En Utero Inyecciones intra-cardiaca-lectina de tomate en embriones de ratón para medir el flujo sanguíneo renal

Resumen

This manuscript describes a technique for visualization of the developing vasculature. Here we utilized in utero intra-cardiac FITC-labeled tomato lectin microinjections on mouse embryos. Using this technique, we delineate the perfused and unperfused vessels throughout the embryonic kidney.

Resumen

La formación y la perfusión de desarrollar vasos sanguíneos renales (aparte de los glomérulos) han sido poco estudiados en gran medida. Como vasculatura se desarrolla a través de la angiogénesis (la cual es la ramificación fuera de los grandes vasos) y vasculogénesis (de novo la formación de vasos), técnicas de mapeo de perfusión como moldes de resina, vivo de imágenes de ultrasonido en y micro-disección se han limitado en la demostración de las relaciones íntimas entre estos dos procesos y estructuras renales en desarrollo en el embrión. Aquí se describe el procedimiento de In Utero intra-cardíacos guiadas por ultrasonido marcados con FITC microinyecciones lectina de tomate en embriones de ratón para medir la ontogenia de la perfusión renal. Tomate lectina (TL) se perfundió todo el embrión y los riñones cosechado. Los tejidos fueron co-teñidos para diversas estructuras renales que incluyen: progenitores nefrona, estructuras nefrona, el epitelio uretral y la vasculatura. A partir de E13.5 vasos de gran calibre se perfundieron, sin embargo periféricavasos permanecieron no perfundido. Por E15.5 y E17.5, pequeños vasos periféricos, así como glomérulos comenzado a ser perfundido. Esta técnica experimental es fundamental para estudiar el papel de la vasculatura y el flujo sanguíneo durante el desarrollo embrionario.

Introducción

Durante el desarrollo embrionario dos procesos discretos, pero simultáneas, vasculares tienen lugar: la angiogénesis, el proceso por el cual un recipiente crece de un vaso principal, y la vasculogénesis pre-existente, que es una formación de novo de los vasos a partir de progenitores endoteliales residenciales ^1,2. Respectivamente, el primero es sinónimo de flujo de sangre, mientras que el último se cree que tener lugar en gran medida en ausencia de la misma.

Simultáneamente a la formación de vasos sanguíneos, un proceso cíclico y dinámico de la síntesis renal de células progenitoras, la proliferación y la diferenciación comienza a desarrollarse en el día embrionario 9,5 (E9.5). En este punto la yema ureteral (UB) invade dorsal en los alrededores mesénquima metanéfrico (MM), y continúa hasta el nacimiento ^3. Repetida de ramificación de la UB en condensación rápidamente mesénquima metanéfrico tapa comienza la formación de las unidades funcionales del riñón, la nefrona. Con cada nueva generación de la UB y nephron, las generaciones mayores son desplazados en regiones corticales y medulares interiores, donde luego se someten a más de maduración y diferenciación dentro de los entornos principalmente vascular-densos. Como se desprende de Dressler et al., ^3, este proceso embriológico se precipita por la señalización inductiva, como diafonía entre UB y MM, y una miríada de factores extracelulares ^3-6. Dos factores extracelulares recientemente investigados dentro del páncreas y los riñones incluyen el desarrollo de la tensión de oxígeno y el flujo sanguíneo ^7,8. Este último será discutido en más detalle a continuación en relación con el desarrollo del riñón.

Con el fin de exponer el papel inductivo que el flujo sanguíneo potencialmente juega en la diferenciación de células progenitoras nefrona, así como en otros procesos de organogénesis, métodos precisos y exactos de mapeo de flujo de sangre embrionaria es imprescindible.

Los métodos alternativos para medir el flujo sanguíneo incluyen la prescripción de ultrasound de imágenes y resina yesos ^9,10. En conclusión, estos modos se ha demostrado que ser inherentemente carente de su capacidad para dar a conocer simultáneamente yuxtaposiciones temporales y espaciales entre el flujo sanguíneo y diferenciación de células madre. Moldes de resina, por ejemplo, proporcionan un modelo válido de patrón embarcación dentro de los tejidos adultos, sin embargo en los vasos inmaduros, como con los puntos de tiempo embrionarias, los vasos son muy poco desarrollado y con goteras. Por lo tanto, la resina arroja fallar para mantener dentro de los vasos pequeños, a menudo porosa.

Por estas aparentes obstáculos, entre otros, se optó por incorporar guiada por ultrasonido vivo intra-cardíacos lectina de tomate embrionario (TL) en microinyecciones en nuestras investigaciones sobre el desarrollo del riñón. En este procedimiento utilizamos una sonda de ultrasonido para guiar sincrónicamente una aguja montada micropipeta llena con 2,5 l de solución de TL en el ventrículo izquierdo de embriones de ratón en los puntos de E11.5, E13.5, E15.5, E17.5 y de tiempo. E170.5 es la última edad de desarrollo como las agujas no son lo suficientemente fuertes como para penetrar en el embrión más desarrollado.

Las ventajas de este método de microinyección son abundantes. Microinyección guiada por ultrasonido permite la colocación precisa de una aguja de inyección dentro del ventrículo izquierdo embrionario, la expulsión pasiva y controlada de solución en el corazón de la animal, un daño mínimo al corazón y los tejidos circundantes, y la evitación de la insuficiencia cardiaca súbita y la muerte de la embrión antes de la perfusión de todo el cuerpo. Con el uso de un TL marcado con FITC, cualquier vasculatura perfundido mantendrá el marcador a lo largo de su membrana apical endotelial. En combinación con la inmunohistoquímica, utilizando Pecam (CD31, plaquetas molécula de adhesión celular endotelial) y varios otros marcadores vasculares, somos capaces de distinguir claramente entre los vasos perfundidos y un-perfundido, así como caracterizar cualquier tinción aberrante de los tejidos circundantes.

Protocolo

NOTA: La Universidad de Pittsburgh Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión aprobó todos los experimentos.

1. Elaboración de Instrumentos Ultrasonido-microinyección y embriones

1. Establecer el escenario, montaje, y la sonda (Figura 1), así como los instrumentos quirúrgicos (Figura 2). Solución salina tamponada (PBS) Place solución de fosfato (pH 7,4) en un baño a 37 ° C el calentamiento. Llenar aguja de microinyección completamente con aceite mineral, usando 1 ml jeringa conectada a un segundo G aguja flexible 25, a través de su base.
2. Fijar la aguja en la rotación de montaje del brazo, y la aguja vacía de solución de aceite mineral. Vuelva a llenar con 2,5 l de solución TL. Asegúrese de que no hay burbujas de aire dentro de la aguja de inyección. Gire el brazo de la aguja hacia la pared, fuera de los escenarios.
3. Anestesiar la madre embarazada en la cámara de anestesia mediante infusión continua de isoflurano. Cuando la madre está inconsciente, la transferencia de la anestesia para tubo nariz colocada en el caudal lado del escenario, y el lugar madre en posición supina, con el hocico en el tubo de la nariz para permitir la continuación de un estado totalmente anestesiado.
4. Extremidades de cinta en ángulos de 45 °, o con las manos y los pies descansados ​​y posicionados overtop ECG pestañas / monitor de temperatura. Es importante que la presa embarazada se monitoriza continuamente para asegurar que la anestesia es suficiente y que la pomada en aplicada a los ojos para reducir el secado.
5. Aplique el producto a través de la eliminación del vello inferior del abdomen de la madre, limpie suavemente con hisopos de algodón seco, y luego de nuevo con un 70% hisopos de algodón con etanol saturado para eliminar cualquier exceso de producto y el cabello. Asegúrese de limpiar la piel abdominal fuera de todo el pelo en el sitio de la incisión (Figura 3).
6. Realice una laparotomía en la madre embarazada utilizando pinzas y tijeras quirúrgicas finas. Tenga cuidado de no cortar ninguna vasos principales u órganos viscerales. Hacer primero, incisión recta de epidermis 1,5-2 cm por encima de la vagina y continuar cortar hacia las costillas para approximately 2-3 cm. Exponer la membrana subcutánea, busque la línea alba ("línea blanca") (Figura 3), y corte paralela a la incisión inicial, a lo largo de la misma longitud, para exponer interno órganos viscerales y sáculos uterinos.

2. Extracción de embriones

1. Utilice bastoncillos de algodón de 6 pulgadas de maniobrar madre y embriones. Presione suavemente (no la fuerza) en la piel con aplicador para manipular primer embrión de la apertura de la incisión. Después de la extracción del primer sáculo embrión, suave y lentamente tire del resto del cuerno uterino a través y hacia el exterior de la madre. Evite tirar intestino u otros órganos a través de la incisión en esta etapa.
2. Cuantificar los embriones y coloque suavemente cuerno uterino izquierdo de nuevo en madre. Entonces comenzar a colocar el cuerno uterino derecho de nuevo en madre a partir de la más lejana sáculo embrión de la vagina en el cuerno y se mueve hacia abajo. Continúe hasta que sólo dos embriones permanecen expuestos (Fifigura 4). Por último, los embriones de posición en una columna anterior y paralela a la línea de incisión, siendo consciente de no cortar la circulación uterina.
3. Coloque bloques de arcilla y posición entre los brazos y el cuerpo, así como las piernas y la cola. Asegúrese de que las superficies de arcilla son aproximadamente la altura de laparotomía. Moje la placa de Petri fenestrado con 37 ° C PBS.
4. Agarre extienden fórceps con la mano derecha y el plato de Petri fenestrado con la mano izquierda (fenestración paralelo a los embriones) y llevar cerrado fórceps ~ 5-cm a través de la fenestración, desde la parte superior de la placa de Petri. Fórceps abierto completamente sin desgarrar la malla fenestración.
5. Maniobra manos por encima de los embriones y enfocar la vista en los dos sáculos embrión. Sin (o poco) tocando sáculos con mallado fenestración o fórceps, deslice a través de ranura y fija una placa de Petri en el abdomen de la madre. Con pinzas todavía extendidos, manipular malla fenestrado para asentarlo en ambos lados y en la base de cada embrión (Figura 5 ) y tire de pinzas de apertura de hendidura.
6. Luego, coloque goma azul que contiene la pared en una placa de Petri, sin pellizcar o dañar embriones (Figura 6). Hacer bloques de arcilla estén equilibrando firmemente placa de Petri, embrión, y la pared que contiene goma. Por último, llenar el plato de Petri con 37 ° C PBS hasta que los embriones se sumergen por completo (Figura 6), mientras que el control de fugas en el mallado fenestrado.

Procedimiento 3. Inyección

1. Etapa de inyección inferior con la madre y embriones abajo utilizando la perilla de ajuste de nivel Z (Figura 1) y luego gire la aguja de inyección y montaje en brazo y se alinea directamente con sonda de ultrasonido, con ½ aguja cm a la izquierda y debajo de la punta de la sonda (Figura 7) . Empuje aguja-brazo (no de la aguja) 45 ° lejos de la sonda. Tenga cuidado de no golpear la punta de la aguja con la sonda plato o una ecografía.
2. Levante etapa de inyección de nuevo a la altura original, con ultrasonido pbata directamente encima de la sonda embriones debe estar sumergida ligeramente y dentro de 3-4 mm de tejido embrionario. Utilice X & Y mandos de ajuste etapa (Figura 8) para modificar la posición del embrión / madre / etapa de localizar sistemáticamente el corazón embrionario de latir.
3. Directamente Centro de pantalla del ultrasonido observar un objetivo central negro marcador dibujado (*). Busque ventrículo izquierdo (preferible) o atrio utilizando los botones de ajuste etapa X & Y (Figura 8) y luego subir o bajar del escenario con el botón giratorio en la etapa de posicionar objetivo inyección con precisión sobre el marcador central negro en la pantalla del ultrasonido.
4. Utilice la perilla de ajuste etapa X para mover embrión hacia la derecha, fuera de la pantalla del ultrasonido. Vuelva a colocar la aguja de microinyección y el brazo en su lugar, ½ cm de distancia de y 90 ° a la sonda de ultrasonido (Figura 7).
5. El uso de microinyección montaje mandos de ajuste (Figura 9C-G), aguja posición con la punta claramente alDiseñada con el marcador central. Ajustar el ángulo de inyección (usando perillas en la figura 9C y EG), y X, Y, Z y vectores de micro-aguja para asegurar punta de la aguja se centra en el plano correcto. Repliegue aguja de microinyección usando únicamente el mando de "inyección" (Figura 9F), cuidado de no ajustar otras dimensiones.
6. De nuevo, usando únicamente el ajuste fino perilla etapa movimiento embrión X de nuevo bajo la sonda, con la meta exactamente en el punto central de la pantalla del ultrasonido. Asegúrese de que el ventrículo izquierdo es ahora exactamente en la misma X, Y, y Z avión.
7. A continuación, con montaje sólo la perilla de "inyección" en la microinyección, perfore lentamente embrión con la aguja de microinyección y llevar lentamente la punta hacia el ventrículo izquierdo. Inyectar la totalidad de 2,5 l de solución TL en el ventrículo izquierdo o hasta que suena la señal vacías, mediante la celebración de "vacío" y pulsando "llenar" una vez (Figuras 2A y B). En este momentode la inyección observar una sombra que emana de la punta de la aguja que es el TL entrar en la cámara cardiaca (Figura 10). A la inversa, retraer rápidamente aguja de microinyección girar la "inyección" perilla (Figura 9F) en la microinyección se monta cuando la inyección se ha completado.
8. Continúa en el próximo embrión y repita este procedimiento para los embriones restantes que siguen esta serie de pasos y finalmente colocar los embriones finales de nuevo en el abdomen de la presa. Cambie la anestesia a la caja de la cámara y mover suavemente madre aquí durante 15 minutos desde el momento de la última inyección.

4. La recolección de embriones y Análisis

1. Sacrificar presa a través de la dislocación cervical. Ampliar la laparotomía para eliminar fácilmente los cuernos uterinos de la madre. Mantener los embriones dentro de saco uterino. Coloque embriones en PBS enfriado.
2. Diseccionar embriones de saco uterino (si el tejido cobrar necesaria para el genotipado) y coloque todo el embrión in 4% paraformaldehído (PFA) durante la noche, y luego en el 30% de sacarosa durante la noche, se congele en criostato seccionar medio. A continuación, corte la criosección y colocarlo en portaobjetos para el análisis inmunohistoquímico. Opcionalmente, utilice toallitas para todo el montaje por deshidratación en el 100% de metanol, después de la fijación en el 4% PFA.
3. Para el análisis inmunohistoquímico colocar los cryosections en PBS para eliminar la OCT. Entonces bloquear las secciones con 10% de suero normal de burro durante 30 min. A continuación, agregue PECAM anticuerpo primario a dilución 1: 100 la noche a 4 ° C. Al día siguiente, se lavan los portaobjetos en PBT 3 veces durante 10 minutos cada uno y agregar burro anti rata 594 secundaria e incubar durante 1 hora a temperatura ambiente.
   NOTA: Esta es una técnica muy exigente que requiere la optimización y coordinación de la ecografía y la microinyección. Hay una curva de aprendizaje muy grande en relación con esta técnica y requiere cuatro a seis semanas de inyecciones mentor antes de que uno se convierte en dominio.

Resultados

Formación Vascular precede flujo en el desarrollo del riñón

Una mayoría de tejido embrionario (incluyendo el riñón) contiene una vasculatura densa (ambos no perfundido y perfundidos), incluso en los primeros puntos de tiempo embrionarias. Para un mejor calibre y analizar el flujo de sangre dentro del riñón en desarrollo se utilizó un método de In Utero microinyecciones intracardiaco embrionarias. Con el uso de un ultrasonido de alta resolución para identificar el corazón embriona...

Discusión

Anestesia Microinyección y marco de tiempo

Con respecto a la anestesia de la madre, es esencial para mantener constante el flujo de aire (2-3 L / min) y a baja PSI. El flujo del sedante debe mantenerse a aproximadamente 1,75 a 2 L / min. Al mismo tiempo, los plazos en que las inyecciones se realizan deben ser monitoreados y controlados para con cada camada de cerca. Para cada camada el procedimiento de inyección debe mantenerse en 45 min. La importancia de este límite de tiempo es de suma...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
DAPI	Sigma Aldrich	022M4004V	concentration 1:5,000
Pecam	BD Biosciences	553370	concentration 1:100
FITC-Tomato Lectin	Vector Laboratories	FL-1321	concentration 2.5 µl / embryo
Alexa Fluor-594 (Donkey Anti-Rat)	Jackson Immunoresearch	712-585-150	concentration 1:200
Microinjection Needle	Origio Mid Atlantic Devices	C060609
Mineral Oil	Fisher Scientific	BP26291
1 ml syringe	Fisher Scientific	03-377-20
Clay Blocks	Fisher Scientific	HR4-326
Surgical Tape	Fisher Scientific	18-999-380
PBS	Fisher Scientific	NC9763655
Hair Removal Product	Fisher Scientific	NC0132811
Surgical Scissors	Fine Science tools	14084-08
Fine Forceps	Fine Science tools	11064-07
Surgical Marking Pen	Fine Science tools	18000-30
Right angle forceps (for hysterectomy)	Fine Science tools	11151-10