Fotoactivado Localización Microscopía con bimolecular fluorescencia Complementación (BiFC-PALM)

Resumen

Protein-protein interactions are visualized in cells with nanometer spatial resolution by combining bimolecular fluorescence complementation (BiFC) with photoactivated localization microscopy (PALM). Described here is the use of BiFC-PALM for imaging Ras-Raf interactions in U2OS cells for visualizing the nanoscale clustering and diffusion of individual Ras-Raf complexes.

Resumen

Protein-protein interactions (PPIs) are key molecular events to biology. However, it remains a challenge to visualize PPIs with sufficient resolution and sensitivity in cells because the resolution of conventional light microscopy is diffraction-limited to ~250 nm. By combining bimolecular fluorescence complementation (BiFC) with photoactivated localization microscopy (PALM), PPIs can be visualized in cells with single molecule sensitivity and nanometer spatial resolution. BiFC is a commonly used technique for visualizing PPIs with fluorescence contrast, which involves splitting of a fluorescent protein into two non-fluorescent fragments. PALM is a recent superresolution microscopy technique for imaging biological samples at the nanometer and single molecule scales, which uses phototransformable fluorescent probes such as photoactivatable fluorescent proteins (PA-FPs). BiFC-PALM was demonstrated by splitting PAmCherry1, a PA-FP compatible with PALM, for its monomeric nature, good single molecule brightness, high contrast ratio, and utility for stoichiometry measurements. When split between amino acids 159 and 160, PAmCherry1 can be made into a BiFC probe that reconstitutes efficiently at 37 °C with high specificity to PPIs and low non-specific reconstitution. Ras-Raf interaction is used as an example to show how BiFC-PALM helps to probe interactions at the nanometer scale and with single molecule resolution. Their diffusion can also be tracked in live cells using single molecule tracking (smt-) PALM. In this protocol, factors to consider when designing the fusion proteins for BiFC-PALM are discussed, sample preparation, image acquisition, and data analysis steps are explained, and a few exemplary results are showcased. Providing high spatial resolution, specificity, and sensitivity, BiFC-PALM is a useful tool for studying PPIs in intact biological samples.

Introducción

Las interacciones proteína-proteína (IBP) son fundamentales para la biología ¹ y están estrictamente regulados por mecanismos espacio-temporales en muchas escalas de tiempo y longitud. Los estudios sobre la señalización celular en la membrana celular, por ejemplo, han puesto de manifiesto compartimentos espaciales dinámicas, a nanoescala que facilitan IBP específicos y procesos celulares ^2. Por lo tanto, la capacidad para sondear los IBP en los sistemas biológicos con suficientes resoluciones espaciales y temporales, una alta especificidad y alta sensibilidad es clave para lograr una comprensión mecanicista de la biología.

Bimolecular complementación de fluorescencia (BiFC) es una de las pocas herramientas existentes para la visualización de los IBP en una celda con resolución subcelular y la compatibilidad de las células vivir ^3-5. La técnica es relativamente sencilla y consiste en la división de una proteína de fluorescencia en dos fragmentos no fluorescentes; cuando etiquetados genéticamente para dos proteínas que interactúan ypuesto en proximidad, los fragmentos pueden reconstituir para formar una proteína fluorescente completa, dando señal fluorescente. Cuando se diseñan adecuadamente, sondas BiFC no deben reconstituir de forma espontánea en ausencia de IBP. Como tal, la señal de fluorescencia en un ensayo de BiFC sólo surgir en la presencia de los IBP, que permite la visualización directa de los IBP con alta especificidad. Beneficios adicionales de utilizar la fluorescencia como la lectura son de alta sensibilidad, resolución subcelular, y la compatibilidad con un alto rendimiento y ensayos de cribado de alto contenido, entre otros. Para estos beneficios, una serie de sondas BiFC basados ​​en diferentes proteínas fluorescentes padres se han desarrollado. Como en todas las otras técnicas de detección basados ​​en microscopía de luz convencional, sin embargo, la resolución espacial de BiFC se limita a ~ 250 nm por la difracción de la luz. Esto hace que sea un reto para estudiar la regulación de los IBP en la nanoescala, que, como se aludió antes y ejemplificado por las balsas de lípidos ^6and nanoclusters Ras ^7, es una escala de longitud crítica para la comprensión de muchos procesos celulares como la señalización.

BiFC se ha combinado con microscopía de localización fotoactivado ^(PALM) 8,9 para superar este límite de la resolución espacial para obtener imágenes de los IBP ^10. PALM es una técnica de microscopía de super-resolución reciente que elude el límite de difracción en imágenes de fluorescencia a través de la activación estocástico y localización subdiffractive de moléculas fluorescentes individuales. En cada ciclo de activación, una molécula fluorescente emite unos pocos cientos a unos pocos miles de fotones y da lugar a una sola imagen molécula en el detector. Mientras que la imagen es de difracción limitada (~ 250 nm de anchura), su centroide se puede determinar con precisión mucho mayor, típicamente del orden de un 10-50 nm en función del número de fotones detectados. Mediante la activación y localización de cada molécula fluorescente en la muestra, una imagen de alta resolución puede ser reconstruido. Performed en las células vivas, sola molécula de seguimiento (SMT-) PALM permite además adquisición de miles de trayectorias de difusión proteína a partir de una sola célula ^11. Es importante destacar que, PALM utiliza sondas fluorescentes especializados tales como proteínas fluorescentes fotoactivables (PA-PM) para lograr la activación estocástico. Dado que tanto BiFC y proteínas fluorescentes uso PALM, que se combinaron mediante el fraccionamiento de PAmCherry1, un PA-FP comúnmente utilizado para PALM, en dos fragmentos entre los aminoácidos 159 y 160.

El sistema basado en PAmCherry1 BiFC dividida muestra una baja señal de fondo de la reconstitución espontánea de los dos fragmentos. Cuando etiquetado genéticamente a un par de proteínas que interactúan, los dos fragmentos (RN = residuos 1 a 159; RC = Met + residuos 160-236) reconstituido de manera eficiente para formar proteínas completas PAmCherry1 incluso a 37 ° C y sin incubación a temperaturas más bajas, lo cual No es el caso de otros pares BiFC ¹² como el padre mCherry ^13. Furthermore, la proteína PAmCherry1 reconstituido conserva las propiedades fotofísicas del PAmCherry1 padres, tales como alta relación de contraste, rendimiento de fotones medio y fotoactivación rápida, entre otros, que son fundamentales para la exacta localización sola molécula y de imágenes PALM alta resolución.

En este protocolo, se describe el uso de BiFC-PALM para obtener imágenes de las interacciones Ras-Raf en células U2OS utilizando dividida PAmCherry1 (Figura 1). El primer paso es el diseño de las construcciones para la expresión de proteínas de fusión entre los fragmentos PAmCherry1 (es decir, RN y RC) y las proteínas de interés. En teoría, para cada par de proteínas candidatas (A y B), hay ocho pares de proteínas de fusión a ensayar: RN-A / RC-B; RN-A / B-RC; RC-A / RN-B; RC-A / B-RN; A-RN / RC-B; A-RN / B-RC; A-RC / RN-B; y A-RC / B-RN. Este proceso a menudo se puede simplificar teniendo en cuenta las propiedades estructurales o bioquímicas de las proteínas candidatas. En el caso de Ras, la proteína esdespués de la traducción modificado el cuadro de CAAX C-terminal (C = Cys; A = alifático; X = cualquier), después de lo cual el motivo AAX se escinde. Por lo tanto, RN o RC sólo pueden ser fusionados con el extremo N-terminal de Ras; esto reduce el número de pares de proteína de fusión a cuatro (Figura 1B). Para Raf, los dominios Ras vinculante (RBD; residuos 51-131) se utiliza y se pueden etiquetar en cada extremo. Se generaron Estas cuatro configuraciones de fusión: RN-KRas / RC-Raf RBD; RN-KRas / Raf RBD-RC; RC-KRas / RN-Raf RBD; y RC-KRas / Raf RBD-RN.

Además, tendrá que ser considerado el enlazador entre los fragmentos y las proteínas de interés. Un enlazador flexible de aproximadamente diez aminoácidos se utiliza a menudo, ya que proporciona la suficiente libertad para la complementación que se produzca. Uno de estos es enlazador (GGGGS) x2, aunque hay muchos otros que se han aplicado con éxito, incluyendo secuencias aleatorias generadas a partir de un sitio de clonación múltiple (MCS) ^14. La longitud de los enlazadores puede necesitar ser optimizado depending del tamaño de las proteínas de interés y sus orientaciones cuando interactúan.

Los fragmentos PAmCherry1 están contenidos en una pequeña columna vertebral de la clonación con flanqueando MCSs (ver Lista de Materiales). Los genes de interés se pueden insertar a través de los sitios de restricción o con un método de ligadura independiente. Después de la clonación y la secuencia de verificación, el casete de expresión se transfiere a un vector de expresión usando una reacción de recombinasa, un proceso de clonación con alta fidelidad y alta eficiencia.

A continuación, las construcciones de expresión resultantes se transfectaron en la línea de célula diana o, si se desea una línea celular estable, empaquetado en lentivirus para infectar la línea celular objetivo. La transfección transitoria permite la validación rápida de las configuraciones BiFC, pero los problemas potenciales debe tenerse en cuenta. La transfección utilizando productos químicos a menudo hace hincapié en las células, lo que resulta en alta autofluorescencia; mientras que el uso del total de fluorescencia de reflexión interna (TIRF) microscopy puede mitigar esta señal de fondo mediante la limitación del volumen de la iluminación, TIRF ideal cuando los IBP tienen lugar en la membrana celular. Además, las transfecciones transitorias a menudo conducen a altos niveles de expresión de proteínas, muy por encima de los de las proteínas endógenas, que pueden causar artefactos en la detección de los IBP. Por lo tanto, se recomienda que se establezcan líneas celulares estables después de una configuración apropiada BiFC se ha determinado a través de pruebas inicial. Las líneas celulares estables también tienen el potencial para la expresión sintonizable mediante doxiciclina inducción ^15.

Después de la infección, las células se seleccionan con antibióticos, por lo general puromycin y neomicina, uno para cada constructo. Los pasos subsiguientes para la preparación de muestras, la adquisición de imágenes y análisis de datos se describen en detalle en los protocolos.

Con este enfoque, la formación de agrupaciones de nanoescala en imágenes BiFC-palma de Ras-Raf RBD se observan rutinariamente (Figura 2A </ strong>). Consistentemente, trayectorias smt-palma de Ras-Raf RBD muestran una distribución heterogénea en los estados de difusión (Figura 2B-D). Estos resultados sugieren que existen complejos de Ras-Raf en varios estados en la membrana celular, presumiblemente como monómeros y clusters, con potenciales implicaciones biológicas. Este trabajo demuestra el poder de BiFC-PALM en imagen selectiva de los IBP en células con nanómetros resolución espacial y sensibilidad única molécula, que sería difícil de obtener con BiFC convencional, fluorescencia co-localización, o transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET).

En el diseño de experimentos BiFC e interpretación de los resultados, es importante tener en cuenta que el proceso BiFC es irreversible en la mayoría de casos, incluyendo PAmCherry1 dividida. Una vez que los dos fragmentos se combinan y forman una proteína PAmCherry1 completa, el enlace entre los dos fragmentos, y por lo tanto el PPI se convierte en permanente. Esto limita el uso de BiFC y BiFC-PALM para el seguimiento de la dinámica de los IBP (es decir, la cinética de unión y no la dinámica de difusión del complejo de proteínas, una vez que se forma) y, a veces incluso podría conducir a mislocalization de los complejos de PPI.

Un factor adicional a tener en cuenta en el diseño de experimentos BiFC-PALM es el retraso en la maduración cromóforo que es inherente a las proteínas fluorescentes. Una vez que dos proteínas interactúan y los fragmentos de PF se unen, por lo general refold del orden de segundos (tiempo-medio de 60 seg para EYFP ^3). Sin embargo, la maduración cromóforo subsiguiente y la señal fluorescente se desarrollan en el orden de minutos. Mientras que la fluorescencia puede ser detectable en 10 minutos después de la reconstitución de la fracción de Venus, una variante de rápido plegado YFP, el tiempo medio para la maduración en general es a menudo alrededor de 60 min ^16. Split-PAmCherry1 se observó a tener tasas similares. Por lo tanto, BiFC y BiFC-PALM son opciones actualmente pobres para el seguimiento de la cinética de PPI en tiempo real; otro yothods, tales como FRET y una proteína fluorescente dependiente de la dimerización recientemente desarrollado ^17, pueden ser más adecuados para este propósito.

Protocolo

1. Clonación

1. Determine las configuraciones de clonar y elegir un enlazador. Proteínas de la etiqueta con los fragmentos de la N- o C-terminal como se describe a continuación para que no interrumpan su correcta localización. Utilice un enlazador flexible, tal como (GGGGS) x2.
2. Genéticamente etiquetar las proteínas de interés a los fragmentos PAmCherry1. Como una opción, utilice los plásmidos de clonación que figuran en la Lista de materiales que contienen los fragmentos de RN (residuos PAmCherry1 1-159) y RC (Met más residuos PAmCherry1 160-236) con flanqueando MCS secuencias.
   1. Linealizar los plásmidos que contienen los fragmentos de RN y RC con PCR inversa (o digestión de restricción) en el punto de inserción. Los cebadores para PCR inversa se ​​enumeran en la Tabla 1. A continuación se muestra un ejemplo de protocolo de PCR utilizado en el laboratorio del autor (ver Lista de materiales para los materiales exactos utilizados en este protocolo).
      1. Mezclar la reacción de PCR juntos, llevado hasta un volumen final de 50 l con agua: a una pared delgadatubo ed PCR, añadir el agua, 25 l de mezcla maestra 2x, 0,5 mu l cada uno de los cebadores directo e inverso (20 mu M de valores diluidos, 0,2 M de concentración final), y 1 ng de plantilla. Use las siguientes condiciones de ciclo: 98 ° C durante 30 seg, 30 ciclos de 98 ° C durante 7 segundos y 68 ° C durante 2 min, y una extensión final a 72 ° C durante 10 min.
   2. PCR los genes de interés para la inserción de los plásmidos linealizados que contenían fragmentos de RN y RC. Realice la PCR como en el paso 1.2.1 con el tiempo de extensión a 68 ° C. Utilice cebadores con voladizos que contienen una secuencia de unión flexible, tal como GGAGGTGGAGGTAGTGGTGGAGGTGGAAGT para (GGGGS) x2, y 15 pares de bases de homología con los extremos de la RN linealizado y plásmidos RC para la recombinación.
      Nota: Los voladizos cebadores para las proteínas de interés se presentan en la Tabla 2, si el uso de los cebadores en la Tabla 1 para linealizar el plásmido columna vertebral.
   3. Digerir el PCRreacción con Dpn1 para eliminar la plantilla de PCR. Añadir 0,5 l de Dpn1 (20 U / l) directamente a los 50 l de reacción de PCR. Incubar a 37 ° C durante 1 hr y el calor inactivar al 80 ° C durante 20 min. Si la plantilla de fondo persiste en pasos posteriores, aumente la cantidad de enzima o alargar el tiempo de digestión.
   4. Purificar los productos de PCR a través de una columna de centrifugación como se describe por el fabricante.
   5. Realizar una reacción de ligadura independiente para combinar un plásmido linealizado que contiene un RN o fragmento de RC con el gen de interés. Medir la concentración de los productos de PCR purificados: combinar 50 ng de plásmido linealizado y 50 ng del gen de interés con 1 l de enzima premezcla y llevar el volumen total a 5 l con agua desionizada. Se incuba a 50 ° C durante 15 minutos, el lugar en el hielo, y añadir 20 l de tampón TE.
   6. Transformar los plásmidos recombinantes en bacterias competentes ^18.
   7. Seleccione 2-4 + (según se desee) colonias de O cultura / N. Añadir 5 mlde caldo LB y 5 l de kanamicina (50 mg / ml) en un tubo de fondo redondo de 14 ml de polipropileno, y añadir la colonia bacteria seleccionada con un asa de inoculación esterilizada. Incubar a 37 ° CO / N con agitación a 225 rpm.
   8. Congelar 1 ml de cultivo O / N para el glicerol y ¹⁹ de la miniprep el resto como se describe por el fabricante.
   9. Realizar secuenciación para determinar un buen clon. Si se utiliza los plásmidos de clonación en la Lista de Materiales, M13 utilizar cebadores directo e inverso (en reacciones separadas) según sea necesario para obtener la secuencia completa de la construcción de fusión. Comparar con la secuencia esperada utilizando una herramienta de alineación tal como BLAST del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) - http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/BlastAlign.cgi.
   10. La transferencia de los constructos secuencia verificada a un plásmido de expresión a través de una reacción recombinasa.
       1. Añadir 75 ng del plásmido de destino & #8212; como pcDNA para transfecciones transitorias o Plenti para embalaje lentiviral ²⁰ - y 50 ng del plásmido de clonación recombinante a 1 l de enzima premezcla y criar a un volumen total de 5 l con agua destilada. Se incuba a 25 ° C durante 1 hora, a continuación, añadir 5 l de tampón TE.
          Nota: Para el envasado lentiviral y estable generación de la línea celular, utilizar un plásmido de destino diferente para cada constructo, por ejemplo, uno con resistencia a la puromicina y el otro neomicina. Esto permite una doble selección de células transducidas. Ten en cuenta también el promotor para cada uno, tal como el promotor de citomegalovirus constitutivo (CMV) para altos niveles de expresión, o CMV con el operador TetO para sintonizable expresión doxiciclina regulado.
       2. Transformar 5 l en bacterias competentes y los plásmidos Miniprep como en los pasos 1.2.6 a 1.2.8, pero utilizando el antibiótico apropiado (típicamente ampicilina).
3. Determinar la óptimaConfiguración BiFC.
   1. Plásmidos cotransfectar expresión en células U2OS (o células de elección).
      1. Añadir 350 l de fenol DMEM libre de rojo y libre de antibióticos suplementado con 10% de SFB en cada pocillo de un porta con cámara inferior de 8 pocillos # 1.5 vidrio. Placa aproximadamente 7,5 x 10 ⁴ células por pocillo lo que las células son aproximadamente 70% -90% de confluencia el día siguiente.
      2. El día después de plásmidos de expresión de chapado, co-transfectar con diferentes configuraciones en cada pocillo utilizando el reactivo preferido y tal como se describe por el fabricante.
         1. Para cada bien, añadir 125 ng de cada plásmido de expresión en 50 l de medios reducidos sin suero en un tubo de 0,6 ml y pipeta de arriba y abajo para mezclar. Añadir 1 l de la reactivo de transfección por el centro del tubo y directamente en los medios de comunicación. Agite suavemente para mezclar y dejar reposar la reacción durante 30 min.
         2. Reducir los medios de comunicación en cada pocillo de la diapositiva cámara a la mitad. Añadir gota a gota la mezcla de transfección a los pocillos y sacuda gtemente para mezclar. Se incuban las células a 37 ° C y _5% de CO2 durante 24 a 48 horas. Cambie los medios de comunicación el día después de la transfección.
   2. Células de imagen en un microscopio de fluorescencia como en el Protocolo 2 comenzando con el paso 2.1.4.
      Nota: La muestra puede ser proyectado sobre un microscopio de fluorescencia estándar si los niveles de expresión son altos y la cámara es lo suficientemente sensible para la salida relativamente baja de fotones de PAmCherry1. Moléculas PAmCherry1 reconstituidas se pueden activar con un conjunto de filtros ultravioleta (405 nm) antes de la proyección de imagen con una excitación verde (561 nm) conjunto de filtros.
4. En su caso, crear un control negativo, por ejemplo, la introducción de una mutación puntual en una de las proteínas de interés que causa la disrupción de la interacción. Realizar una mutagénesis dirigida al sitio ²¹ en el plásmido de clonación de la proteína a mutar y de la configuración elegida.
5. Generar una línea celular estable empaquetando las construcciones en viralpartículas y infectar células U2OS (o línea celular de elección). Considere un sistema inducible (tetraciclina) la expresión ¹⁵ de modo expresión puede ser inducida antes de la imagen si la irreversibilidad prolongada de BiFC es un problema, o si se desea la expresión sintonizable.
   ATENCIÓN: Trabajar con los virus se clasifica como Nivel de Bioseguridad 2. Mientras recientes generaciones de sistemas de envasado virales han reducido en gran medida la probabilidad de producir virus competentes para la replicación, algunos riesgos siguen presentes. Las referencias se pueden encontrar en http://www.cdc.gov/biosafety/publications/.
   1. Repita el paso 1.2.10 utilizando un vector retroviral o destino lenti- ^20. Aumentar el cultivo O / N a 100 ml de una midiprep y una mayor pureza de los plásmidos.
   2. En el Día 1: Placa aproximadamente 2 x 10 ⁶ 293T / 17 células en un plato de 10 cm para cada constructo a envasar.
   3. En el Día 2: Preparar una reacción de transfección usando un transfection reactivo de elección y como se describe por el fabricante.
      1. Preparar una premezcla de envasado de plásmidos con concentraciones finales de 250 ng / l para el envasado de plásmidos 1 y 2, y 100 ng / l para el envasado de plásmido 3 en agua estéril. Añadir 10 l de la premezcla plásmido de embalaje y 2,5 g del plásmido diana a 1 ml de medio reducidos sin suero en un tubo y una pipeta de fondo redondo de 5 ml de polipropileno arriba y abajo para mezclar. Añadir 20 l de reactivo de transfección en el centro del tubo y directamente en los medios de comunicación.
         1. Agitar suavemente para mezclar e incubar a temperatura ambiente durante 30 min. Retire la mitad de los medios de comunicación de las células y añadir la mezcla de transfección gota a gota. Agitar suavemente para mezclar e incubar a 37 ° C y 5% de CO _2. Incubar 10 ml de medio por placa en un tubo con el tapón aflojado para la temperatura y CO ₂ equilibración.
      2. En el Día 3: cambiar suavemente los medios de comunicación con los medios de comunicación pre-incubados y returN las células a la incubadora. Incubar otro tubo de los medios de comunicación con el tapón aflojado.
         Nota: Los sincitios, o la formación de células grandes multi-nucleado, puede ser una señal de que el embalaje está yendo bien. Sin embargo, las células están en un estado frágil y se pueden separar fácilmente. Al cambiar los medios de comunicación, incline la pipeta de modo que sea horizontal y añadir gota a gota el soporte en un borde de la placa.
      3. En el Día 4: Cosecha del virus mediante la eliminación de los medios de comunicación con una jeringa y filtrar a través de un filtro de 0,45 micras de tamaño de poro en un tubo de 50 ml limpio. Reemplazar suavemente los medios de comunicación con los medios de comunicación pre-incubados.
      4. En el Día 5: Cosecha de nuevo como hizo anteriormente en el paso 1.5.3.3 y combinar filtrado común en el mismo tubo de 50 ml. Añadir 6 ml de concentrador de virus a cada tubo y mezclar. Almacenar a 4 ° C durante al menos 24 horas hasta que los precipitados de virus.
         Nota: En función de la salud de las células, el virus se puede cosechar por tercera vez.
      5. Se concentra el virus mediante centrifugación a 1.500 xgdurante 15 min a 4 ° C. Aspirar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 250 l de medios de comunicación. El virus puede ser utilizado inmediatamente para la infección o se almacena en 50 alícuotas a -80 ° C durante un máximo de un año.
      6. Placa aproximadamente 3 x 10 ⁵ U2OS (u objetivo) células por pocillo en una placa de 6 pocillos (2 ml de DMEM con 10% de FBS por pocillo) durante la infección, por lo que las células son aproximadamente 50% de confluencia en el momento de la infección.
      7. Al día siguiente, eliminar la mitad los medios de comunicación por lo que alrededor de 1 ml restos. Coinfectar con 50 l de virus concentrado para cada constructo. Añadir 1 l de polibreno (8 mg / ml) a cada pocillo. Se incuba a 37 ° C y 5% de CO _2. Cambie los medios de comunicación al día siguiente y se incuba durante un día más antes de la selección de antibióticos.
         Nota: La cantidad de virus a añadir puede variar dependiendo de la velocidad deseada de la infección. Los virus se pueden valorar mediante QRT-PCR.
      8. Añadir antibióticos para seleccionar las células infectadas. Pozos separados con células no infectadas que no han visto virus se requieren como canarios para poner a prueba la eficacia de la selección. Incubar durante 2-7 días, o hasta que la selección está completa.
         Nota: Las concentraciones eficaces deben titularse inicialmente, pero son típicamente 1.0 mg / ml para la puromicina y 1,0 mg / ml de neomicina.
      9. Expandir las células en una placa de 10 cm más grande y proceder al Protocolo 2.

2. Las células de imagen fija

1. Preparar una muestra para formación de imágenes
   1. Limpie a 8 y # 1.5 diapositiva cámara de fondo de vidrio mediante la adición de 250 l de NaOH 1 M durante al menos 1 hora y lavar a fondo con PBS.
      Nota: cámara de diapositivas no tratados suelen dar lugar a alta señal de fondo. Además, las células pueden ser sensibles a NaOH y el fracaso para limpiar a fondo la superficie de vidrio (tanto como 10 veces más lavados) puede hacer difícil la adhesión celular residual. Si es necesario, se incuba la diapositiva cámara de limpiado con PBS O / N después del lavado. Para las líneas celulares sensibles, chapado a una densidad más alta(Por ejemplo, en el 50% -60% de confluencia inicial) puede ayudar.
   2. Placa de aproximadamente 5,5 x 10 ⁴ de las células de expresión estable U2OS por pocillo en 350 l de fenol DMEM libre de rojo con 10% de FBS para que las células están sanas y no sobre confluente cuando Imaging.
   3. Realizar tratamientos necesarios para el experimento, como la adición de tetraciclina para inducir la expresión de la proteína.
   4. Fijar las células inmediatamente antes de la imagen.
      1. Antes de la fijación, preparar paraformaldehído solución fresca (PFA) - 3,7% PFA en 1x PHEM con 0,1% glutaraldehído (GA). Para la solución 10 ml de PFA, pesan 0,37 g de PFA y transferir a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Añadir 1 ml de agua destilada y 30 l de NaOH 1 M y vórtice. Se calienta a 70 ° C y agitar cada 1-2 minutos hasta PFA se disuelva por completo.
      2. Transferencia disolvió PFA a un tubo cónico de 15 ml y añadir 3,8 ml de agua destilada, 5 ml 2x tampón PHEM, 20 l de 25% de glutaraldehído, y agitar para mezclar. Stock, tampón PHEM 2x es 120 TUBOS mM, HEPES 50 mM, EGTA 20 mM, 16 mM y MgSO _4, con pH ajustado a 7,0 con 10 M KOH. Esta solución de fijación se puede almacenar a 4 ° C durante varios días.
         PRECAUCIÓN: PFA y GA son tanto peligrosos. Preparar la solución en una campana de extracción y utilizar equipo de protección adecuado al manipular ambos productos químicos. Evitar la inhalación o el contacto directo con la piel.
      3. Retire el medio de crecimiento. Lave rápidamente con 500 l de PBS y añadir 250 ml de fijador PFA por pocillo. Se incuban las células durante 20 min a TA.
   5. Retire el fijador PFA de la muestra y añadir 350 l de PBS o tampón de imagen (Tris 100 mM con NaCl 30 mM y 20 mM de MgCl _2, pH 8,5) por pocillo.
   6. Vortex 100 nm partículas de oro para romper los agregados y añadir 35 l por pocillo (10x dilución final) para el seguimiento de la etapa de deriva durante la exploración.
2. Adquirir imágenes
   1. Encienda el microscopio. Encienda los 405 y 561 nm láseres, pero mantener las persianascerrado (interna o externa) en este punto. Encienda la cámara EMCCD y deje que se enfríe. Asegúrese de que los filtros de 561 nm están en su lugar.
   2. Abra el software de adquisición y establecer el tiempo de exposición a 100 ms y la ganancia EMCCD al 300 (rango 1 - 1000).
   3. Añadir aceite de inmersión al objetivo y asegurar la muestra de la platina del microscopio.
   4. Con cualquiera de campo brillante o el láser de 561 nm en (~ 1 kW / cm ^2), llevar la muestra en el foco.
   5. Para obtener imágenes Ras y otras proteínas de membrana, use un 60X apochromat TIRF objetiva con 1,49 apertura numérica y llevar el microscopio en la configuración TIRF. Ajuste el láser de excitación para que sea descentrada al golpear la abertura posterior de la TIRF objetivo; esto hace que el láser para desviar al llegar a la muestra. Siga ajustando el láser hasta que se alcanza el ángulo crítico y el láser se refleja hacia atrás. Búsqueda de una célula a la imagen con varias partículas de oro a la vista. Establezca una región de interésque encierra la célula (o de una región dentro de la célula) y las partículas de oro.
      Nota: TIRF disminuye la profundidad de penetración del láser de excitación y reduce la señal de fondo fuera de foco. Además, la corrección de la deriva es probable que sea más preciso en que más partículas de oro están a la vista.
   6. Si está disponible, active el sistema de enfoque automático para corregir la deriva de la muestra en la dirección z. De lo contrario, ajuste el enfoque manualmente a lo largo de la adquisición si la imagen se desenfoca.
   7. Comience de adquisición con los 405 nm láser apagado y el láser de 561 nm sobre (~ 1 kW / cm ²⁾ en el caso de activación suficiente se está produciendo ya (por lo general, si los niveles de expresión son altos). De lo contrario, active el láser nm 405 en el nivel de potencia más bajo de la fábrica (0,02 mW o 0,01 W / cm ²⁾ y aumentar gradualmente (0,1 mW a la vez) como sea necesario hasta que hay varias decenas de moléculas por cuadro más o menos que las moléculas individuales están bien separados.
   8. Como la adquisición de datos continúa, graduadodualmente aumentar la potencia del láser 405 nm para mantener la densidad de terreno más o menos constante.
      Nota: A menor potencia de excitación 405 nm, algunos PAmCherry1 ya se puede activar. Como estas moléculas fotoblanqueador, la población de moléculas restante PAmCherry1 fotoactivables disminuye, lo que requiere un mayor flujo de fotones para mantener la misma densidad de las moléculas que emiten fluorescencia en cada fotograma.
   9. Continuar la adquisición de imágenes de alta potencia hasta 405 nm (2,5 a 10 W / cm ²⁾ no se activa más eventos de activación.
      Nota: El tiempo total de adquisición depende del nivel de expresión y la eficiencia de la complementación.
3. Procesar las imágenes
   Nota: Hay muchas opciones de software de código abierto para el procesamiento de imágenes. Ejemplos de ello son la tempestad de truenos (https://code.google.com/p/thunder-storm/) y QuickPALM (https://code.google.com/p / quickpalm /). Los procedimientos típicos de procesamiento de datos se ilustran brevemente aquí usando un paquete personalizado Matlab llamada wfiread para procesar datos de palma como un ejemplo. Sin embargo, las revisiones futuras no pueden seguir exactamente lo que se describe aquí. Para el procesamiento de imágenes con otro software, consulte la documentación de usuario.
   1. Descargue el software de procesamiento de imágenes (Código Archivo Suplementario) o la versión más reciente en http://www.ohsu.edu/nan. Abra Matlab y cargar el software wfiread (que ya se puso en la ruta predeterminada).
   2. Ver la secuencia de imágenes en bruto y determinar la región de interés. Seleccione el área de la pila a procesar pulsando con el botón izquierdo y arrastrando un cuadro alrededor del área deseada. Si la región de interés no se redujo durante la adquisición (a alrededor de 256x256 píxeles), seleccione un área más pequeña para reducir el tiempo de cálculo. Para anular la selección de un área y procesa toda la imagen, haga clic derecho en cualquier parte ªe imagen.
   3. Introduzca el rango de fotogramas para ser procesada.
   4. Seleccione una partícula de oro (que está aislado y uniforme en forma) haciendo clic izquierdo sobre la imagen y arrastrando una pequeña caja alrededor de él. En Seguimiento de partículas, haga clic en el botón Seguir. Una gráfica aparecerá que muestra la posición de la partícula de oro seleccionado a través de la pila de imágenes, que representa la medida de la deriva.
   5. Repita este proceso para realizar un seguimiento de la mayor cantidad de partículas de oro como sea posible y determinar los que siguen juntos (las partículas serán codificados por color). Lo ideal sería que la deriva global es del orden de un píxel en la mayoría.
   6. Seleccione individualmente las partículas de oro que dio seguimiento juntos uno a la vez y haga clic en el botón Agregar marcador en Seguimiento de partículas. Una cruz verde aparecerá que significa que se ha añadido como un marcador y se usa para corregir la deriva.
   7. Ajuste el rango Sigma, Rango Smoothing y Umbral según sea necesario, cambiando ligeramente los valores. Haga clic en la Búsqueda de Partículasbotón para probar la configuración. Las partículas que se procesarán serán en caja y los que no lo son se quedará fuera. Las moléculas PAmCherry1, partículas que son relativamente redonda y brillante, se deben seleccionar.
   8. Comience el procesamiento de las imágenes haciendo clic en el botón Coord Archivo Cierre y guarde el archivo.
      Nota: El programa va a ir a través de cada cuadro dentro del rango marco definido, encontrar todos los puntos fluorescentes, y realizar ajuste de Gauss para encontrar las coordenadas del centroide. Un archivo .cor se generará el almacenamiento de todas las coordenadas y otros parámetros de ajuste de las imágenes de una sola molécula procesados.
4. Post-proceso de las imágenes y hacen que la imagen de la palma
   Nota: Otro software puede hacer directamente la imagen después de coordinar la extracción.
   1. En Matlab, lanzar el paquete 'palma' y cargar el archivo .cor acaba de crear.
   2. Antes de dictar la imagen PALM utilizando las coordenadas, ordenar las coordenadas individuales (cada uno de un 'localizatien el evento '). Los valores de clasificación óptimas pueden variar dependiendo de la configuración y el fluoróforo.
      1. Para PAmCherry1, utilice los siguientes valores: Combinando Frame - 8; Combinando Distancia (nm) - 100; RMS mínimo - 4; La bondad de ajuste mínimo - 0,25; y Max. Excentricidad - 1.4. Vea la sección de Discusión para la explicación adicional de estos parámetros.
   3. Haga clic en el botón Ordenar para generar un nuevo conjunto de coordenadas listos para el renderizado de imágenes de alta resolución.
   4. Introduzca valores para la prestación adecuada de la imagen final, tales como el tamaño de píxeles en bruto (nm), el tamaño de la característica deseada (nm) en la imagen renderizada, y el tamaño de píxel de la imagen renderizada.
      Nota: El tamaño de píxel prima debe ser determinada para cada configuración. El tamaño de la característica mostrada puede ser fijado arbitrariamente, pero normalmente se establece en un valor ligeramente superior a la media de precisión de localización. Para PAmCherry1, la precisión media de localización es de alrededor de 18 nm, por lo que un tamaño de la característica de 20 - 30 nm es apropiaciónTE. De la nota, la precisión de localización se calculó tomando la desviación estándar de las localizaciones de la misma molécula a través de múltiples tramas ²² y no dividiendo el límite de difracción con la raíz cuadrada del número detectado de fotones. En cuanto al tamaño de píxel de la imagen renderizada, 10 nm es un buen punto de partida; establecer este valor demasiado bajo dará lugar a archivos de imagen innecesariamente grandes de puntos de vista sin ampliar.
   5. Haga clic en el botón Render para generar la imagen PALMA. Utilice los iconos +/- de aumento en la barra de herramientas de la ventana de la figura para acercar y alejar.
   6. Opcional: Realice análisis de conglomerados de la imagen PALM reconstruido utilizando la prueba K de Ripley u otros mecanismos como la simulación asistida DBSCAN (SAD) ^23. Nota: En el paquete de palma personalizada, tanto K de Ripley y análisis SAD ya están construidas en; para las coordenadas generadas a partir de otro software, los mismos análisis se pueden realizar con scripts personalizados adicionales.

3. Individual de Seguimiento de la molécula en células vivas

1. Tratar la superficie de cultivo de tejidos y la placa de las células como se describe en el Protocolo 2. Puesto que la temperatura y la o etapa controlada / CO ₂ puede requerir un cierto plato de cultivo, asegurar asegurarse de que el cubreobjetos tiene el grosor adecuado (0,17 mm) para la configuración de la microscopía.
   1. Transfectar células si hacer una expresión transitoria y realizar cualquier tratamiento necesario para el experimento, tal como tetraciclina para inducir la expresión, y se incuba según sea necesario. Esto también es el mismo que se describe en el Protocolo 2.
   2. Coloque la placa de cultivo en una incubadora en el escenario. Deje el plato instalarse en el escenario durante unos minutos hasta que la temperatura y la _{concentración} de CO 2 estabilizar cada vez que después de montar la placa de cultivo o mudarse a una nueva región de interés. Láseres Bloque en este paso. Si CO ₂ de control no está disponible, cambie a un CO ₂ medios de comunicación independientes justo antes de imagen, como Leibovde itz L-15.
      Nota: Se recomienda medio fenol-rojo-libre para el fondo deprimente fluorescencia.
2. Adquirir imágenes como en el Protocolo 2. Sin embargo, establezca un tiempo de exposición adecuada (típicamente 25 a 50 ms para PAmCherry1).
   Nota: La densidad molécula debe ser inferior a la de las células fijadas de modo que las trayectorias se pueden grabar sin solaparse entre sí. Las pocas decenas de moléculas especificadas es típico para una adquisición de 256x256 píxeles en un tamaño de píxel de alrededor de 160 nm. La densidad de potencia de láser 561 nm se ajustó a 0,8 kW / cm ² para mantener una buena relación señal-ruido, mientras que la disminución de la fototoxicidad a las células y el aumento de la longitud media de trayectoria.
3. Procesar las imágenes.
   1. Extraer coordenadas de moléculas individuales con el paquete wfiread como se describe en el Protocolo nº 2, o con otro paquete.
   2. Reconstruir trayectorias de las partículas individuales utilizando diferentes sola partícula de seguimiento de paquetes (SPT) en base a diferentes algoritmos encontradosen otro lugar ^24. Nota: Como alternativa, este paso puede realizarse utilizando casa construida paquete Matlab (posiblemente disponible en futuras revisiones en http://www.ohsu.edu/nan.
   3. Opcional: Después de la reconstrucción, utilice un paquete de SPT ²⁴ para calcular el desplazamiento y difusión constantes de las trayectorias. Además, utilice variacional Bayes seguimiento sola partícula (vbSPT) ²⁵ para determinar los estados de difusión de las proteínas diana. paquete y documentación vbSPT Matlab se pueden encontrar en su página oficial de Sourceforge: http://vbspt.sourceforge.net/.

Resultados

El ejemplo BiFC-PALM mostrado es KRas G12D mutante interactuar con los Ras vinculante dominio (RBD) de FARC (Figura 1). Como se ha discutido, la RN o fragmentos de RC no se marcaron a la C-terminal de Ras, ya que perturbaría la localización de la membrana y por lo tanto la actividad biológica de Ras. Esto reduce las posibles combinaciones de ocho a cuatro (Figura 1B). Cada una de estas cuatro combinaciones se introdujo en células U2OS utilizando la infección lentiviral. Las célula...

Discusión

BiFC ha sido una técnica comúnmente utilizada para la detección y la visualización de los IBP en las células, mientras que PALM es una técnica de microscopía reciente sola molécula de super-resolución que permite formación de imágenes a nanoescala de muestras biológicas intactas. La combinación de BiFC con PALM logra imagen selectiva de los IBP en el interior de una celda con nanómetros resolución espacial y sensibilidad única molécula. BiFC-PALM extiende la utilidad de ambas técnicas, y como se demues...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscope frame	Nikon	Ti-U
60X oil immersion TIRF objective with 1.49 NA	Nikon	CFI Apo TIRF 60x H
EMCCD camera	Andor	iXon Ultra 897
561 nm laser	Opto Engine	MGL-FN-561
405 nm laser	Coherent	CUBE-405 50mW
561 nm dichroic mirror	Semrock	Di01-R405/488/561/635-25x36
561 nm filter	Semrock	FF01-525/45-25
405/561 nm notch filter	Semrock	NF01-405/488/568-25
Temperature and CO2 controlled stage	Tokai Hit	INUBG2ATW-PLAM
pENTR-D-TOPO-PAmCherry1_1-159-MCS	Addgene	60545
pENTR-D-TOPO-PAmCherry160-236-MCS	Addgene	60546
pcDNA3.2-DEST	Life Technologies	12489-019
pLenti-DEST	Addgene		http://www.addgene.org/Eric_Campeau/
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase	Thermo Scientific	F-531
In-Fusion HD Cloning	Clontech	639649
LR Clonase	Life Technologies	11791
Vira Power Lentivirus Packaging	Life Technologies	K497500
X-tremeGENE Transfection Reagent	Roche	13873800
Lab-Tek II Chambered Coverglass	Thermo Scientific	155409	#1.5 glass bottom dishes
U2OS cells	ATCC	HTB-96
293T/17 cells	ATCC	CRL-11268
DMEM with phenol red	Life Technologies	11995
DMEM no phenol red	Life Technologies	21063
Fetal bovine serum	Life Technologies	10082
Leibovit's L-15, no phenol red	Life Technologies	21083-027
Reduced serum medium	Life Technologies	31985
Phosphate Buffered Saline	Life Technologies	14040
Syringe	BD Biosciences	309604
Syringe filter	Millipore	SLHV033RB
Lentiviral concentrator	Clontech	631231
Retroviral concentrator	Clontech	631455
10 cm culture dish	BD Biosciences	353003
6-well culture plate	BD Biosciences	353046
Polybrene	Sigma	107689
Puromycin	Life Technologies	A11138
G-418	Calbiochem	345812	Neomycin
Doxycyline	Fisher	BP2653
Tris base	Fisher	BP152
EDTA	Sigma	EDS
Sodium Hydroxide	Sigma	S5881
Paraformaldehyde	Sigma	158127
Glutaraldehyde	Sigma	G6257
PIPES	Sigma	P6757
HEPES	Sigma	H4034
EGTA	Sigma	3777
Magnesium Sulfate	Sigma	M2643
Potassium Hydroxide	Sigma	221473
Sodium chloride	Fisher	BP358
Magnesium chloride	Fisher	M33
100 nm gold particles	BBI Solutions	EM.GC100
Molecular grade water	Life Technologies	10977
Dpn1	New England Biolabs	R0176
PCR purification kit	Qiagen	28104
Miniprep kit	Qiagen	27104
Midiprep kit	Macherey-Nagel	740410
0.6 ml microcentrifuge tubes	Fisher	05-408-120
1.5 ml microcentrifuge tubes	Fisher	05-408-137
15 ml tubes	Fisher	05-539-12
5 ml polypropylene round-bottom tubes	BD Biosciences	352063
14 ml polypropylene round-bottom tubes	BD Biosciences	352059
50 ml tube	BD Biosciences	352070
PCR tube	GeneMate	C-3328-1
SOC medium	Life Technologies	15544
LB broth	BD Biosciences	244610
Kanamycin sulfate	Fisher	BP906
Competent cells	Life Technologies	C4040
Matlab	Mathworks