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  • Resumen
  • Introducción
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Este protocolo detalla un método para aislar vesículas extracelulares (SVE), pequeñas partículas membranosas liberadas de las células, a partir de tan poco como 10 muestras de suero l. Este enfoque evita la necesidad de ultracentrifugación, requiere sólo unos pocos minutos de tiempo de ensayo, y permite el aislamiento de los vehículos eléctricos a partir de muestras de volúmenes limitados.

Resumen

Vesículas extracelulares (EVs), partículas membranosas liberados de varios tipos de células, tienen un gran potencial para aplicaciones clínicas. Contienen ácido nucleico y proteínas de carga y se reconoce cada vez más como un medio de comunicación intercelular utilizado tanto por eucariota y células procariotas. Sin embargo, debido a su pequeño tamaño, los protocolos actuales para el aislamiento de los vehículos eléctricos son a menudo consume mucho tiempo, engorroso, y requieren grandes volúmenes de muestras y equipos caros, tales como una ultracentrífuga. Para hacer frente a estas limitaciones, hemos desarrollado una plataforma de inmunoafinidad en papel para separar subgrupos de vehículos eléctricos que es fácil, eficiente y requiere volúmenes de muestra tan bajas como 10 l. Las muestras biológicas pueden ser pipetearon directamente sobre zonas de ensayo de papel que han sido modificados químicamente con moléculas de captura que tienen alta afinidad a los marcadores específicos de la superficie EV. Immunosorben ligado a enzimas Validamos el ensayo mediante el uso de microscopía electrónica de barrido (SEM), en papelensayos t (P-ELISA), y el análisis del transcriptoma. Estos dispositivos basados ​​en papel permitirán el estudio de los vehículos eléctricos en la clínica y el marco de la investigación para ayudar a avanzar nuestra comprensión de las funciones de EV en la salud y la enfermedad.

Introducción

Extracellular vesicles (EVs) are heterogeneous membranous particles that range in size from 40 nm to 5,000 nm and are released actively by many cell types via different biogenesis routes1-9. They contain unique and selected subsets of DNA, RNA, proteins, and surface markers from parental cells. Their involvement in a variety of cellular processes, such as intercellular communication10, immunity modulation11, angiogenesis12, metastasis12, chemoresistance13, and the development of eye diseases9, is increasingly recognized and has spurred a great interest in their utility in diagnostic, prognostic, therapeutic, and basic biology applications.

EVs can be classically categorized as exosomes, microvesicles, apoptotic bodies, oncosomes, ectosomes, microparticles, telerosomes, prostatosomes, cardiosomes, and vexosomes, etc., based on their biogenesis or cellular origin. For example, exosomes are formed in multivesicular bodies, whereas microvesicles are generated by budding directly from plasma membrane and apoptotic vesicles are from apoptotic or necrotic cells. However, the nomenclature is still under refined, partly due to a lack of thorough understanding and characterization of EVs. Several methods have been developed to purify EVs, including ultracentrifugation14, ultrafiltration15, magnetic beads16, polymeric precipitation17-19, and microfluidic techniques20-22. The most common procedure to purify EVs involves a series of centrifugations and/or filtration to remove large debris and other cellular contaminants, followed by a final high-speed ultracentrifugation, a process that is expensive, tedious, and nonspecific14,23,24. Unfortunately, technological need for rapid and reliable isolation of EVs with satisfactory purity and efficiency is not yet met.

We have developed a paper-based immunoaffinity device that provides a simple, time- and cost-saving, yet efficient way to isolate and characterize subgroups of EVs22. Cellulose paper cut into a defined shape can be arranged and laminated using two plastic sheets with registered through-holes. In contrast to the general strategy to define the fluid boundary in paper-based devices by printing hydrophobic wax or polymers25-27, these laminated paper patterns are resistant to many organic liquids, including ethanol. Paper test zones are chemically modified to provide stable and dense coverage of capture molecules (e.g., target-specific antibodies) that have high affinity to specific surface markers on EV subgroups. Biological samples can be pipetted directly onto the paper test zones, and purified EVs are retained after rinse steps. Characterization of isolated EVs can be performed by SEM, ELISA, and transcriptomic analysis.

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Protocolo

Un esquema general del procedimiento de operación se presenta en la Figura 1. El uso de prácticas éticas, se recogieron muestras de sangre de sujetos sanos, y se obtuvieron muestras de humor acuoso de los pacientes a través del Hospital General de Veteranos Taichung (TCVGH), Taichung, Taiwán bajo IRB aprobó protocolos ( IRB TCVGH No. CF11213-1).

1. La fabricación de dispositivos de papel

  1. Cortar papel de cromatografía en círculos de 5 mm de diámetro para proporcionar el mismo diseño que una placa de microtitulación de 96 pocillos. Sandwich estas piezas de papel con dos láminas de poliestireno con domicilio orificios pasantes y laminado.
  2. Modificar los dispositivos de papel utilizando el método de conjugación química se describe en los pasos 28 de la siguiente.
    1. Tratar dispositivos de papel con plasma de oxígeno (100 mW, 1% de oxígeno, 30 sec) en una cámara de plasma.
      PRECAUCIÓN: Se debe tener especial cuidado cuando se trabaja con trimetoxisilano 3-mercaptopropil y N--γ maleimidobutiriloxi succinimidaéster (GMBS), ya que ambos son sensibles a la humedad y tóxico. Use guantes de protección y evitar la inhalación o el contacto con la piel y los ojos. Mantenga la botella stock bien cerrado y deje que se equilibre a temperatura ambiente antes de abrir para evitar la condensación de agua. Alternativamente, abra la botella stock dentro de una bolsa de guantes llena de nitrógeno o caja. Alícuota en pequeños frascos para evitar la apertura frecuente de la botella stock.
    2. Inmediatamente incubado tratada dispositivos de papel en un (v / v) solución al 4% de 3-mercaptopropil trimetoxisilano en etanol (200 prueba) durante 30 min.
    3. Enjuague dispositivos de papel con etanol y se incuba con GMBS / ml 0.01 mu mol en etanol durante 15 min.
    4. Enjuague con etanol (200 prueba) e incubar dispositivos de papel con 10 mg / ml solución de avidina en tampón fosfato salino (PBS) durante 1 hora a 4 ° C. Almacenar a 4 ° C si es necesario, y utilizar un plazo de 4 semanas.
  3. Mojar cada zonas de ensayo de papel con 10 l de PBS que contiene 1% (w / v) de albúmina de suero bovino (BSA) Durante 3 x 10 min antes de la detección de 10 l biotinilados moléculas de captura para 3 × 10 min. Utilizar Anti-CD63 anticuerpo (20 g / ml en PBS que contenía 1% (w / v) de BSA y 0,09% (w / v) de azida de sodio) o anexina V (01:20, v / v en tampón de unión de anexina V) como moléculas de captura.
  4. Enjuague anticuerpo o anexina V moléculas anti-CD63 no unidas utilizando 10 l correspondiente PBS que contenía 1% (w / v) BSA o anexina V vinculante soluciones tampón durante 3 x 1 min, respectivamente.

2. El suero y el humor acuoso Recolección y Procesamiento

  1. Recogida de suero.
    1. Recoger 10 ml de sangre periférica por punción venosa en tubos de separación de suero y de invertir suavemente el tubo de cinco veces. Ajuste el tubo en posición vertical y esperar 30 min.
    2. Centrifugar a 1200 × g durante 15 min. Transferir el suero de la capa superior a un tubo limpio, y se centrifuga de nuevo a 3000 × g durante 30 min.
    3. Pasar el sobrenadante a través de un fil 0,8 micraster. Mantenga la muestra a -80 ° C hasta su uso.
  2. Acuosa colección humor: recoger muestras del humor acuoso de pacientes diagnosticados por un oftalmólogo directamente a través de procedimientos y almacenar muestras invasiva a -80 ° C hasta su uso.

3. Aislamiento de vesículas extracelular

  1. Las muestras puntuales en cada zona de prueba de papel a una velocidad de 5 l / min.
  2. Enjuague EVs no unidos con 10 l correspondientes PBS que contiene 1% (w / v) BSA o anexina V vinculante soluciones tampón durante 3 x 1 min para los dispositivos de papel funcionalizados con anti-CD63 de anticuerpos o moléculas de anexina V, respectivamente. Lleve a cabo los siguientes ensayos posteriores.

4. Downstream Ensayo Ejemplo 1: Electromicrographs de exploración

  1. Fijar EVs capturados en funcionalizado zona de prueba de papel utilizando 10 l 0,5 × fijador de Karnovsky durante 10 min.
  2. Enjuague las muestras con amplia PBS durante 2 × 5 min.
  3. Deshidratar elmuestras con etanol posterior 35% durante 10 min, etanol al 50% durante 2 x 10 min, etanol al 70% durante 2 x 10 min, etanol al 95% durante 2 x 10 min, y etanol 100% para 4 × 10 min.
  4. Crítico seco y pulverización catódica recubrir las muestras con paladio / oro, y examinar utilizando un microscopio electrónico de barrido operado a baja tensión de aceleración de electrones (~ 5 kV).

5. Aguas abajo el Ejemplo de Ensayo 2: ELISA basado en Papel

  1. Añadir una solución de 5 l que contiene anti-CD9 anticuerpo primario a 1: 1.000 dilución en PBS a cada zona de ensayo que contiene EVs capturados. Espere 1 min.
  2. Enjuagar las muestras con 30 ml de PBS agitó a 100 rpm durante 30 seg.
  3. Añadir a 5 l solución que contiene peroxidasa de rábano (HRP) -vinculada anticuerpo secundario a 1: 1000 dilución en PBS y esperar 1 min.
  4. Enjuagar las muestras con 30 ml de PBS agitó a 100 rpm durante 30 seg.
  5. Añadir un sustrato colorimétrico 5 l que contiene 1: 1 relación de volumen de peróxido de hidrógeno unad 3,3 ', 5,5'-tetrametilbenzidina (TMB) y escanear con un escáner de escritorio.

6. Ejemplo Ensayo de Downstream 3: Aislamiento de ARN

  1. Sumergir las muestras en 35 l de ayuda ARN aislamiento a base de polivinilpirrolidona y 265 l de lisis / tampón de unión para la lisis de los vehículos eléctricos capturados. Vortex vigorosamente.
  2. Añadir 30 l de homogeneizado proporcionado en el kit de aislamiento al lisado. Vortex vigorosamente y se puso en hielo durante 10 min.
  3. Extraer el ARN usando ácido separación de fenol-cloroformo descrito en los pasos siguientes.
    1. Tomar 330 l de fenol-cloroformo de la capa de fondo de la botella y añadir a la homogenado / lisado. Vortex vigorosamente.
    2. Centrifugar a 10.000 xg durante 5 min. Pasar la fase acuosa (superior) a un tubo limpio y tenga en cuenta el volumen extraído.
  4. Precipitar el ARN total con etanol al 100% del volumen que es 1,25 veces el volumen de la fase acuosa eliminado en el paso anterior y collect el ARN en la solución de elución precalentado a 95 ° C.
  5. Concentrar y purificar aún más el ARN usando un kit de ARN de limpieza de acuerdo con el protocolo del fabricante.

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Resultados

La capacidad del dispositivo de papel para aislar subgrupos de los vehículos eléctricos se basa de manera eficiente a partir de su reconocimiento sensible y específica de los marcadores de superficie EV. La modificación estable de fibras de papel con moléculas de captura se logra mediante el uso de la química de avidina-biotina como se describe en otra parte 28-30. La eficacia de la conjugación química y la del método de fisisorción se evalúa utilizando lecturas basadas en fluorescencia. Las zonas ...

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Discusión

Los pasos más críticos para el éxito en el aislamiento de los subgrupos de vesículas extracelulares son: 1) una buena opción de papel; 2) la cobertura estable y alto de moléculas de captura en la superficie de las fibras de papel; 3) el manejo adecuado de las muestras; y 4) las prácticas de higiene general de laboratorio.

Los materiales porosos se han utilizado en muchos ensayos baratas y equipo libre. Pueden tener el tamaño de poro sintonizable, funcionalidad versátil, de bajo cost...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Agradecimientos

Esta obra fue financiada en parte por el Consejo de Seguridad Nacional 99-2320-B-007-005-MY2 el Consejo Nacional de Ciencia de Taiwán grants- (CC) y NSC 101-2628-E-007-011-MY3 (CMC), y el General de Veteranos Hospitales y Sistema Universitario del Programa Común de Investigación de Taiwán (CC).

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Chromatography PaperGE Healthcare Life Sciences3001-861Whatman® Grade 1 cellulose paper
(3-Mercaptopropyl) trimethoxysilaneSigma Aldrich175617This chemical reacts with water and moisture and should be applied inside a nitrogen-filled glove bag. Avoid eye and skin contact. Do not breathe fumes or inhale vapors.
EthanolFisher ScientificBP2818Absolute, 200 Proof, molecular biology grade
Bovine serum albumin (BSA)BioShop Canada Inc.ALB001Often referred to as Cohn fraction V.
N-γ-maleimidobutyryloxy succinimide ester (GMBS)Pierce Biotechnology22309GMBS is an amine-to-sulfhydryl crosslinker. GMBS is moisture-sensitive.
AvidinPierce Biotechnology31000NeutrAvidin has 4 binding sites for biotin and its pI value is 6.3, which is more neutral than native avidin
Biotinylated mouse anti-human anti-CD63Ancell215-030clone AHN16.1/46-4-5
biotinylated annexin VBD Biosciences556418Annxin V has a high affinity for phosphatidylserine (PS)
Primary anti-CD9 and secondary antibodySystem BiosciencesEXOAB-CD9A-1The secondary antibody is horseradish peroxidise-conjugated
Serum separation tubesBD Biosciences367991Clot activator and gel for serum separation
Annexin V binding bufferBD Biosciences55645410x; dilute to 1x prior to use.
TMB substrate reagent setBD Biosciences555214The set contains hydrogen peroxide and 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine (TMB)
[header]
RNA isolation kitLife TechnologiesAM1560MirVana RNA isolation kit
Polyvinylpyrrolidone-based RNA isolation aidLife TechnologiesAM9690Plant RNA isolation aid contains polyvinylpyrrolidone (PVP) that binds to polysaccharides.
RNA cleanup kitQiagen Inc.74004MinElute RNA cleanup kit is designed for purification of up to 45 μg RNA.
Plasma chamberMarch InstrumentsPX-250
Scanning electron microscopeHitachi Ltd.S-4300
Desktop scannerHewlett-Packard CompanyPhotosmart B1108-bit color images were captured. Cameras and smart phones may be also used.
Image-record systemJ&H Technology CoGeneSys G:BOX Chemi-XX816-bit fluroscence images were captured. Fluroscence microscopes may be also used.

Referencias

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