3D organotípicos Co-cultura de apoyo medular tímica epitelial proliferación celular, la diferenciación y la Expresión Génica Promiscuo Modelo

Resumen

Studying medullary thymic epithelial cells in vitro has been largely unsuccessful, as current 2D culture systems do not mimic the in vivo scenario. The 3D culture system described herein - a modified skin organotypic culture model - has proven superior in recapitulating mTEC proliferation, differentiation and maintenance of promiscuous gene expression.

Resumen

El desarrollo de células T Intra-tímico requiere una malla tridimensional intrincada compuesta de diversas células del estroma, es decir, las células no-T. Timocitos atraviesan este andamio en un orden temporal y espacial altamente coordinada mientras secuencialmente pasando los puntos de control obligatorios, es decir, T compromiso de linaje celular, seguido por la generación repertorio T y la selección antes de su exportación en la periferia. Los dos tipos principales de células residentes que forman este andamio son células epiteliales del timo corticales (CTEC) y medulares (mTECs). Una característica clave de mTECs es la denominada expresión promiscua de numerosos antígenos restringida de tejido. Estos antígenos restringido de tejidos se presentan a los timocitos inmaduros directa o indirectamente por mTECs o células dendríticas tímicas, respectivamente resultante en la auto-tolerancia.

Modelos adecuados in vitro emulando las vías de desarrollo y las funciones de CTEC y mTECs Actualmente lacrey. Esta falta de modelos experimentales adecuados, por ejemplo, ha obstaculizado el análisis de la expresión génica promiscua, que todavía está poco conocida a nivel celular y molecular. Se adaptó un modelo de co-cultivo organotípico 3D a la cultura ex vivo mTECs aisladas. Este modelo fue originalmente ideado para cultivar queratinocitos de tal manera como para generar un equivalente de piel in vitro. El modelo 3D conserva características funcionales clave de MTEC biología: (i) la proliferación y la diferenciación terminal de CD80 ^{he aquí-Aire} negativa en CD80 ^hi, mTECs-Aire positivo, (ii) la capacidad de respuesta de RANKL, y (iii) la expresión sostenida de Foxn1, Aire y genes restringido de tejidos en CD80 ^hi mTECs.

Introducción

Timocitos en desarrollo constituyen aproximadamente el 98% del timo, mientras que el 2% restante consiste en una variedad de células que colectivamente componen el estroma tímico (es decir, células epiteliales, células dendríticas, macrófagos, células B, fibroblastos, células endoteliales). Las células epiteliales corticales exteriores (CTEC) procuran la inmigración de las células pro-T de la médula ósea, linaje de células T de inducción en multipotentes células pre-T y la selección positiva de la auto-MHC restringida timocitos inmaduros. Las células internas medulares del timo epiteliales (mTECs) están involucrados en la tolerancia a la inducción de los timocitos con un TCR de alta afinidad para los complejos de auto-péptido / MHC por cualquiera de inducir la selección negativa o su desviación en el linaje de células T reguladora. En el contexto de la inducción de la tolerancia central, mTECs son los únicos que expresan un amplio espectro de antígenos propios restringido de tejidos (TRAS) reflejando así el auto periférica. Este fenómeno se llama promiscua expresión génica (PGE)^1,2.

La mayoría de los estudios actuales sobre este fascinante tipo de célula se basan en células aisladas ex vivo, como diversos sistemas de cultivo 2D a corto plazo como resultado invariablemente en la pérdida de PGE y moléculas clave como regulador de MHC de clase II, Foxn1 y Aire dentro de los primeros 2 días ^3-6 . Se mantuvo sin embargo no está claro, que los componentes y características de la malla 3D intacta del timo particulares faltaban en modelos 2D. El cultivo de órganos tímico re-agregación (RTOC) ha sido hasta ahora el único sistema 3D que permite el estudio de desarrollo de las células T, por un lado, y la biología de células del estroma, por otro lado, en un microambiente tímico intacta ^7. Sin embargo, RTOCs tienen ciertas limitaciones, es decir, que ya contienen una mezcla compleja de células, requieren la entrada de las células del estroma fetales y soportar un período de cultivo máxima de 5 a 10 días.

La falta de reduccionista en los sistemas de cultivo in vitro ha dificultado el estudio devarios aspectos del desarrollo de las células T y la organogénesis del timo no menos importante la regulación molecular de PGE y su relación con la biología del desarrollo de mTECs.

Debido a la estrecha relación-de la organización estructurada de las células epiteliales de la piel y el timo, se optó por un sistema 3D cultura organotípico (OTC) que había sido desarrollado originalmente para emular a la diferenciación de los queratinocitos in vitro y por lo tanto crear un equivalente dérmico. El sistema OTC consiste en una matriz inerte andamio superpuesta con fibroblastos dérmicos que se encuentran atrapados en un gel de fibrina, en la que los queratinocitos se siembran ^8,9. Aquí, hemos sustituido los queratinocitos con mTECs purificados. Manteniendo las características básicas de este modelo, hemos optimizado ciertos parámetros.

En el modelo de venta libre aprobado mTECs proliferaron, se sometió a la diferenciación terminal y mantenido la identidad MTEC y PGE, imitando así de cerca en el desarrollo mTECs vivo ^{10. Esta nota técnica proporciona un protocolo detallado que permite el paso a paso la configuración de OTC timo.}

Protocolo

Este estudio ha sido aprobado por el comité de ética de la Regierungspräsidium Karlsruhe. Todos los animales fueron alojados en condiciones específicas libres de patógenos en el Centro Alemán de Investigación Oncológica (DKFZ). Para todos los cachorros experimentos de cultivo de ratón que van de 1 a 7 días de edad fueron utilizados.

1. Aislamiento de mTECs de timo

NOTA: Se realizaron las siguientes etapas de digestión como se describió anteriormente ¹ bajo condiciones estériles con algunas modificaciones de la siguiente manera.

1. Decapitar a las crías de ratón y retire el timo. Coloque el timos en hielo en una placa de Petri que contiene medio RPMI 1640 (que contiene 5% de FCS).
2. Cortar el timos en finos, trozos pequeños y colocar en un tubo de fondo redondo con ~ 5-30 ml de medio RPMI y revuelva suavemente usando un imán durante 10 minutos a temperatura ambiente.
3. A partir de entonces, se decanta el sobrenadante que contiene principalmente timocitos y digerir secuencialmente el tejido restante con una ronda de collagenatipo se IV (0,2 mg / ml y 57 U / ml concentartion final) durante 15 min cada uno a 37 ° C, seguido por la colagenasa / dispasa (0,2 mg / ml y una concentración final de 1,2 U / ml) durante 25 min cada uno a 37 ° C en un baño de agua con agitación magnética hasta que el timos se digirió completamente. Usar 1 ml de enzima por dos y cincuenta y ocho timos.
4. Agitar el tejido una vez cada 7-10 minutos con una pipeta Pasteur. Reúnase el fracciones colagenasa / dispasa y filtrar a través de una gasa de 70 micras.
5. Enriquecer los mTECs por celular magnética clasificación (MACS). Realizar la purificación de mTECs por clasificación celular magnética ¹¹ como se describió previamente, y se muestra en la Figura 1.
   NOTA: Para la clasificación magnética de mTECs hemos utilizado los siguientes anticuerpos anti-CD80-PE (16-10A1, uso en dilución 1: 100) y anti-EpCAM-bio (G8.8, el uso en dilución 1: 100) ^12. MTECs inmaduros y maduros utilizando MACS se definieron como: CD45 ^- EpCAM ⁺ CD80 ^- y CD45 ^- CD80 ⁺ respectively.
6. Después de la purificación MACS (pureza de mTECs inmaduros = 83,1 ± 6,3% y mTECs maduros = 79,23 ± 3,42%), sembrar las mTECs en los cultivos organotípicos como se describe a continuación (Sección 2.3).
7. Alternativamente, ordenar mTECs por FACS (utilizando 100 boquilla micras) tras el agotamiento CD45 MACS utilizando los siguientes anticuerpos anti-CD45-PerCP (30-F11, el uso en dilución 1: 100), anti-Ly51-FITC (6C3, utilice al 1 : 100 dilución), anti-EpCAM-Alexa647 (G8.8, el uso a escala 1: 500 dilución) y el uso de anti-CD80-PE (16-10A1, en dilución 1: 100). Excluir las células muertas utilizando yoduro de propidio (1: 5000) (Día 4). MTECs inmaduros y maduros utilizando FACS se definieron como: PI ^- CD45 ^- Ly51 ^- EpCAM ⁺ CD80 ^- y PI ^- CD45 ^- Ly51 ^- EpCAM ⁺ CD80 ^+, respectivamente.

2. 3D organotípicos Co-culturas (OTC)

NOTA: Las construcciones 3D dérmica para el cultivo de organotípico keratinocytES se prepararon como se ha descrito previamente ^9,13. En todos los pasos células se incubaron a 37 ° C y 5% de CO _2. Las OTC utilizando mTECs se prepararon con ligeras modificaciones como sigue.

1. Preparación de fibroblastos humanos
   NOTA: Los fibroblastos dérmicos humanos se obtuvieron a partir de cultivos de explantes de dermis de-epidermised como se describió previamente ^9.
   1. En resumen, cortar tiras de piel humana (~ 5 cm de longitud) y tratar con termolisina (0,5 mg / ml en solución salina con 10 mM Hepes pH 7,4) O / N a 4 ° C.
   2. A partir de entonces, separar la epidermis de la dermis utilizando fórceps.
   3. Finamente cortar la dermis en trozos pequeños, lugar en una placa de Petri de 10 cm y dejar secar durante 1-2 horas bajo un flujo de aire estéril. Complementar los explantes regularmente con DMEM que contiene 20% de SFB.
   4. Dividir los fibroblastos crecimiento fuera cuando confluente (normalmente alrededor de 3 semanas) utilizando 0,1% de tripsina asegurándose de que los explantes siguen adhiriendo a la placa para una mayor estafarondas consecutivas de derivación.
   5. Expandir los fibroblastos de los mismos explantes durante un máximo de 3 veces en DMEM con 10% de SFB y crio-preservarlos ^14. Utilice el mismo lote de fibroblastos para cada serie experimental.
      NOTA: Los fibroblastos no se irradiaron durante la puesta a punto de los equivalentes dérmicos.
2. Preparación del Andamios
   1. Cortar los 0,4 hasta 0,6 mm de espesor de viscosa, material fibroso no tejido (los detalles del producto en el apoyo a la hoja de Excel) en círculos bien delimitadas utilizando un fuerte pegador de 11 mm de diámetro de metal para encajar exactamente en 12 inserciones bien de filtro. Luego colóquelo en el elemento filtrante de 12 pocillos (poliéster membrana de poro capilar, 3 micras de tamaño de poro) como un andamio. Coloque la configuración completa del filtro en una placa de 12 pocillos estéril.
   2. Preparar el gel de fibrina usando un pegamento de fibrina-kit para la cirugía que consiste en una combinación de fibrinógeno y trombina. Pre-diluir el fibrinógeno así como la trombina-componente del kit a 8 mg / ml y 10unidades / ml, respectivamente. Para un solo pocillo de una placa de 12 pocillos proceder como sigue.
      1. Diluir 100 l de fibrinógeno (8 mg / ml) con 100 l de solución salina tamponada con fosfato (PBS) sin Ca ⁺ ₂ y Mg ⁺ _2, pH 7,0. Diluir 100 l de trombina (10 unidades / ml) con 100 l FCS que contienen 270.000 fibroblastos.
      2. Dispensar 200 l de la trombina que contiene fibroblastos de células-MIX en el andamio, a los que añaden 200 l de fibrinógeno (mezcla 1: 1), resultando en una concentración final de fibrinógeno de 2 mg / ml y de la trombina de 2,5 unidades / ml. Mezclar bien y distribuir de manera uniforme sobre toda el área del andamio por pipeteo suave (Día 1).
         NOTA: Después de 30 min a 37 ° C se habrá formado un coágulo que encierra los fibroblastos, llenando completamente los espacios internos del andamio y que forma una superficie superior lisa.
3. Co-cultivo con mTECs
   1. Para pre-cultura, sumerja los cultivos de órganos enDMEM con 10% FBS, 50 mg / ml de ácido L-ascórbico y 1 ng / ml TGF-β1 con un cambio de medio cada dos días durante 4-5 días.
   2. En el día de la siembra MTEC, reemplazar el medio por medio rFAD (1: 1 DMEM + DMEM / F12) con 10% de FBS, 10 ^-10 M toxina del cólera, 0,4 mg / ml de hidrocortisona, / ml de ácido L-ascórbico 50 mg, ligando RANK (0,1 g / ml) y 500 unidades / ml de aprotinina, evitando así la fibrinólisis precoz por serina proteasas secretadas por los fibroblastos.
   3. 7-8 horas más tarde, la configuración de los co-cultivos sembrando 250.000 mTECs (ya sea mTECs completos, o CD80 y CD80 ^{hi lo} subconjuntos), en un volumen de 100 l por pocillo en la parte superior del andamio de fibroblastos. Contar las células por medio de una cámara de Neubauer (día 4).
      NOTA: En todo momento el timo cultivos organotípicos 3D se sumergieron en medios diferencia de OTC de la piel que son aire levantado.
   4. Después de 24 horas de incubación, el suministro de los cultivos con medio (cambio medio total) como se mencionó anteriormente (paso 2.3.2) ahora containing redujo cantidades de aprotinina, 250 unidades / ml (día 5).
   5. A fin de evaluar la actividad proliferativa de mTECs, añadir EdU (6,7 micras / ml, es decir, 10 M / pocillo) a OTCs durante 4 horas antes de la terminación de los cultivos. Realice la tinción de OTC crio-secciones como se describe en el Kit de EdU Imaging combinado con co-tinción de la queratina 14. Determinar los índices proliferativos de mTECs, por cualquiera de las células del K14 ⁺ EdU ⁺ contando en dos secciones de cada muestra de cultivo o por flujo citometría de (EDU citometría de flujo, la Sección 1.7, pero en lugar de Ly51-FITC utilizan CDR1-PB ¹⁵ en una dilución 1: 100 y 2.3.6.4).
   6. Después de 4-7 días de co-cultivo, terminar las OTC y el proceso para el aislamiento de ARN, crio-seccionamiento o análisis FACS (día 8-11).
      1. Terminar los cultivos usando un fórceps, separando el andamio / equivalente dérmico desde el filtro del inserto así.
      2. Para crio-seccionamiento, incrustar toda la OTC en compuesto OCT y congelar en livapor de nitrógeno quid antes de crio-seccionamiento. Preparar 5-7 micras de espesor secciones OTC utilizando un criostato y se almacena a -20 ° C hasta su uso. Por inmunohistoquímica de OTC crio-seccionó usar anti-queratina 14 (AF64, el uso a escala 1: 1000 dilución), y anti-vimentina (GP53, el uso a escala 1: 100 dilución) anticuerpos. Realice la tinción inmunohistoquímica indirecta utilizando respectivos anticuerpos secundarios.
      3. Para el aislamiento de ARN, añadir 1 ml de solución de desnaturalización (que contiene fenol y tiocianato de guanidina) en un tapón de rosca de un tubo libre de 2 ml RNasa. Cortar toda la OTC en trozos con un bisturí y añadir en el tubo que contiene la solución desnaturalizante. Mecánicamente triturar las OTC con instrumento FastPrep dos veces durante 30 segundos a una velocidad de 6,0, colocar en el medio en hielo durante 2 min (la muestra se puede almacenar a -80 ° C después de este punto). Si se congela a -80 ° C, descongelar en hielo. Centrifugar los tubos a 11,500-13,000 rpm durante 10 min a 4 ° C. Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo, incubar durante 5 min a RT y fprotocolos de aislamiento de ARN ollow usando ácido guanidinio tiocianato-extracción con fenol-cloroformo como se describe por el fabricante.
      4. Para el análisis FACS, quitar el andamio y separar la membrana de la fibrina / fibroblastos / gel MTEC. Finamente cortar el gel con un escalpelo y digerir en un tubo de FACS para ~ 20 min o hasta que esté completamente digerido con 2 ml de colagenasa / dispasa a 37 ° C en un baño de agua con agitación magnética. Agitar la solución de enzima con una pipeta Pasteur una vez cada 5 min. Después de la digestión completa, se filtra la suspensión celular a través de un filtro de 70 micras; manchar la suspensión de células individuales usando los anticuerpos como se describe en 1.7 y analizar por citometría de flujo.

Resultados

Hemos adoptado un modelo de co-cultivo organotípico 3D (3D OTC) que había sido desarrollado originalmente para la cultura a largo plazo in vitro de queratinocitos ^9. MTECs MACS enriquecidos (ver MACS enriquecimiento esquema de la figura 1) fueron sembradas en un andamio que comprende de un gel de fibrina y fibroblastos atrapadas. Los fibroblastos proporcionan la matriz extracelular esencial (ECM) que soporta mTECs in vitro. MTECs se cultivaron en OTC de 4-14 días en prese...

Discusión

Junto RTOCs, la OTC 3D haber sido muy superior en términos de diferenciación TEC y PGE mantenimiento / inducción (Tabla 1) en comparación con otros (i) «culturas 3D simplificados 'usando - fibroblastos solo sin el andamio; (Ii) sistemas 2D utilizando - células fibroblastos / alimentador co-cultivadas con TEC ^10, (iii) las células 3T3-J2 en el que se desarrollan clones TEC, pero PGE se pierde, (iv) matrigel o (v) los componentes de ECM (datos no publicados). PGE se mantuvo durante u...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pregnant C57BL/6 mice	Charles River WIGA
LS columns	Miltenyi Biotec	130-042-401
MS columns	Miltenyi Biotec	130-042-201
CD45 Microbeads, mouse	Miltenyi Biotec	130-052-301
Anti-PE Microbeads	Miltenyi Biotec	130-048-801
Streptavidin Microbeads	Miltenyi Biotec	130-048-101
EpCAM (G8.8 -Alexa 647 and -biotin)	Ref. 12
CD80-PE antibody	BD Pharmingen	553769
CD45-PerCP antibody	BD Pharmingen	557235
Ly51-FITC antibody	BD Pharmingen	553160
CDR1-Pacific Blue	Ref. 15
Keratin 14 antibody	Covance	PRB-155P
Vimentin antibody	Progen	GP58
Cy3-conjugated AffiniPure Goat anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	111-165-003
Alexa 488-conjugated AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat anti-Guinea Pig IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	106-546-003
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate	Molecular Probes (Invitrogen GmbH)	A-11008
Click-iT EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit	Invitrogen	C10339
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Flow Cytometry Assay Kit	Invitrogen	C10425
12-well filter inserts (thincerts)	Greiner bio-one	657631
12-well plate	Greiner	665180-01
Jettex 2005/45	ORSA, Giorla Minore, Italy
Fibrinogen TISSUECOL-Kit Immuno	Baxter
Thrombin TISSUECOL-Kit Immuno	Baxter
PBS	Serva	47302.03
DMEM	Lonza	BE12-604F
DMEM/F12	Lonza	BE12-719F
HEPES	Gibco	15630-049
FBS Gold	GE Healthcare	A11-151
Aprotinin (Trasylol)	Bayer	4032037
Cholera toxin	Biomol	G117
Hydrocortisone	Seromed (Biochrom)	K3520
L-ascorbic acid	Sigma	A4034
TGF-ß1	Invitrogen	PHG9214
RANKL	R&D systems	462-TR-010
Thermolysin	Sigma Aldrich	T-7902
OCT Compound	TissueTek	4583
Trizol (aka. Denaturing solution - Acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction)	Invitrogen	10296028
FastPrep FP120	Thermo Scientific
Collagenase Type IV	CellSystems	LS004189	0.2 mg/ml and 57U/ml final conc.
Neutrale Protease (Dispase)	CellSystems	LS002104	0.2 mg/ml and 1.2U/ml final conc.
DNase I	Roche	11 284 932 001	25 µg/ml final conc.