Un método para infligir Cerrado Jefe lesión cerebral traumática en<em&gt; Drosophila</em

Resumen

Aquí se describe un método para infligir cabeza cerrada lesión cerebral traumática (TBI) en Drosophila. Este método proporciona una puerta de entrada para investigar los mecanismos celulares y moleculares que subyacen a patologías TBI utilizando la amplia gama de herramientas experimentales y técnicas disponibles para las moscas.

Resumen

La lesión cerebral traumática (TBI) afecta a millones de personas cada año, causando deterioro de la física, cognitiva, y las funciones de comportamiento y de la muerte. Los estudios que utilizan Drosophila han contribuido importantes avances en la comprensión de los procesos neurológicos. Por lo tanto, con el objetivo de entender las bases celulares y moleculares de patologías TBI en los seres humanos, hemos desarrollado el dispositivo de Alto Impacto de Trauma (HIT) para infligir cabeza cerrada TBI en las moscas. Las moscas sometidas a la pantalla fenotipos dispositivo HIT consistentes con TBI humana tales como la incapacidad temporal y la neurodegeneración progresiva. El dispositivo HIT utiliza un mecanismo basado en el resorte para impulsar moscas contra la pared de un vial, causando daño mecánico al cerebro de la mosca. El dispositivo es barato y fácil de construir, su funcionamiento es simple y rápida, y produce resultados reproducibles. En consecuencia, el dispositivo HIT se puede combinar con las herramientas y técnicas para moscas para abordar fundamental experimentales existentespreguntas acerca de TBI que pueden conducir al desarrollo de diagnósticos y tratamientos para TBI. En particular, el dispositivo HIT puede ser utilizado para realizar cribados genéticos a gran escala para entender la base genética de patologías de TBI.

Introducción

La lesión cerebral traumática (TBI) se define como una lesión al cerebro de una fuerza mecánica externa. Por lo general, los resultados de TBI de las fuerzas de cabeza cerradas tales como fuerzas contundentes y aceleración inercial y fuerzas de desaceleración que hacen que el cerebro de huelga el interior del cráneo. En los Estados Unidos, se estima que 50.000 personas mueren cada año a partir de la LCT y 2,5-6.500.000 personas están viviendo con las consecuencias de TBI, incluyendo debilitante físico, cognitivo y problemas de comportamiento ^1,2. Las consecuencias de TBI son no sólo debido a lesiones mecánicas primarias al cerebro, sino también a las lesiones celulares y moleculares secundarios en el cerebro, así como otros tejidos que se producen con el tiempo ^3-5. El desarrollo de métodos para el diagnóstico y tratamiento de TBI ha demostrado ser difícil porque TBI es un proceso de enfermedad compleja. La naturaleza variable de las lesiones primarias, la fisiología humana y factores ambientales como resultado i secundaria heterogéneanjuries y patologías. Factores variable subyacente incluyen la gravedad de la lesión primaria, el tiempo entre las lesiones primarias repetitivas, y la edad y el genotipo del individuo. La comprensión de cómo cada factor variable contribuye a las consecuencias de la lesión cerebral traumática es probable que ayudar en el desarrollo de métodos para el diagnóstico y tratamiento de TBI ^6,7.

Aquí se describe un método para infligir TBI cabeza cerrada en Drosophila melanogaster (mosca de la fruta) que se puede utilizar para delinear la contribución de factores variables a las consecuencias de TBI. El método se basa en una observación inicial que intensamente golpeando el lateral de un vial cultura mosca contra la palma de una mano hizo de tipo salvaje vuela para convertirse incapacitado temporalmente, una consecuencia probable de la LCT. Por lo tanto, hemos construido el dispositivo de Alto Impacto de Trauma (HIT) para recapitular las fuerzas de aceleración y deceleración de la acción de golpear la mano. Una película de alta velocidad muestra que un solo tiro desde laHIT dispositivo hace que vuela a ponerse en contacto con la pared del vial varias veces con la cabeza y el cuerpo ^8. Hasta cierto punto, todos los contactos son susceptibles de causar el cerebro de la mosca a rebotar y deformarse en contra de la cápsula de la cabeza, similar a lo que ocurre con los seres humanos en caídas y accidentes automovilísticos ^9. En consecuencia, las moscas tratadas con los fenotipos de visualización de dispositivos HIT consistentes con lesión cerebral, incluyendo la incapacidad temporal seguido de ataxia, la recuperación gradual de la movilidad, los cambios de expresión génica en la cabeza, y la neurodegeneración progresiva en el cerebro ^10. Así, el dispositivo HIT hace posible el estudio de TBI utilizando el enorme arsenal de herramientas y técnicas desarrolladas para moscas experimentales.

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Protocolo

1. Construcción del Dispositivo HIT

1. Conecte el muelle a la placa mediante dos abrazaderas y cuatro tornillos (Figura 1A). Centrar las abrazaderas relativas a la anchura de la junta directiva y Butt ellas una contra otra con el rubor de sujeción exterior con el borde de la placa. Antes de fijar las abrazaderas, doblarlas con unos alicates para encajar firmemente sobre la primavera.
   NOTA: Véase la Tabla 1 para las descripciones de los materiales necesarios para la construcción del dispositivo de HIT. El extremo sujeto del muelle debe ser de 1/8 de pulgada (3,2 mm) del borde de la placa, y el extremo libre debe extenderse sobre el tablero por 3/4 pulgadas (19 mm). Ajuste el resorte de manera que quede paralelo con la longitud de la placa.
2. Envolver el extremo libre del resorte de una vez alrededor de la banda adhesiva de bucles de Velcro. El borde exterior de la Velcro debe estar al ras con el extremo del resorte. El Velcro es importante porque se utiliza para asegurar el vial a la primavera por creCIONES un accesorio de compresión apretado. El Velcro también permite una fácil conexión y remoción de los viales, permitiendo muchos viales para ser procesados ​​en un corto período de tiempo.
3. Coloque la tapa cubo de hielo al revés, centrado, apretada contra la tabla de madera. Oriente la región elevada de la cubierta cubo de hielo de forma que el borde largo es paralela a la anchura de la junta. Tenga en cuenta que la región elevada del cubo de hielo es 1/2 pulgadas (13 mm) más alta que la tabla de madera, de modo que cuando un vial se adjunta a la primavera la primavera no se acueste en el tablero.
4. Deslice todo el dispositivo contra un objeto fijo, como una pared, por lo que la cubierta cubo de hielo se acuña entre la tarjeta y el objeto y no se mueve.
5. Tape el transportador de papel para el fondo de una bandeja de cartón vuela vial y ponte en ventaja frente a la longitud de la junta de modo que la marca de 90 ° está alineado con la primavera, cuando se tira de nuevo a una posición perfectamente vertical.

2.El funcionamiento del dispositivo HIT

1. Lugar entre el 1 y el 60 CO ₂ -anesthetized vuela en un frasco vacío y el tapón del frasco con un algodón muy ajustada.
2. Confinar las moscas a la parte inferior de 1 pulgada (2,5 cm) del vial, empujando la bola de algodón en el vial hasta que es 1 pulgada (2,5 cm) desde la parte inferior. Es útil para dibujar una línea en el vial en la marca de 1 pulgada (2,5 cm). Tenga en cuenta que confinar moscas a las regiones más grandes o más pequeñas del vial puede afectar a la gravedad de fenotipos.
3. Espere 5 minutos para las moscas para recuperar la movilidad del CO _2. Nótese que no se sabe si 5 min es suficiente para eliminar completamente los efectos de CO _2.
4. Insertar el extremo del resorte en el vial hasta que el borde interior de la Velcro quede al ras con la parte superior del vial (Figura 1B). Cuando la primavera está plana, 1 pulgada (2,5 cm) del vial debe solapar la región elevada de la cubierta cubo de hielo. Los viales se pueden reutilizar mningún veces.
5. Mientras está sentado, mantenga el vial en la región de velcro con el pulgar y el dedo índice de su mano izquierda. Sostenga la junta ajustado al sobremesa con la mano derecha. Como alternativa, utilice C-abrazaderas para sostener el tablero ajustado al sobremesa.
6. Tire de la primavera perfectamente hacia atrás hasta el ángulo deseado. Suelte la primavera. Deje que la primavera por venir a una parada completa.
7. Retire el vial de la primavera y permiten que las moscas se recuperen para ≥5 min. Someter las moscas a otra huelga o transferir las moscas a un vial con la comida de la mosca.
   NOTA: Una variedad de ensayos se puede utilizar para evaluar los efectos fenotípicos de huelgas desde el dispositivo HIT. Por ejemplo, los efectos sobre la longevidad se pueden determinar mediante el análisis el porcentaje de moscas que sobreviven a veces después de la lesión, los efectos sobre la morfología del cerebro pueden ser determinados por el análisis histológico de la cabeza, y los efectos sobre la expresión génica pueden ser determinados por análisis cuantitativo de los niveles de mRNA ^10.
8. Determinefectos electrónicos del procedimiento que no se deben a las huelgas por el tratamiento de forma idéntica moscas de control que no están sometidos a las huelgas. Use protección para los oídos debido a que el impacto de la ampolla contra la tapa de cubo de hielo produce un ruido fuerte.

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Resultados

Estamos interesados ​​en entender por qué las moscas mueren poco después de la lesión primaria. Para cuantificar la muerte, se determinó el Índice de Mortalidad a las 24 horas (MI _24), que es el porcentaje de moscas que murió dentro de las 24 horas de la lesión primaria. Las moscas sometidas a ataques desde el dispositivo de HIT se incubaron a 25 ° C en un vial con la comida de la mosca, y el número de moscas muertas se contó después de 24 horas. Utilizamos este enfoque para identificar los fac...

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Discusión

El método HIT dispositivo se distingue de otros métodos que infligen lesión traumática en las moscas por el hecho de que se hace que la cabeza cerrada en lugar de penetrar TBI ^11. Además, el método dispositivo HIT toma menos tiempo, esfuerzo y habilidad para infligir TBI en muchas moscas, por lo que el método es más susceptible que otros métodos a las pantallas genéticos a gran escala. Por último, el hecho de que las lesiones primarias infligidas por el dispositivo HIT no se limitan al cerebro es a...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zinc plated compression spring	The Hillman  Group	540189	9 7/8 inch (length, 2.2 cm), 15/16 inch (outer diameter, 2.4 cm), 0.12 inch (wire size, 0.3 cm)
Wooden board			9 inch (length, 22.9 cm), 6.5 inch (width, 16.5 cm), 0.75 inch (height, 1.9 cm)
Clamps	Sigma Electrical Manufacturing Corporation	49822	3.10 inch (length, 7.9 cm), 0.68 inch (width, 1.7 cm), 1.11 inch (height, 2.8 cm), EMT Two Hole Straps, click on type for 1 inch (2.5 cm) steel EMT conduit
Loop half of self-adhesive velcro			3 inch (length, 7.6 cm), (3/4 inch width, 1.9 cm)
Polyurethane ice bucket cover	Fisher Scientific	02-591-45	9 1/8 inch (length, 23.2 cm), 9 1/8 inch (width, 23.2 cm), 1 1/4 inch (height, 3.2 cm)
Plastic fly vials	Applied Scientific	AS-510	3 11/16 inch (height, 9.4 cm), 1 1/16 inch (inner diameter, 2.7 cm), 1 1/8 inch (outer diameter, 2.9 cm)
Large cotton balls	Fisher Scientific	22-456-883
Paper protractor			10 inch (diameter, 25.4 cm)