La medición de la función del músculo liso en el tejido aislado Bath-aplicaciones en Farmacología Investigación

Resumen

This protocol describes the measurement of isometric contraction in an isolated smooth muscle preparation, using an isolated tissue bath system and computer-based data acquisition.

Resumen

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues. While this technique has been implemented for over 100 years, the versatility, simplicity and reproducibility of this assay helps it to remain an indispensable tool for pharmacologists and physiologists alike. Tissue bath systems are available in a wide array of shapes and sizes, allowing a scientist to evaluate samples as small as murine mesenteric arteries and as large as porcine ileum – if not larger. Central to the isolated tissue bath assay is the ability to measure concentration-dependent changes to isometric contraction, and how the efficacy and potency of contractile agonists can be manipulated by increasing concentrations of antagonists or inhibitors. Even though the general principles remain relatively similar, recent technological advances allow even more versatility to the tissue bath assay by incorporating computer-based data recording and analysis software. This video will demonstrate the function of the isolated tissue bath to measure the isometric contraction of an isolated smooth muscle (in this case rat thoracic aorta rings), and share the types of knowledge that can be created with this technique. Included are detailed descriptions of aortic tissue dissection and preparation, placement of aortic rings in the tissue bath and proper tissue equilibration prior to experimentation, tests of tissue viability, experimental design and implementation, and data quantitation. Aorta will be connected to isometric force transducers, the data from which will be captured using a commercially available analog-to-digital converter and bridge amplifier specifically designed for use in these experiments. The accompanying software to this system will be used to visualize the experiment and analyze captured data.

Introducción

La disciplina de la farmacología ha utilizado el sistema aislado baño de tejido durante más de 150 años. La versatilidad de este sistema ha permitido a los científicos de todo el mundo para caracterizar receptores y la transducción de señales del receptor, con este conocimiento que forma la base de las terapias que se han tratado a millones de individuos con enfermedades o trastornos tales como hipertensión, insuficiencia cardíaca, diabetes, enfermedad gastrointestinal, la vejiga Los trastornos de disfunción, asma, y ​​para tragar, por nombrar sólo algunos. A día de hoy, el aislado baño de tejidos sigue siendo un aspecto importante del desarrollo de fármacos y la investigación básica, ya que permite que el tejido para que funcione como un pañuelo de papel. En esta lección JoVE, un protocolo formal es compartida para demostrar un experimento visual y virtual utilizando los datos de un experimento de baño de tejido aislado que mide la contracción isométrica, lo que permite la caracterización del receptor.

La principal ventaja de esta técnica es que el tejido está viviendo unaND funciones como un tejido completo, con un resultado fisiológico (contracción o relajación) que es relevante para el cuerpo. Es una síntesis de pasos (interacción fármaco-receptor, transducción de señales, la segunda generación de mensajero, el cambio en la excitabilidad del músculo liso, y el cambio en la función del tejido). Mientras que otras técnicas permiten el estudio de cada uno de estos pasos (por ejemplo, la unión de radioligando para la afinidad de la droga, la medición de segundos mensajeros), la técnica de baño de tejido aislado permite la integración de todos estos pasos ^1. Otra ventaja es que la retención de la función del tejido permite el cálculo de las variables farmacológicas importantes que son más significativo en un tejido vs un entorno celular; se trata más cerca de cómo los fármacos examinados trabajarían en el cuerpo como un todo.

Protocolo

NOTA: Todos los procedimientos descritos en este documento se realizan de acuerdo con las directrices establecidas por el Cuidado y Uso de Animales Comité Institucional (IACUC) de la Universidad Estatal de Michigan.

1. Preparación y configuración del sistema

1. Hacer 5 L de una solución salina fisiológica (PSS), que es la cantidad necesaria para un experimento de contracción baño de tejido que utiliza hasta 50 ml baños de tejido; ver Tabla 2 para la receta PSS. Calcular el volumen total requerido por multiplicar el número de baños de tejido veces el volumen del baño y luego multiplicando por el número de lavados de tejidos requeridos.
   1. Utilice la Tabla 2 como guía para hacer PSS. Disolver las sales en aproximadamente 4 L de agua. Se recomienda utilizar agua del Tipo I - HPLC: NOTA
   2. Añadir 8 ml de 1 M solución de _CaCl2 (147 g / L si se utiliza la sal dihidrato) a la solución, por lo que la solución final es de calcio 1,6 mM.
   3. Solución de PSS Quantum sufficit a 5 L.
2. Precalentar el sistema de baño de tejido a 37 ° C mediante la activación de la recirculación de baño de agua caliente. Paso Crítico: Cada componente del sistema es con camisa de agua, asegúrese de que están conectados en serie entre sí. La dirección del flujo es crítico - asegurarse de que los flujos de agua en cada componente en la conexión de púas más bajo y fuera en el más alto de conexión de púas.
3. Encienda el sistema de adquisición de datos. Encienda los transductores de fuerza por lo menos 15 minutos antes del experimento se equilibre la temperatura.
   NOTA: La mayoría de los transductores de fuerza emplean medidores de tensión que son sensibles a las variaciones de temperatura y exhiben deriva térmica inicialmente después de activar el detector.
4. Lanzamiento software de adquisición de datos y garantizar la conexión con el sistema de adquisición de datos. Por favor, siga las instrucciones del fabricante para permitir la grabación de datos.
5. Asegúrese de que los transductores de fuerza están calibrados antes de tejido se coloca en el baño de tejido y antes de la grabación de datos se ha iniciado; folas instrucciones del fabricante llow para la calibración.
6. Conecte el sistema de baño de tejido a un 95% de _O2 / 5% de CO ₂ cilindro de gas de uso médico y verificar que no haya fugas de gas y luego presurizar el sistema.
7. Llene los depósitos de baño tejidos con PSS y deje que el tiempo de solución alcance la temperatura óptima. Cebe el sistema y eliminar las burbujas de aire dentro del sistema y la tubería.
8. Compruebe aireadores de baño tejido para asegurar la aireación solución coherente, que oxigena el buffer PSS y proporciona movimiento browniano para distribuir drogas que se introducirán en el baño de tejidos durante el experimento. Asegúrese de aireación / burbujas no causa el movimiento del tejido, lo que perturbará grabaciones de datos; disminuir el flujo de gas como sea necesario.
   NOTA: El baño de tejidos y el sistema de adquisición de datos ya están listos para iniciar el experimento.

2. Preparación del tejido

1. Idealmente, diseccionar los tejidos del animal inmediatamente antes de su uso y colocarla directamente into PSS.
   NOTA: Algunos tejidos se pueden guardar en PSS noche a 4 ° C, pero los controles adecuados deben realizarse para validar la función del tejido después de un almacenamiento prolongado; véase la Sección 6.
2. Utilice la aorta torácica como el tejido en este ejercicio.
3. Anestesiar la rata de conformidad con las directrices institucionales y coloque la cara dorsal de la rata hacia abajo. Confirme anestesia a través de un dedo del pie-pinch y la pérdida de la respuesta refleja a este estímulo doloroso.
   NOTA: Este protocolo utiliza 70 mg / kg de pentobarbital entregado a través de una inyección intraperitoneal. Directrices institucionales para la anestesia de roedores pueden diferir.
4. Crear un neumotórax mediante la creación de una incisión con unas tijeras a lo largo de la membrana en la parte inferior de la caja torácica. A continuación, continuar la incisión de la parte inferior de la caja torácica hasta el esternón y la bisectriz.
5. Diseccionar o colocar a un lado aquellos órganos que están en la parte superior de la columna vertebral y localizar la aorta, que se encuentra directamente sobre la columna vertebral.
   NOTA: Este estep ofrece un espacio de trabajo claro para diseccionar la aorta.
6. Sever todas las conexiones a la aorta; desde el esófago, pulmón, etc., y cortar la aorta perpendicular a la columna vertebral a nivel del diafragma.
7. Aplique suavemente la aorta con unas pinzas y unas tijeras para diseccionar la aorta de la columna vertebral. Inicie la disección en la zona inferior del diafragma adyacente a la columna vertebral y el trabajo hacia el corazón. Asegúrese de tomar precauciones adicionales para no tirar o tirón en el tejido aórtico, lo que puede dañar el tejido.
8. Coloque inmediatamente la aorta en el plato de la disección preparado que contiene PSS.
   NOTA: La disección de la aorta en anillos se realiza mejor en un plato de disección que tiene una base de silastic negro. Esto permite el uso de cables que se pueden utilizar para canular la aorta y ser fijado al plato, proporcionando estabilidad mientras que en el plato de la disección. El fondo negro proporciona un contraste que ayuda a la disección. Se debe tener cuidado en el uso de cables de canulación como la endothelcapa de células ial se puede quitar con un exceso de roce del hilo en contra de la luz del vaso.
9. Tome un alambre y hacer un pequeño ángulo de 90 ° en un extremo y empuje el extremo en ángulo en la base de silastic para anclar el cable de guía. Colocar el total de la aorta en el plato de la disección.
10. Mantenga el extremo del alambre guía con unas pinzas, y luego pase suavemente el cable en el lumen de la aorta.
11. El uso de fórceps y deslice la aorta en el cable. Cuando el extremo libre del cable de guía es visible, curva el alambre suavemente y colocar el extremo libre en la base de silastic del plato para estabilizar el tejido.
12. Utilizando Vannas pequeñas tijeras y pinzas, retire el tejido adiposo perivascular y todo otro tejido extraño, coágulos de sangre, etc., hasta la aorta torácica aparece en blanco y un poco fibrosa.
13. Retire la aorta limpiado de alambre y utilizar tijeras para cortar la aorta en los anillos que son aproximadamente 3-5 mm de ancho.
14. Publicar un anillo aórtico en uno de un par de tiganchos DICIÓN mediante la celebración de el gancho y el uso de fórceps para deslizar suavemente el anillo en el gancho. Repita este proceso con el segundo gancho. Tenga cuidado para asegurar los ganchos no enredar; véase la Figura 3.
15. Compruebe que cada gancho tiene una sutura de seda diferente adjunto. Compruebe si un gancho tiene un pequeño lazo anudado de la seda que permite la unión a un vidrio o varillas de acero inoxidable, mientras que el otro es un 10-4 cm pieza larga de sutura que será para el transductor de fuerza atado a mano; véase la Figura 3.
    NOTA: Una vez que la aorta se fija a los ganchos, el tejido está listo para ser montado en el baño de tejido; véase la Figura 3.
16. Repetir los pasos 2.14 a 2.15, para montar un segundo anillo aórtico en la segunda cámara de baño de tejido.

3. Colocación del tejido en el baño

1. Tenga en cuenta que en este sistema, los propios baños de tejido son estacionarias. En este momento, llenar los baños de tejido con calentado, PSS aireado y permitir que la solución para llegar a la temperatura:e.
2. Con la sutura de seda, ate uno de los ganchos en la preparación del tejido a la clavija en la varilla de acero inoxidable. Coloque este extremo en la cámara de baño de tejido. Conecte la varilla a un soporte universal y coloque el otro extremo en la cubeta de tinción llena con PSS para mantener el tejido sumergido en tampón; véase la Figura 3.
   1. Colocar la varilla y el tejido en la cámara de baño de tejido y asegurarse de que el tejido esté totalmente inmerso en PSS y la varilla es seguro; véase la Figura 3.
   2. Ate el otro sutura para el transductor de fuerza y ​​asegúrese de dejar holgura en la sutura entre el tejido y el transductor de fuerza.
      NOTA: Este holgura será eliminado ajustando el micrómetro; véase la Figura 3.
3. Repita estos pasos para la segunda cámara anular y baño de tejido aórtico.

4. Ajuste de la tensión pasiva

NOTA: Cada tejido tiene una longitud (Lo) en el que las células musculares lisas responden optimally. Los experimentos preliminares para determinar la tensión de estiramiento óptima que logra esta longitud se debe realizar para cada tipo de tejido individuo para ser examinado. La aorta torácica de rata tiene una tensión de estiramiento pasiva óptima de 4 g.

1. Utilice el micrómetro / piñón y cremallera para aumentar la tensión de 2 g y esperar a que el tejido para llegar a la meseta. Una vez que se alcanza la meseta, aumentar la tensión otro 2 g y esperar a que el tejido a la meseta.
   NOTA: En los anillos de aorta, después de la tensión inicial de 2 g se ha puesto y meseta alcanzado, el tejido debe luego relajarse a ~ 1,6 g. Una segunda aplicación de 2 g traería el tejido a ~ 3,6 g, de la que el tejido se relaje de nuevo y la tensión disminuirá. Por lo tanto, después de haber añadido 4 g de la tensión total, el software debe indicar aproximadamente 3,2 g de tensión.
2. Repita estos pasos para la segunda cámara anular y baño de tejido aórtico.

5. Equilibrio y Toma de Drogas

1. Equilibrar el tejido durante60 min después de la aplicación de la tensión pasiva al tejido.
2. Durante la fase de equilibrio, lavar el tejido cada 15-20 min. Vaciar el baño de tejidos y reemplazar el PSS con PSS de un depósito calentado.
   NOTA: Durante este tiempo, el tejido se relajará, que se indica por la pérdida de la tensión pasiva.
3. Durante este tiempo, preparar medicamentos para el experimento, que deben ser de al menos 1.000 veces más concentrada que la concentración real en el baño, por lo que sólo se necesita un pequeño volumen de la madre de fármaco para conseguir la concentración deseada.

6. Desafío inicial

1. Al final del período de equilibrio, lavar el tejido por última vez, guardar los datos y volver a cero todas las entradas.
2. Elija un agonista (compuesto que provocará la contracción activa) a la que el tejido responde.
   NOTA: En la aorta torácica de rata, el músculo liso arterial se contraerá activamente a un agonista de los receptores adrenérgicos alfa debido a la inervación de latejido por el sistema nervioso simpático. Un agonista adrenérgico no sería útil en los tejidos intestinales dado que los agonistas adrenérgicos provocan la relajación. En este caso, un agonista de los receptores tales como acetilcolina (receptor colinérgico) podría ser utilizado. Una alternativa a tanto la fenilefrina y la acetilcolina es el uso de un agonista no receptor tales como niveles altos de potasio (K) como el primer desafío. En el músculo liso, de alta K opera para indirectamente los canales de calcio abierto y por lo tanto es visto como un índice general de la integridad del músculo liso.
   1. Realice el primer desafío o el reto de despertar por la adición de 10 ^-5 M fenilefrina al baño de tejido. Para alcanzar esta concentración en 50 ml de baño tejido, se añaden 50 l de una solución fenilefrina 10 ^-2 M.
      NOTA: 50 l en 50 ml de PSS es una dilución 1/1000, de modo que la concentración final es 1.000 x menos de la acción, o 10 ^-5 M. El conocimiento de volumen y mantenimiento constante del volumen dentro del baño de tejido cHamber es crítico para determinar la concentración de fármaco final.
3. Añadir 10 ^-5 M fenilefrina al baño de tejido y permitir la contracción a pico y luego meseta, cuando la pendiente de los datos se convierte en cero. Asegúrese de registrar cada evento experimental para ayudar al análisis post-experimental.
4. Después de meseta, lave el agonista a fondo por el vaciado y llenado de la cámara de baño de tejido con nuevo PSS. Asegúrese de registrar estos eventos también.
   NOTA: Una regla de oro es que la concentración de agonista en el baño se reduce 10 veces con cada lavado. Aunque, más de 3-4 lavados pueden ser necesarios para llevar el tejido hacia abajo a su tono de referencia de equilibrio (tensión).
5. Que el resto del tejido en tono de línea de base para ~ 10 min antes de continuar.

7. Experimento

NOTA: La prazosina, un antagonista del receptor adrenérgico alfa, será introducido a la cámara de baño de tejido para desplazar la resp concentracióncurva Onse a la fenilefrina (PE); este es un antagonismo demostrable.

1. Para un baño, añadir el vehículo (H ₂ O) en el que se disolvió la prazosina. A otro, añadir la concentración apropiada de prazosin. En este caso, añadir 25 l de vehículo para un baño y 25 l de 10 ^-5 M de concentración de prazosina a la otra para lograr una 5 x 10 ^-9 M o una concentración 5 nM en el baño.
   NOTA: Mientras que la adición de vehículo parece innecesaria en este ejemplo, es imperativo para hacerlo cuando se utilizan otros vehículos que tienen un potencial para ser vasoactivo (por ejemplo, DMSO, etanol, acetato). Añadir el vehículo correspondiente, incluso si existe poca evidencia de que sea vasoactivo.
2. Deja vehículo / prazosina en los baños y no lavar el tejido durante 1 hora.
   1. Mientras que los tejidos se equilibrándose, preparar múltiples concentraciones de agonista (PE). Incluye una amplia gama de concentraciones, de las concentraciones que suscitan ninguna respuesta (por ejemplo, </ Em> 10 ^-9 M PE) a concentraciones que superan la respuesta máxima (por ejemplo, 10 ^-4 M PE). Desde curvas concentración-respuesta son logarítmicas en la naturaleza, hacer seis soluciones separadas de valores de PE (10 ^-6 -10 ^-1 M) a través de diluciones seriadas de la solución madre 10 ^-1 M. Asegúrese de que el volumen necesario para cada concentración es ligeramente mayor que el triple del volumen total necesario para todos los baños (es decir,> 300 mu l).
3. Proceder a la adición de agonista, tal como se describe en la Tabla 1.
   NOTA: Este experimento generará una curva de respuesta a la concentración acumulada a PE; cada iteración tiene en cuenta la cantidad de sustancia ya añadida al baño. Las adiciones se producen hasta que ya no aumentan la contracción, o toda la curva se ha estabilizado.
   1. Añadir cada concentración de fármaco individualmente hasta que se alcanza el umbral de tejido.
   2. Si no se produce ningún cambio, añada la siguiente concentración en elserie; véase la Tabla 2.
      NOTA: El momento de estas adiciones depende del agonista utilizado. Por ejemplo, la noradrenalina y la contracción de la fenilefrina se desarrolla rápidamente, y deben estabilizarse en cuestión de minutos. Por el contrario, la endotelina-1 contracción se desarrolla lentamente y puede no estabilizarse por cerca de 45 minutos. Otros experimentación se puede hacer sobre el tejido después de la construcción de una curva como esta, siempre y cuando (1) la sustancia lavados fuera; y (2) se puede demostrar que el tejido vuelve a comportamiento normal contráctil y no se ve afectada por los estímulos previos.

Análisis 8. Datos

1. Asegúrese de guardar los datos inmediatamente antes y después de una intervención (por ejemplo, despertar o curva completa).
2. Encuentra y establecer la línea de base de tejido para cada canal / cámara de entrada de baño de tejido, que ayudará en el análisis de datos.
3. Una vez que la línea de base se establece, encontrar la respuesta máxima para cada concentración, y registrar el change de línea de base. Secuencialmente moverse a través de cada una de las concentraciones y registrar el cambio de línea de base.
4. Grafica los datos resultantes. Haced esto en cualquier programa de gráficos.
   NOTA: Graph Pad Prism está diseñada para los farmacólogos, y esto es ideal para el tipo de experimento que aquí se presenta.

Resultados

En términos de agonismo, la eficacia relativa (E _MAX) y potencia (CE ₅₀₎ de un agonista en un tejido determinado pueden ser calculados y comparados con las respuestas de otros agonistas en el mismo tejido ^1. En nuestro experimento, la aorta torácica de rata se incubó con vehículo o la α ₁ adrenérgicos prazosina antagonista del receptor (5 nM) durante una hora antes de añadir la α ₁ agonista adrenérgico fenilefrina al baño de tejidos y la generación de contracción (Figura 1).

La Figura 2 presenta modificados resultados de la Figura 1. Las respuestas verdes han marcado la contracción máxima alcanzada por PE marcado como máximo, la contracción máxima ½ marcado como tal y luego asociado con la concentración de PE que causó que la respuesta. La identificación de estos valores es la identificación de la concentración eficaz de un agonista que logra un medio max (50%) respuesta o CE _{50 valor. Este fue donegraphically en este software example.Computer que utiliza funciones logísticas para las curvas sigmoideas se pueden utilizar para ajuste de la curva y el cálculo de los valores de CE50.}

En la generación y la interpretación de estos resultados, es importante utilizar ambas bajas y altas concentraciones de agonista para crear la curva de concentración-respuesta. Sin suficientes puntos para mostrar una línea de base estable y máximo meseta, CE ₅₀ y E _MAX sólo se pueden estimar. Esto se hizo gráficamente en este ejemplo. Los programas informáticos que utiliza funciones logísticas para las curvas sigmoideas se puede utilizar para ajuste de la curva y el cálculo de los valores _de CE50.

Figura 1:. Tissue Bath esquemática de dibujos animados que representan un anillo de tejido colocado en la doble pared, con camisa de agua de tejido baXX. Buffer entrada y salida están regulados por una llave de vidrio de 3 vías integradas en la base de la cámara. O ₂ / CO ₂ se burbujea a través de un aireador que está sellado con una junta para evitar la fuga de gas o PSS. Recirculación de entrada está por debajo de la salida para mantener recirculación adecuada y evitar la formación de bolsas de aire que podrían causar la desregulación de la temperatura.

Figura 2:. Rata aorta torácica + endotelio La figura anterior representa cuatro experimentos independientes (diferentes animales y realizados por diferentes investigadores en diferentes montajes representados por diferentes colores) para poner a prueba la capacidad de la prazosina a cambiar una contracción inducida PE. Prazosin (5 nM) claramente desplazado hacia la derecha la curva de contracción inducida por PE-de una manera paralela.

Figura 3: Rata aorta torácica + endotelio estimación gráfica de los valores _de EC50 para el PE en ausencia (vehículo) y presencia (prazosin) de antagonista.. Línea verde (grupo C) sólo está marcado.

Sal	MW (g / mol)	5 Litros	MM FINAL
			(gramos)
NaCl	58.45	37.99	130
KCl	74.56	1.75	4.7
KH2PO4	136.1	0.8	1.18
MgSO4• 7h20	246.5	1.45	1.17
NaHCO3	84.21	6.25	14.9
Dextrosa	180.16	5	5.5
EDTA	380	0.05	0.03

Tabla 1: Normal solución salina fisiológica (PSS) Receta Contenido de la PSS bicarbonato de búfer usado en este experimento.. Se incluyen los pesos moleculares de todas las sales y la cantidad añadida a 5 L de dH ₂ O para conseguir la concentración deseada.

Concentración en el baño	La adición de agonista hecho para baño
1 x 10 -9 M	50 ml 1 x 10 -6 M
3 x 10 -9 M	100 ml 1 x 10-6 M
1 x 10 -8 M	35 ml 1 x 10 -5 M
3 x 10 -8 M	100 ml 1 x 10 -5
1 x 10 -7 M	35 ml 1 x 10 -4 M
3 x 10 -7 M	100 ml 1 x 10 -4 M
1 x 10 -6 M	35 ml 1 x 10 -3 M
3 x 10 -6 M	100 ml 1 x 10 -3 M
1 x 10 -5 M	35 ml 1 x 10 -2 M
3 x 10 -5 M	100 ml 1 x 10 -2 M
1 x 10 -4 M	35 ml 1 x 10 -1 M

Tabla 2:. Tissue Bath Aditivo Agonista concentraciones La cantidad de agonista que se añade a cada baño a properly construir las curvas de concentración-respuesta acumulada. La concentración del baño deseada se logra mediante la adición de cantidades secuenciales de concentraciones crecientes de agonista. Cada adición tiene en cuenta la concentración de agonista ya presente en el baño. Esto se hace para minimizar el aumento en el volumen en el baño de tejido que resultaría del uso de volúmenes crecientes de una única concentración de agonista.

Discusión

Medición de la fuerza isométrica como herramienta de investigación es más de 150 años, pero sigue siendo la técnica de prototipo para la caracterización de los receptores en los tejidos contráctiles ^2. El poder de esta técnica es en su simplicidad y versatilidad: mediante el registro de las respuestas provocadas por concentraciones crecientes de un agonista en presencia o ausencia de un antagonista, una gran cantidad de información puede derivarse de las características farmacológicas de cada fármaco y el receptor al que se se une ^3-5. Los experimentos de este tipo también cosechan información sobre el competitiva frente a la naturaleza no competitiva de los antagonistas utilizados, así como la heterogeneidad de receptor y efectos de drogas no específicos ^6-8. Así, con permutaciones simples a este experimento aislado baño de tejidos, un perfil farmacológico relativamente completo de los receptores que median la contracción muscular inducida por agonistas se pueden generar.

En términos de agonismo, THe eficacia relativa (E _MAX) y potencia (CE ₅₀₎ de un agonista en un tejido dado puede ser calculado y comparado con las respuestas de otros agonistas en el mismo tejido ^1. En nuestro experimento, la aorta torácica de rata se incubó con vehículo o la α ₁ adrenérgicos prazosina antagonista del receptor (5 nM) durante una hora antes de añadir la α ₁ agonista adrenérgico fenilefrina al baño de tejidos y la generación de contracción. La Figura 2 presenta los resultados modificado de la Figura 1. Las respuestas verdes han sido marcados con la contracción máxima alcanzada por PE marcado como máximo, la contracción máxima ½ marcado como tal y luego asociado con la concentración de PE que causó que la respuesta. La identificación de estos valores es la identificación de la concentración eficaz de un agonista que logra un medio max (50%) respuesta o valor _de EC50.

Desafortunadamente, con el parámetro dependiente de agonistaS sola para determinar las características de unión al receptor pueden ser complicadas ^9. Idealmente, los experimentos adicionales utilizando antagonistas de los receptores permiten que el cálculo de dos parámetros importantes que son la clave para la definición de la interacción entre un fármaco y un receptor: el -log ₁₀ de la disociación antagonista constante (pK _B) y el -log ₁₀ del antagonista molar la concentración necesaria para provocar doble desplazamiento hacia la derecha en la curva de concentración-respuesta (pA ₂₎ ^10. Tanto K _B y pA ₂ aumento de su utilidad en el hecho de que son los valores de agonistas-independiente, y se mantienen constantes, incluso entre diferentes tejidos ^11. A partir de los datos en la Figura 2, pK _B se puede calcular utilizando la siguiente ecuación y se basa en CE ₅₀ valores calculados en otra parte:

CE ₅₀ en ausencia de prazosin = 2 x 10 ^-8 M
CE ₅₀ en el presentido del prazosin = 7 x 10 ^-6 M

Resuelve para K _B en la siguiente ecuación:
log (dr-1) = log [B] - log K B
Dónde:
[B] = concentración de antagonista, o 5 x 10 ^-9 M. log (5 x 10 ^-9 M) = -8,3
dr = proporción de dosis de valor de _EC50 en presencia del antagonista / CE ₅₀ en ausencia. Si hay un desplazamiento hacia la derecha, este valor será mayor que uno. Por lo tanto:
dr = 7 x 10 ^-6 M / 2 x 10 ^-8 M o 700 x 10 ^-8 M / 2 x 10 ^-8 M = 700/2 = 350
Sustituyendo [B] y dr:
log (350-1) = -8 - log K _B
2.54 = -8 - log KB
pK _B = 10,54

Este valor de prazosina es consistente con los valores obtenidos cuando prazosina interactúa con un α ₁ adrenérgicos recepto ^12,13, lo que sugiere que el receptor adrenérgico la mediación de la contracción a la fenilefrina es el receptor adrenérgico α _1.

Varios pasos son críticos para el éxito de estos experimentos. Los tejidos deben permanecer en PSS después de la disección para evitar la pérdida de la viabilidad del tejido. Cualquier preparación muscular isométrica tiene una óptima relación longitud-tensión que genera la fuerza máxima contra la tensión pasiva ^14,15. Para el experimento descrito en este protocolo, la tensión óptima pasiva se determinó previamente mediante la adición de una breve incrementos de 0,5 g de tensión pasiva al tejido. El tejido debe comenzar sin tono y entonces después de 30 minutos de equilibrio, el tejido fue desafiado con una concentración máxima de KCl (80 mM), lo que generó tono activo. Entonces, el tejido se lavó y se le permitió regresar a tono de línea de base. Después de 15 min a la línea de base, se colocó otro 0,5 g de tensión pasiva y este proceso se repite hasta que una meseta detensión activa se logró con una tensión adicional pasiva. En experimentos preliminares, 4 g total de la tensión pasiva se determinó para lograr la máxima generación de tensión activo en anillos de aorta, y por lo tanto esta cantidad total de tensión se coloca en los anillos antes del equilibrio. Procedimiento, lo mejor es cero solicitud tensión pasiva antes, pero se puede hacer en cualquier momento antes del experimento. El exceso de estiramiento tejidos, en cualquier punto en el experimento o disección, afectará negativamente la viabilidad del tejido y los resultados experimentales. Esto es más imperativo al colocar los tejidos en el baño, ya que este paso tiene la mayor probabilidad de estiramiento excesivo. El lavado adecuado, en el número y la duración se requiere para efectos reproducibles. Un segundo desafío demasiado pronto después de un desafío inicial, o antes tejidos han regresado a la tensión de línea de base, dará lugar a respuestas aberrantes. Si el estudio de antagonistas / inhibidores reversibles, los tejidos no deben lavarse antes de agonista Además, como la inhibiconcentración tor se reducirá.

Hay notables ventajas y desventajas de los ensayos de baño tejidos aislados.

Desventajas: Los tejidos pueden experimentar diferentes grados de daño durante la extirpación quirúrgica o la colocación de anillos en los ganchos. Dado que la célula endotelial es el revestimiento interno del anillo aórtico, se debe tener cuidado en la colocación del anillo en ganchos para no dañar esta capa de células. Los tejidos también pueden tener muy diferentes períodos de tiempo en los que son viables en el baño de tejidos, y esto tiene que ser determinado; no todos los tejidos son los mismos. En esta línea, los tejidos pueden variar en su capacidad de respuesta a lo largo del día de tal manera que los controles de tiempo se convierten en un control necesario para cada experimento. Un buen ejemplo de esto es la tráquea de cobayo que mejora la contractilidad máximo por 100% durante un experimento típico de 8 hr. Los fármacos que son poco solubles en agua pueden precipitarse en el PSS. Finalmente, un acumulativand adiciones no acumulativas de un medicamento que es un agonista podría dar lugar a resultados diferentes si se produce desensibilización de los receptores al agonista; angiotensina II es una de esas drogas que muestra taquifilaxia rápidos.

Ventajas: Una de las principales ventajas de los experimentos de baño de tejido es que es en tiempo real; se puede ver el experimento ya que se desarrolla y puede hacer rápidamente conclusiones y planificar los próximos pasos, así como solucionar problemas durante un experimento. Un experimento toma un día para hacerlo. Tejidos múltiples se pueden preparar típicamente de un animal de tal modo que un animal puede servir como su propio control, y que añade fuerza a un experimento. También se puede aislar el tejido de otros factores con el fin de probar una respuesta relativamente puro del tejido a la droga. Experimentos in vitro tales como el sistema de baño de tejido también permiten el uso de una pequeña cantidad de fármaco en comparación con un experimento in vivo.

El diseño experimental básico descrito en el presente documento puede serextensivamente modificado para permitir la grabación de parámetros adicionales o la introducción de otros estímulos externos. Por ejemplo, la adición de electrodos permite la estimulación de campo eléctrico de los nervios que inervan ^16,17. Con la adición de sondas térmicas o de pH, los efectos de la temperatura y el pH sobre las respuestas contráctiles también se pueden medir ^18,19. Del mismo modo, el oxígeno se puede sustituir parcial o totalmente con N ₂ para evaluar los efectos inducidos por la hipoxia. Además, los mismos principios básicos de la medición de la contractilidad isométrica utilizados en este vídeo puede ser utilizado para desarrollar sistemas que permiten la medición concomitante de desarrollo de tensión isométrica y cambios en el calcio intracelular ^20. La transducción de señales también se estudia fácilmente, ya que existen sistemas que pueden congelarse rápidamente una muestra de tejido durante una respuesta, de manera que la actividad de un sistema de vía de transducción de señal puede ser verificada bioquímicamente.

La variación de equipment que se puede utilizar para hacer esto es enorme. Todo este sistema, cualquier mano construido o automatizado, se puede comprar de varias compañías diferentes. Los baños de tejidos y de los titulares de tejidos utilizados en este protocolo fueron (baños de tejido) y construida de mano (titulares), soplado a mano por un talleres de máquinas de la Universidad Estatal de Michigan en la casa.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
LabChart Software	ADInstruments		7.2
PowerLab (4 channel)	ADInstruments	ML760
QuadBridge (4 channel)	ADInstruments	ML112	ML112
Grass Adapter Cable	ADInstruments	MLAC11	MLAC11
Grass Force-displacement Transducer	Grass Instrument Co	FT03	FT03
Grass Transducer Cable	Grass Instrument Co	TAC-7 REV-1
BNC to BNC Cable	ADInstruments	MLAC01
IsoTemp 2100	Fisher Scientific		IC-2100
Tissue Bath	Multiple Sources
Physiological Salt Solution			PSS
Braided Silk Suture	Harvard Apparatus	51-7615	SP104
Ring Stand	Humboldt MFG Co	H-2122 7
Dissecting Dishes	Handmade with Silicone
Tygon Tubing	VWR Scientific	63010-100	R-3603
Hose Clamps	Cole-Parmer Instrument Co	06832-08	SNP-8
50 ml Muscle Bath	Eberhartglass Blowing	Custom
250 ml Warming Chambers	Eberhartglass Blowing	Custom
Gas Dispersion Tube	Ace Glass	7202-06	7202-02
Micrometer
Custom Stands
Three-prong Clamps	VWR International		Talon
S-connector	VWR International		Talon
Tissue Hooks	Hand Made in House	Custom
Tissue Dissection
Leica Stereomicroscope MZ6	Leica		10447254
Stereomaster Microscope Fiber-optic Light Source	Fisher Scientific	12562-36	12562-36
Culture Petri Dish	Pyrex		7740 Glass
Sylgard Silicone Elastomer	Dow Corning		Sylgard 170 Kit
Vannas Scissors	George Tiemann & Co	160-150	160-150
Splinter & Fixation Forceps	George Tiemann & Co	160-55	160-55