Un protocolo de estrés leve crónico impredecible para los síntomas depresivos, instigar cambios de comportamiento y los resultados de salud negativos en los roedores

Resumen

The unpredictable chronic mild stress (UCMS) protocol is a validated method for studying behavioral and physiological changes associated with chronic stress and depressive symptoms. Eight weeks of imposition of the UCMS protocol induces behavioral changes and poor health outcomes in rodents of either gender.

Resumen

El estrés crónico, sin resolver es un factor de riesgo importante para el desarrollo de la depresión clínica. Aunque se han reportado muchos modelos preclínicos de la depresión inducida por el estrés, el estrés leve crónico impredecible (UCMS) protocolo es un modelo de traslación-correspondiente fijado para inducir síntomas conductuales comúnmente asociados con la depresión clínica, como la anhedonia, el comportamiento de acicalamiento alterado, y se enteró de desamparo en los roedores. El protocolo UCMS también induce fisiológica (e .g., Hipercortisolemia, hipertensión) y neurológicos (por ejemplo, anhedonia, indefensión aprendida) cambios que están clínicamente asociados con la depresión. Es importante destacar que los síntomas depresivos inducidos por UCMS se pueden mejorar a través crónica, pero no aguda, el tratamiento con ISRS comunes. Como tal, el protocolo UCMS ofrece muchas ventajas sobre los protocolos de estrés agudo o protocolos que utilizan los factores de estrés más extremas. Nuestro protocolo consiste en exposiciones aleatorios diarios a 7 stre distintassors: ropa de cama húmeda, eliminación de la ropa de cama, inclinación jaula, alteración de los ciclos de luz / oscuridad, tensiones sociales, baño en aguas poco profundas, y sonidos de depredadores / olores. Sometiendo roedores 3-4 horas al día a estos factores estresantes leves durante 8 semanas, se demuestra tanto los cambios conductuales significativos y los resultados de salud pobres en el sistema cardiovascular. Este enfoque permite el interrogatorio a fondo de los neurológicos, conductuales y fisiológicos alteraciones asociadas con la depresión inducida por el estrés crónico, así como para la experimentación de nuevos agentes terapéuticos potenciales o estrategias de intervención.

Introducción

Enfermedad mental depresivo es un trastorno neurológico complejo que está actualmente reconocida como una de las principales causas de la carga de la discapacidad y la enfermedad en todo el mundo. El NIMH informa que aproximadamente el 12% de los estadounidenses sufren de depresión clínica, con el doble de mujeres afectadas en comparación con los hombres ^1. Sólo en los EE.UU., la depresión representa miles de millones de dólares los costes sanitarios directos y un estimado de $ 193 mil millones más en costos indirectos (ganancias baja y pérdida de productividad) ^2. Los síntomas de la depresión incluyen anhedonia, los cambios en los ciclos de peso y del sueño, disminución de la actividad física y la higiene personal, sentimientos de desesperanza o culpa, y / o pensamientos recurrentes de muerte o suicidio. Durante la última década, epidemiológica y los estudios clínicos han indicado que la depresión es un factor de riesgo independiente para la enfermedad cardiovascular (ECV) morbimortalidad ^3, y es un valor pronóstico más grave de las patologías cardiovasculares, incluyendo untherosclerosis, hipertensión, infarto de miocardio y enfermedad arterial coronaria, independientemente de antecedentes de ECV abierta ^4. A pesar del aumento de la prevalencia y el impacto adverso en la salud pública de la depresión, la etiología y relacionados fisiopatología de esta enfermedad es poco conocida y la heterogeneidad de la enfermedad debido a diversos factores (por ejemplo, y los componentes genéticos, biológicos ambientales) ha hecho el diagnóstico clínico difícil definir.

La evidencia indica que el estrés psicológico irresoluble es un factor importante que contribuye para el desarrollo de enfermedades depresivas, y también puede ser un factor que une la depresión patógena potente y ECV, en parte debido a la interrupción y la desregulación del eje hipotalámico-pituitario-adrenal (HPA) ^5,6. La disfunción del eje HPA es un mecanismo importante que se ha relacionado con los cambios conductuales y fisiológicos observados en la depresión y el desarrollo de varios factores de riesgo de ECV, incluyendodislipidemia, la obesidad, la diabetes y ^7. Múltiples modelos preclínicos de depresión se han desarrollado en un intento de replicar el mecanismo de la alteración de la actividad del eje HPA característico de la depresión clínica; tales modelos proporcionan un medio validados para la investigación de los cambios de comportamiento, neurológicos y fisiológicos asociados con el estrés crónico y agudo en los animales. La validez de un modelo animal de la enfermedad se basa en la relevancia de la etiología y la progresión del diseño del modelo y su capacidad para recapitular anatómicos, neurofisiológicos, y las características de comportamiento observados en las enfermedades humanas. Además, las respuestas a los tratamientos preclínicos (tales como SSRIs) deben producir resultados similares a los observados en entornos clínicos.

Varios modelos animales de depresión inducida por el estrés se utilizan actualmente en la investigación, como la indefensión aprendida, el estrés primeros años de vida, el estrés y la derrota social. Sin embargo, cada uno de estos modelos tiene desventajas inherentesque disminuyen su eficacia traslacional ^8. En las dos últimas décadas, el protocolo de impredecibles crónica estrés leve (UCMS) ha surgido como uno de los modelos más traslación relevantes para el estudio de la fisiopatología de la depresión en roedores ^9. Este modelo se basa en el concepto fundamental que la exposición crónica a factores de estrés interrumpe sistemas de respuesta al estrés y en última instancia conduce al desarrollo de los trastornos depresivos. Durante el protocolo UCMS, los animales son expuestos a una serie aleatoria de factores de estrés ambientales y sociales leves sobre una base diaria. Un factor crucial que mejora la pertinencia de este modelo para situaciones humanas radica en el alto grado de imprevisibilidad y la incontrolabilidad de los factores de estrés, así como el momento en que se introducen. Además, el protocolo UCMS utiliza sólo factores de estrés leves, en lugar de confiar en la vida temprana o estímulos físicos agresivos. Durante un período de exposición UCMS, conductas depresivas desarrollan y son comparables a Clinsíntomas ical, incluyendo disminución de la capacidad de respuesta a las recompensas (anhedonia), cambios en la actividad física y el comportamiento de investigación (impotencia y desesperanza), el deterioro del estado de la capa y la actividad sexual alterada ^10. Casi todos los síntomas demostrables de la depresión se han reportado el uso de este modelo, y los estudios han demostrado que estos comportamientos persisten durante varias semanas después de la cesación de estrés. Además, estos comportamientos depresivos inducidos por UCMS gradualmente pueden ser reverenciados por crónica, pero, el tratamiento no agudo con antidepresivos particulares, lo que sugiere efectos neurológicos similares de mejora terapéutica que refleja estrechamente la acción y la eficacia clínica variable de estos agentes en los seres humanos ^{11,14- 18.} Aquí, se presenta una descripción detallada del protocolo UCMS y describimos los resultados típicos de comportamiento y vasculares en ratones.

Protocolo

Todos los procedimientos descritos a continuación han sido revisados ​​y aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Ciencias de la Salud de la Universidad Centro de Virginia Occidental.

1. Selección de Modelo Animal

NOTA: Las especies más comúnmente utilizados en el modelo UCMS incluyen Sprague Dawley, y ratas Wistar y de la BALB / cJ ratón; otros modelos murinos han demostrado una eficacia limitada (DBA / 2, C57BL / 6). Sin embargo, una cuidadosa consideración se debe dar al ratón en particular o cepa de rata de elección, ya que los antecedentes genéticos y la susceptibilidad a los factores de estrés ambientales variar ampliamente entre las especies y han demostrado ser factores críticos que afectan a los resultados del estudio de ^{11,14,15, 19.}

1. Utilice los animales de la edad apropiada (por ejemplo, si el punto final deseado debe ser evaluado en un 17 semanas de edad rata, entonces las ratas deben comenzar el protocolo UCMS en ~ 9 semanas de edad) ya que este protocolo se lleva a least 7-9 semanas para inducir totalmente los síntomas depresivos.
2. Animales de una sola casa sometidos UCMS en jaulas y las instalaciones aprobadas por la IACUC, con comida y comida estándar ad libitum disponibles (salvo disposición contraria de protocolo específico).
3. Tenga especial cuidado para asegurar los controles están alojados en una habitación tranquila con una actividad mínima para reducir los efectos de los posibles factores de estrés ambientales desconocidos.

2. Impredecible Protocolo estrés leve crónico

NOTA: Los animales sometidos a UCMS son transportados diariamente (> 5 días por semana) a una habitación limpia utilizada para manipulaciones UCMS. Los animales se expusieron a 1 o 2 de los factores de estrés que figuran a continuación cada día. Los factores estresantes se llevan a cabo en un horario aleatorio, y cada estrés se administra durante un mínimo de 3-4 horas (véase la Tabla 1).

1. Humedezca la ropa de cama vertiendo 10.20 oz agua limpia en cada jaula estándar. Ajustar la cantidad de agua en consecuencia para el tamaño de lajaula para amortiguar totalmente la ropa de cama pero no causar acumulación de agua. Residir los animales en jaula húmedo durante 3-4 horas.
2. Retire la ropa de cama de cada jaula durante 3-4 horas, después de lo cual los animales son la transición a otro factor de estrés que requieren una jaula vacía (baño de poca profundidad, inclinación jaula) o colocados en una jaula limpia con ropa de cama fresca.
3. Jaulas de inclinación a aproximadamente 45 ° (sin ropa de cama) para 3-4 horas. Las jaulas se pueden inclinar con un objeto sólido que se mantendrá en su lugar cuando el animal se mueve alrededor de la jaula.
4. Alter 12 horas de luz / 12 horas / ciclos oscuros normales en sucesiones de 30 min períodos que duran 8 horas. Después, devuelva los animales con el ciclo normal.
5. Transferir cada animal de su jaula hogar a la de la jaula de un animal vecino que ha sido retirado por 3 hr.
6. Quite toda la ropa de cama de cada jaula y añadir agua hasta una profundidad de ~ 0,25 pulgadas para ratones o ~ 0,5 pulgadas para las ratas durante aproximadamente 4 horas. Use agua que está más caliente que la RT (~ 30 ° C) para minimizar la hipotermiapotencial ia. Animales Brevemente secas con una toalla suave en la conclusión de la exposición al agua antes de la colocación en jaulas limpias.
7. Exponga animales depredadores olores / sonidos añadiendo mechones de muestra distribuidos aleatoriamente de la piel o la orina (10-20 ml) de una especie de depredadores naturales en la jaula de 3-4 horas. Alternativamente, jugar gruñidos o ruidos depredadores de especies de depredadores naturales en las proximidades de las jaulas de 3 horas.
8. Al final de cada período de estrés diario, coloque todos los animales en jaulas limpias y devolverlos a la instalación de la vivienda.

3. Monitoreo de animales / Grooming Puntuaciones

1. Inspeccione cada animal al día durante el desarrollo de las heridas o llagas que pueden requerir tratamiento veterinario. Los animales que desarrollan lesiones leves pueden continuar en el protocolo UCMS en el consentimiento del veterinario.
   1. Dos investigadores capacitados en la evaluación de aseo escudo inspeccionar cada animal y asignan una puntuación escudo semanal en una escala de 0-1. Esta puntuación es disuadirminada asignando puntuaciones individuales (0- limpio, 1-sucio) a cada uno de 8 cuerpo de cabeza regiones-, cuello, capa dorsal, capa ventral, cola, patas delanteras, patas traseras, y la región genital. Los mismos investigadores han de realizar esta tarea durante todo el protocolo UCMS para mantener la coherencia en la asignación de puntajes capa.
   2. Cualquier animal que experimenta una fuerte reducción en el peso corporal (es decir,> 15%) se debe informar al personal veterinario y debe ser retirado del protocolo.

4. Pruebas de Comportamiento y parámetros valorados

NOTA: Varios métodos de evaluación se puede utilizar para cuantificar cambios en el comportamiento del protocolo UCMS en roedores.

1. Acumulativo Score y estética Escudo.
   1. Como se describió anteriormente, una puntuación de aseo capa semanal se asigna para cada animal.
2. La sacarosa Splash prueba:
   1. Colocar el animal en una jaula de líneas puras con un disco de algodón o una toalla para evitar que la ropa de camase adhiera a su pelaje. Rocíe una solución de sacarosa al 10% en el escudo de cada animal cabeza y dorsal y registrar el comportamiento total de aseo durante 5 min.
   2. Actividad (definida como la limpieza de la piel por lamer o rascar) Grooming se mide por la latencia (tiempo de inactividad entre la primera pulverización y el inicio de la preparación) y la frecuencia (número de veces que preparan una parte del cuerpo en particular).
3. La sacarosa prueba de preferencia:
   1. Habituar a los animales para beber 1% de solución de sacarosa (w / v) 72 hr antes de la prueba y luego proporcionar exposición a dos botellas (solución de sacarosa al 1% frente a agua del grifo en diferentes botellas). Después de la habituación, proporcionar animales con acceso ad libitum a la solución y grifo de agua sacarosa durante 3 horas. Después de 3 horas los volúmenes récord de consumo de solución de sacarosa y agua del grifo y calcular la preferencia sacarosa como: [(consumo de sacarosa) / (consumo de agua + consumo de sacarosa)] × 100.
4. Tail Suspension Test (Sólo ratones):
   1. Supasar los ratones por la cola de una barra estable (20 cm del suelo) con cinta adhesiva (2 cm desde la punta de la cola). Tiempo de inmovilidad registro durante 5 min. Los ratones se considera inmóvil cuando cuelgan pasiva y completamente inmóvil.
5. La prueba de natación forzada:
   1. Coloque los animales en un contenedor (~ 15-20 cm de diámetro para los ratones; ~ de 55-60 cm de diámetro para ratas) llenos de agua a una temperatura de 26 ± 0,5 ° C. Registre la latencia a la primera pelea de la movilidad y el tiempo inmóvil durante el período de prueba de 5 min. Al final de la prueba, coloque el animal mojado en una jaula de explotación en una almohadilla caliente (30-35 ° C) con ropa normal, cubierta por una toalla de papel absorbente hasta que se seque.
6. Laberinto elevado:
   1. Permita que cada animal para explorar el laberinto libremente durante 5 min. Total de entradas de registro en cada brazo, y el tiempo total gastado en cada brazo, de acuerdo con criterios a priori ^20.
7. Locomotor de la actividad:
   1. Los niveles de actividad de registro, que se define como el movimiento global, movimientos de bella, movimientos de cría, y la inactividad, por tanto aguda (30 min) y / o crónica (12 hr) períodos de tiempo. Haga esto usando la jaula casa o un nuevo entorno, en función del entorno individuo (aunque la consistencia debe mantenerse) en tiempo real por un observador o post-hoc mediante la reproducción y el análisis de imágenes de la cámara.

5. Expansión / Variación del Protocolo UCMS

1. Administrar agentes o retos terapéuticos apropiados para estudiar su capacidad de cualquiera de embotar el desarrollo de los resultados inducidos UCMS (si se inicia antes de tiempo) o para revertir la gravedad de los resultados inducidos UCMS establecidos (si se inicia tarde). Este es dependiente del laboratorio individual o protocolo ^11.

6. Las evaluaciones resultado final

1. Tras la conclusión de protocolos UCMS y pruebas de comportamiento, utilizar animales en la posterior experiments de manera que responda a las hipótesis, objetivos o metas del laboratorio individual específicos.
   NOTA: Como ejemplos, esto puede incluir las respuestas cardiovasculares, inflamatorias o endocrinas al estrés crónico. Por otra parte, las intervenciones terapéuticas se pueden introducir en este momento para evaluar su eficacia y bases mecanicistas.

Resultados

Un ejemplo de la programación de una semana después del procedimiento UCMS se muestra en la Tabla 1. Cada semana, los factores de estrés fueron asignados al azar para evitar aclamación y asegurar imprevisibilidad del desafío de estrés de cada día.

Medidas de depresivo como Comportamientos

Después de 8 semanas de UCMS, hubo alteraciones significativas en ambos resultados conductuales y fisiológicos en roedores crónicamen...

Discusión

Extensive clinical and epidemiological evidence has indicated that chronic stress is one of the most potent precipitating factors for depression. Repeated exposure to stressors may potentiate individual vulnerability to depression and other neuropsychiatric disorders as a consequence of the psychological and physical demands within the body that accumulate over time. The use of validated preclinical animal models offers a valuable translational tool for studying depression and comorbid diseases. Firstly, an ideal animal ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Temporary animal cages with lids	n/a	n/a	Provided by your animal care facility
Rodent bedding	n/a	n/a	Provided by your animal care facility
Predator fur or urine	n/a	n/a	Provided by your animal care facility
Rodent cage drinking bottles	n/a	n/a	Provided by your animal care facility
1000 ml graduated cylinder	variable	variable	This is optional.  Any container from which a known quantiity of water can be poured will be appropriate
Wooden blocks cut from 2x4	variable	variable	8 inch sections are cut to facilitate cage tilt procedures
Soft paper towels	n/a	n/a	Provided by your institution
Small spray bottle	Walmart	n/a	100-200 ml volume is sufficient, used for sucrose splash test
Medium (mice) or large (rats) plastic tubs for swim testing	Walmart	variable	Should be of sufficient depth that the animals cannot touch bottom (e.g., 2 feet)