar no se superponga con el error estándar para la concentración más baja ensayada.

4. Aislamiento de ARN y secuenciación (Figura 2)

1. Preparar las majas RNasa libre herméticamente cerradas al enfriarlos en hielo seco antes de tejido disruption.Prepare acompañan majas sin RNasa para aerosol que se ajusten a los tubos de tapa a presión con fuerza. Mantenga los tubos de recogida cerrados a menos que la disección de forma activa para evitar el exceso de condensación.
2. Utilizando aspirador filtrada, colocar 30 a 40 mosquitos en frío anestesiados (15 seg en congelador a -20ºC) en el escenario frío y ordenar por sexo. Coloque los animales dorsal lado de abajo, agarrando las alas para no dañar apéndices gustativas.
3. El uso de dos pares de pinzas finas, diseccionar labella emparejado o tarsos de los machos o hembras con un microscopio de disección y limitar la inclusión de los tejidos adyacentes.
   NOTA: 500 labella emparejado rinde aproximadamente 800-1,000 nanogramos de mRNA total. 400 tarsos individual (5 segmentos cada uno) producen 1,200-1,800 nanogramos de mRNA total.
4. Con un par de fórceps-jadeantes, ligeramente captar proboscis de mosquitos justo proximal a labella exponer estiletes interiores. Uso de otro par de collection-forceps, quitar y agregar labella tejido a lado del tubo de recogida de frío.
5. Con un par de fórceps, ligeramente captar la pierna mosquito en la salida de la tibia y el primer segmento tarsal. Uso de otro par de pinzas, retire tarsos y añadir tejido a lado del tubo de recogida de frío.
   NOTA: Tener en cuenta los tipos de células en la superficie del tejido deseado y no deseado. Si bien es importante para limitar la inclusión de los tejidos vecinos, es igualmente importante no omitir porciones de tejido deseado. El fimuestra final debe representar con precisión todo el órgano de interés. Crear un límite preciso con las pinzas de agarre de tal manera que el fórceps de recogida pueden liberar precisamente por raspado o agarrar sólo el tejido deseado.
6. Periódicamente, de girar el tubo de recogida brevemente en 0 ° C centrifugar a 9000 xg para mantener el tejido en la parte inferior del tubo. Si la humedad se acumula en tubos de recogida durante la disección, añadir 50uL de reactivo Trizol fría para cubrir el tejido recogido.
7. El uso de marcadores de laboratorio anti-manchas, identificándolas claramente uno-RNasa libre de 1,5 ml encajen tubo con tapa para cada tipo de tejido para su recogida. El uso de 1,5 ml Gradilla para tubos y nitrógeno líquido, por congelación luego moler tejido en polvo fino (finas piezas si en Trizol). Repetir una vez. Aumentar el volumen total de Trizol a 1 ml y resuspender tejido fundamental por agitación.
8. Añadir 200 ul de cloroformo y mezclar bien. Después de 5 min a temperatura ambiente, de girar en centrífuga a 4 ° C y 11.000 xg durante 15 min. Cuidadosamenteañadir capa acuosa directamente a una columna de filtro de ADN genómico. Centrifugar a 11.000 x g durante 5 min. Añadir un volumen igual de RNasa libre de 70% de etanol a fluir a través y mezclar pipeta. Traslado líquido a una columna colección ARN y continuar la extracción de RNA según las instrucciones proporcionadas.
9. Cuantificar y evaluar la pureza del ARN total en un espectrofotómetro precisión y proceder con cualquier método de secuenciación de ARN estándar.

5. RT-PCR cuantitativa Validación de RNA Sequencing (Figura 3)

1. Seleccione tantos genes como posible comparar relativos niveles de expresión génica en un rango dinámico, tanto en abundancia predicho secuencia y función de los genes quimiosensorial presunta.
2. Pares de cebadores de diseño para cada gen diana para amplificar un 100 a 180 pares de bases producto de PCR específico. Excluir amplificación gDNA no específica asegurando al menos un cebador por juego abarca un límite de intrón. También puede utilizar el tratamiento DNasa para reducir la contaminación genómica.
3. Recogertejido de insectos como se describe en la sección anterior. Calcular la cantidad de tejido que se requiere para proporcionar suficiente ARN para completar todas las reacciones QRT-PCR.
   NOTA: triplicado Biológica y reacciones por triplicado técnicos proporcionarán máxima confianza en los resultados.
4. Calcula la cuantificación relativa de genes como _objetivo X ^{- (Ct [target] -Ct [referencia])} para cada gen diana y medio para cada replicar, tanto biológica como técnico. Utilice gen (s) de limpieza para normalizar los valores de Ct entre las réplicas biológicas y erradicar la escala del eje Y en las comparaciones de expresión relativa.
5. Evaluar la similitud de RNA-seq y conjuntos de datos qRT-PCR utilizando el, procedimiento de equivalencia de arranque basado en la regresión ^9, iterativa aplicado, a los datos de cada tejido.
   NOTA: Este procedimiento identifica la "región de similitud" más pequeño que puede ser construido en torno a los datos de RNA-seq y QRT-PCR observado, y permitir la expresión génica relativa medido por QRT-PCR para ser considerado estadísticamente equivalente a la medición de la expresión génica relativa por RNA-seq.

Resultados

Los registros de Trace de potenciales de acción de Ae. aegypti sensilla gustativa (Figura 1) demuestran la eficacia de la estimulación directa con una gama de productos químicos. Esta técnica se puede utilizar para cuantificar las respuestas a la estimulación de cualquier producto químico contando los picos de una amplitud y duración dada durante un intervalo de tiempo razonable (generalmente menos de 500 ms). Grabaciones de rastreo deben ser fácilmente reproducible bajo un conjunto dad...

Discusión

El aspecto más difícil de potenciales de acción de grabación de sensilla gustativa es decidir qué respuestas son "normales". Cuando se emplea un solo punta sensillum gustativa grabar la primera vez que una especie de insectos dado, el número total y sensibilidades de las neuronas receptoras gustativas (GRNs) son probablemente desconocido. Muchas grabaciones preliminares primera obligados a decidir el alcance y las concentraciones de los productos químicos para probar. En este caso, empezamos con la obse...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glass capillary	A-M Systems	628000	Standard, 1.5 mm X 0.86 mm, 4"
Silver wire	A-M Systems	7875	.015" bare
Tungsten wire	Alfa Products	369	0.127 mm diameter
Fine forceps	Fine Science Tools	11252	#5SF Inox
Refridgerated stage	BioQuip Products	1429	Chill Table
Preamplifier	Syntech	Taste Probe	preamplifier
Software for electrophysiology	Syntech	Autospike	software for electrophysiology
TetraMin fish food	Tetra	Tropical fish food granules	fish food ground to fine powder
TRIzol	Life Technologies	15596-026	RNA isolation reagent
RNeasy Plus Mini Kit	Qiagen	74136	includes gDNA eliminator and RNeasy spin columns
Nanodrop spectrophotometer	Nano Drop Products	ND-1000	tabletop spectrometer
R statistics	freeware (created by Robert Gentleman and Ross Ihaka)	www.r-project.org	Use the lm function of the stats package and the equiv.boot function of the equivalence package in the R computing environment.
1.5 ml tube rack	Evergreen	240-6388-030	Pour liquid nitrogen into a few empty wells to freeze and grind tissue.
1.5 ml collection tubes with pestle	Grainger	6HAX6	RNase free
Centrifuge	Thermo Scientific	11178160	Spin down frozen tissue to keep at bottom of 1.5 ml tube.
Primer-BLAST Primer Designing tool	NCBI	n/a