Demostración Laboratorio Fisiología: tasa de filtración glomerular en una rata

Resumen

The purpose of this protocol is to demonstrate the principles and techniques for measuring and calculating glomerular filtration rate, urine flow rate, and excretion of sodium and potassium in a rat. This demonstration can be used to provide students with an overall conceptual understanding of how to measure renal function.

Resumen

Measurements of glomerular filtration rate (GFR), and the fractional excretion of sodium (Na) and potassium (K) are critical in assessing renal function in health and disease. GFR is measured as the steady state renal clearance of inulin which is filtered at the glomerulus, but not secreted or reabsorbed along the nephron. The fractional excretion of Na and K can be determined from the concentration of Na and K in plasma and urine. The renal clearance of inulin can be demonstrated in an anesthetized animal which has catheters in the femoral artery, femoral vein and bladder. The equipment and supplies used for this procedure are those commonly available in a research core facility, and thus makes this procedure a practical means for measuring renal function. The purpose of this video is to demonstrate the procedures required to perform a lab demonstration in which renal function is assessed before and after a diuretic drug. The presented technique can be utilized to assess renal function in rat models of renal disease.

Introducción

The most important function of the kidney is the homeostatic regulation of extracellular water and electrolyte content. The kidneys closely regulate extracellular water, sodium (Na) and potassium (K) to maintain normal physiological levels. Disturbances in renal function can result in serious metabolic disorders which can be fatal. The basic renal process occurs in the nephron and begins with the filtration of plasma at the glomerulus and ends with the excretion of urine. Other processes that determine the final concentration of water, Na and K in the urine are secretion and reabsorption within the nephron. Measurements of glomerular filtration rate (GFR) and the fractional excretion of Na and K are critical in assessing renal function in health and disease. The reader is referred to previously published review articles and textbooks for a more thorough discussion of kidney function^1-4.

GFR can be measured as the steady state renal clearance of inulin which is filtered at the glomerulus, but not secreted or reabsorbed along the nephron⁵. While this technique requires anesthesia, surgical preparation, and a terminal experiment, it is considered the gold standard of GFR measurement. Using inulin that is tagged with fluorescein-isothiocyanate (FITC), plasma and urine concentration of FITC-inulin can be easily measured in small volumes and used to calculate GFR during multiple time points of an experiment. The fractional excretion of Na and K can be determined from the concentration of Na and K in plasma and urine.

The conceptual understanding of how to measure renal function can easily be demonstrated in a short lab designed to allow students to actively participate in some aspects of the experiment. This video depicts the pre-lab preparation, the renal function demonstration, and the post-lab evaluation of results. The surgical techniques necessary for making measurements of GFR are demonstrated in an anesthetized rat. In addition, example calculations for GFR, and the fractional excretion of Na and K are shown before and after administration of a diuretic drug.

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Protocolo

Antes de cualquier procedimiento de animales, el cuidado de los animales y el uso comité institucional (IACUC) debe aprobar el protocolo. Este protocolo fue aprobado por la Universidad Estatal de Michigan IACUC.

1. Preparación Pre-laboratorio de la solución de FITC-inulina

1. Caliente 20 ml de solución salina a 70 ° C y agitar lentamente en 100 mg de FITC-inulina (5 mg / ml de FITC-inulina) hasta que se disuelva todo inulina.
2. Solución enfriar a ta y añadir 800 mg de albúmina de suero bovino (40 mg / ml de BSA, polvo liofilizado, esencialmente globulina libre, bajo la endotoxina, ≥98% de pureza por electroforesis en gel de agarosa).
3. Se filtra la solución de inulina-BSA con papel de filtro (grado 1). Coloque la solución filtrada en una jeringa de 20 ml con un filtro de jeringa de punta (0,2 micras) y cubrir con papel de aluminio para protegerlo de la luz.

2. Anestesia y Cirugía

1. Coloque la rata en una cámara de inducción lleno con 5% de isoflurano para inducir la anestesia. Bod Recordpeso y (250-350 g) y coloque la rata en una plataforma quirúrgica calentada diseñado para mantener 37 ° C la temperatura del cuerpo durante todo el experimento. Asegurar suavemente la rata a la plataforma con cinta de laboratorio sobre las patas. Mantener la anestesia con isoflurano al 1-2% con grado médico 100% de O ₂ a la tasa de flujo de aire de 0,8 a 1,0 l / min.
2. Inserte un catéter cónico (OD punta intravascular, 2.7F) en la arteria femoral de la presión arterial y la frecuencia cardíaca, y toma de muestras de sangre.
3. Insertar un catéter (PE-50) en la vena femoral para la infusión de inulina. Asegure el catéter al tejido circundante con sutura quirúrgica trenzada seda 5-O ^6.
4. Conecte el catéter arterial a un transductor de presión del calibrador de tensión. La presión arterial y la frecuencia cardíaca Record usando software de adquisición de datos y visualización en una pantalla de ordenador en tiempo real. Esta técnica se muestra en detalle en el vídeo ^6.
5. Exponer la vejiga a través de una incisión suprapúbica. Corte un pequeñoagujero en la punta de la vejiga e insertar una cánula (PE-190) con un calor extremo estallaron dentro de la vejiga para la recolección de orina. Fije la cánula a la vejiga con una sutura en bolsa de tabaco.

3. La orina y extracción de sangre

1. Coloque la jeringa de FITC-inulina en una bomba de jeringa con un caudal conjunto de 1 ml / hr por 100 g de peso corporal (3 ml / h para una rata de pesaje 300 g). Conecte la jeringa al catéter de la vena femoral. Iniciar la infusión de inulina y permitir un período de equilibrio 2.1 hr. Mantenga la jeringa cubierto con papel de aluminio para protegerlo de la luz.
2. Determinar si la tasa de flujo de orina es estable y adecuado para el análisis de la muestra (20 l / min) por recogida de una muestra de orina en un vial de recogida pesada previamente durante un período de 10 min. Determinar el volumen de orina por gravimetría con una balanza digital. Un volumen de orina adecuada para un periodo de recogida de 10 minutos es de 0,2 ml. Continuar para recoger muestras de orina hasta dos colecciones consecutivos indican una tasa de flujo de orina de 20 l / men o más.
3. Muestras Pre-Droga
   1. Se recoge una muestra de orina durante un período de 20 min. Se recoge una muestra de sangre (0,5 ml) del catéter arterial en el punto medio del período de recolección de orina. Tenga cuidado para borrar por completo el catéter arterial de solución salina antes de recoger una muestra de sangre en un frasco de colección que contiene 1 U de heparina. Utilice viales de colección con las marcas de volumen para facilitar la recogida de 0,5 ml de sangre arterial.
   2. Enjuague el catéter arterial con heparina-solución salina (20 U / ml) para borrar el catéter de la sangre (aprox. 0,1 ml). La longitud del catéter arterial debe ser tan corto como sea posible para limitar el volumen de solución salina de heparina necesaria para tirar.
      Nota: Las muestras de sangre diluidas producen cálculos incorrectos de la TFG y la excreción fraccional de Na y K.
   3. Espere 10 minutos y repetir el cobro de una segunda orina Pre-drogas y muestra de sangre.
4. Después de la colección de dos muestras Pre-drogas, administrar un diurético Drug, furosemida (10 mg / kg), a través del catéter arterial. Lave el catéter arterial con solución salina heparinizada para despejar el catéter de la droga. Tenga cuidado para evitar la inyección de aire a través del catéter arterial. Registre el momento de la inyección de furosemida.
5. Las muestras post-drogas: En cada uno de los 3 puntos de tiempo abajo, recoger una muestra de orina durante el período de recogida de 10 minutos, y una muestra de sangre (0,5 ml) en el punto medio del período de recolección de orina.
   1. Para Post-Drogas de la muestra 1 - recoger cinco minutos después de la furosemida.
   2. Para la muestra post-Drogas 2 - recoger diez minutos después de la furosemida.
   3. Para la muestra post-Drogas 3 - recoger quince minutos después de la furosemida.
6. Después se han recogido todas las muestras, la eutanasia la rata de conformidad con los procedimientos institucionales de la toracotomía y la extracción del corazón. Retire ambos riñones. Decapsulate (quitar la membrana que rodea) y sacudir a los riñones a eliminar el exceso de sangre. Pesar los riñones.

4. Análisis de las muestras

1. Mida todos los volúmenes de muestra de orina por gravimetría con una balanza digital y pesos de discos.
2. Muestras de sangre entera de centrífuga con una centrífuga de sobremesa (1800 xg) para separar el plasma. Transferir las muestras de plasma a los pequeños viales etiquetados.
3. Analizar las concentraciones de Na y K en las muestras de orina y plasma con un analizador de sodio / potasio.
4. Medición de FITC-inulina en plasma y orina
   1. Diluir la orina pre-fármaco (de 1: 200 a 1: 400), y la orina post-fármaco (1:10) con tampón HEPES (500 mM, pH 7,4).
   2. Añadir 40 l de l estándar o muestra y 60 de tampón HEPES en una placa de 96 pocillos (una muestra por pocillo) y se deja mezclar durante 10 min mientras está cubierto con papel de aluminio.
   3. Generar una curva estándar para FITC-inulina para las concentraciones de 6,25, 12,5, 25, 50, 100, 200, 400 g / ml (Figura 1). Determinar la fluorescencia FITC-inulina en las muestras y estándares utilizando un lector de microplacas con su excitas y emisión de longitudes de onda 485 y 538 nm, respectivamente.
   4. Ajustar los valores fluorescentes para los estándares de un análisis de regresión la función logística de 4 paramter. Los parámetros de la función de regresión se utilizan para calcular la concentración de FITC-inulina en muestras de plasma y orina (Tabla 1).

Análisis 5. Post-laboratorio de Resultados: Cálculos

1. Calcula orina Caudal (UV; ml / min): [volumen de orina recogido (ml)] ÷ [momento de la recolección (min)]
2. Calcular tasa de filtración glomerular (TFG; ml / min): [concentración de inulina de orina (mg / ml) x UV (ml / min)] ÷ [inulina concentrado de plasma. (G / ml)]
3. Calcular filtrada de sodio de carga (mol / min): concentración plasmática de sodio (mmol / ml) x TFG (ml / min)
4. Calcular sodio Excreción Rate (U _Na V; mol / min): concentración de sodio en orina (mol / ml) x UV (ml / min)
5. Calcula fraccional excreción de sodio (Na FE;%): [U _Na V (mol / min)] ÷ [Filtrado de carga de sodio (mmol / min)] x 100
6. Calcular carga filtrada de potasio (mol / min): concentración de potasio de plasma (mmol / ml) x TFG (ml / min)
7. Calcular potasio Excreción Rate (U _K V; mol / min): concentración de potasio en orina (mol / ml) x UV (ml / min)
8. Calcula fraccional excreción de potasio (K FE;%): [U _K V (mol / min)] ÷ [Cargar potasio filtrada (mol / min)] x 100

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Resultados

El diurético utilizado en la demostración de laboratorio era furosemida que inhibe muy rápidamente la reabsorción de Na y K filtrada por el riñón resulta en aumento de Na, K, y la excreción de agua en cuestión de minutos de la administración del fármaco. Por su mecanismo primario, furosemida debe tener efectos mínimos sobre la tasa de filtración glomerular y de la carga filtrada de Na y K, pero aumentará el flujo de orina y la excreción fraccional de Na y K.

Los resultados repr...

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Discusión

Un marcador adecuado para la medición de la TFG debe cumplir con cuatro criterios: se filtra libremente en el glomérulo, sea no unido a las proteínas plasmáticas, y ni ser absorbida ni secreta en la nefrona. La inulina es un polímero de la fructosa que satisface estos criterios. Como resultado, el aclaramiento renal de inulina se considera el estándar de oro para medir la TFG ^7. La técnica demostrada representa el enfoque tradicional de la determinación del aclaramiento renal de inulina usando muestra...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-0 Braided Silk Surgical Suture	Surgical Specialties Corp	SP1033
Assay Plate, 96-Well	Costar	3922
Bovine Serum Albumin	Sigma Chemical Co	A2934-25G
Centrifuge	Beckman Coulter	MicroFuge 18, 357160
Conical Sample Tubes	Dot Scientific Inc.	#711-FTG
Cotton Tipped Applicators	Solon Manufacturing Co	56200
Data Acquisition Software	ADInstruments	LabChart Pro 7.0
Digital Scale	Denver Instrument	APX-4001
FITC-Inulin	Sigma Chemical Co	F3272-1G
Gauze Sponges	Covidien	2146
Heated Surgical Bed	EZ-Anesthesia	EZ-212
Heparin	Sagnet	NDC 25021-402-10
HEPES	Sigma Chemical Co	H3375
Isoflurane	Abbott Animal Health	IsoFlo, 5260-04-05
Isoflurane Vaporizer	EZ-Anesthesia	EZ-190F
Micro Dissecting Forceps	Biomedical Research Instruments Inc.	70-1020
Microplate Reader - Fluoroskan	ThermoScientific	Ascent FL, 5210460
NOVA 5+ Sodium/Potassium Analyzer	NOVA BioMedical	14156
Olsen-Hegar Needle Holders with Scissors	Fine Science Tools	12002-12
PE-190 (for bladder catheter)	BD Medical	427435
Pressure Transducer	ADInstruments	MLT1199
Pyrex Culture Tubes	Corning Inc.	99445-12
Rat Femoral Tapered Artery Catheter	Strategic Applications Inc.	RFA-01
Salix Furosemide 5%	Intervet	#34-478
Strabismus Scissors	Fine Science Tools	14075-11
Student Surgical Scissors	Fine Science Tools	91402-12
Surgical Gloves	Kimberly-Clark	Sterling Nitrile Gloves
Syringe pump	Razel Scientific	R99-E
Tissue Forceps	Fine Science Tools	91121-12
Tissue Scissors	George Tiemann  Co	105-420
5-0 Braided Silk Surgical Suture Surgical Specialties Corp SP1033 Assay Plate, 96-Well Costar  3922 Bovine Serum Albumin Sigma Chemical Co A2934-25G Centrifuge Beckman Coulter MicroFuge 18, 357160 Conical Sample Tubes Dot Scientific Inc.  #711-FTG Cotton Tipped Applicators Solon Manufacturing Co 56200 Data Acquisition Software ADInstruments LabChart Pro 7.0 Digital Scale  Denver Instrument APX-4001 FITC-Inulin Sigma Chemical Co F3272-1G Gauze Sponges Covidien 2146 Heated Surgical Bed EZ-Anesthesia EZ-212 Heparin Sagnet NDC 25021-402-10 HEPES Sigma Chemical Co H3375 Isoflurane Abbott Animal Health IsoFlo, 5260-04-05 Isoflurane Vaporizer EZ-Anesthesia EZ-190F Micro Dissecting Forceps Biomedical Research Instruments Inc. 70-1020 Microplate Reader - Fluoroskan ThermoScientific Ascent FL, 5210460 NOVA 5+ Sodium/Potassium Analyzer NOVA BioMedical 14156 Olsen-Hegar Needle Holders with Scissors Fine Science Tools 12002-12 PE-190 (for bladder catheter) BD Medical 427435 Pressure Transducer  ADInstruments MLT1199 Pyrex Culture Tubes Corning Inc. 99445-12 Rat Femoral Tapered Artery Catheter Strategic Applications Inc. RFA-01 Salix Furosemide 5% Intervet #34-478 Strabismus Scissors Fine Science Tools 14075-11 Student Surgical Scissors Fine Science Tools 91402-12 Surgical Gloves Kimberly-Clark Sterling Nitrile Gloves Syringe pump Razel Scientific R99-E Tissue Forceps Fine Science Tools 91121-12 Tissue Scissors George Tiemann  Co 105-420