Ex Vivo Cultura de polluelo cerebelosos Rebanadas y espacialmente focalizadas Electroporación de gránulos precursores celulares

Resumen

La capa externa del gránulo del cerebelo es el sitio de la amplificación de tránsito más grande en el cerebro en desarrollo. A continuación, presentamos un protocolo para orientar la modificación genética a esta capa en el pico de la proliferación mediante electroporación ex vivo y la cultura de las rebanadas del cerebelo a partir de embriones Día 14 embriones de pollo.

Resumen

La capa externa del gránulo cerebelosa (EGL) es el sitio de la amplificación de tránsito más grande en el cerebro en desarrollo, y un excelente modelo para el estudio de la proliferación y diferenciación neuronal. Además, las modificaciones evolutivas de su capacidad proliferativa han sido responsables de la dramática expansión del tamaño del cerebelo en los amniotas, por lo que el cerebelo un excelente modelo para estudios de evo-devo del cerebro de los vertebrados. Las células que constituyen el EGL, progenitores granulares del cerebelo, también representan una célula importante de origen para el meduloblastoma, el tumor neuronal pediátrica más frecuente. Después de la amplificación de tránsito, los precursores de gránulos migran radialmente en la capa granular interna del cerebelo donde representan la mayor población neuronal en el cerebro mamífero maduro. En polluelo, el pico de la proliferación EGL se produce hacia el final de la segunda semana de gestación. Con el fin de apuntar a la modificación genética a esta capa enel pico de la proliferación, hemos desarrollado un método para la manipulación genética a través ex vivo electroporación de rebanadas cerebelo de embriones Día 14 embriones de pollo. Este método recapitula varios aspectos importantes de desarrollo in vivo de las neuronas gránulo y será útil en la generación de un conocimiento profundo de la proliferación de células granulares del cerebelo y la diferenciación, y por lo tanto del desarrollo del cerebelo, la evolución y la enfermedad.

Introducción

El cerebelo se encuentra en el extremo anterior de la parte posterior del cerebro y es responsable de la integración de procesamiento sensorial y motora en el cerebro madura, así como la regulación de los procesos cognitivos superiores ^1. En los mamíferos y las aves, posee una morfología elaborado y está fuertemente foliada, un producto de la extensa amplificación de tránsito de progenitores durante el desarrollo que produce más de la mitad de las neuronas en el cerebro adulto. El cerebelo ha sido objeto de estudio para los neurobiólogos durante siglos y en la era molecular asimismo ha recibido mucha atención. Esto se refiere no sólo a su biología inherentemente interesante, pero también al hecho de que está fuertemente implicado en la enfermedad humana, incluyendo trastornos genéticos del desarrollo tales como trastornos del espectro autista ^{2 y} lo más prominente que el cáncer cerebelosa, meduloblastoma ^3, que es el cerebro pediátrica más frecuente tumor. Es importante destacar que es un excelente sistema modelo dentro which para estudiar la asignación de destino y la neurogénesis durante el desarrollo cerebral ^4. En los últimos años, también se ha establecido como un sistema modelo para el estudio comparativo del desarrollo del cerebro, debido a la gran diversidad de formas de cerebelo visto a través de la filogenia de los vertebrados ^10.5.

El cerebelo se desarrolla desde el medio dorsal de rhombomere 1 en el cerebro posterior ¹¹ y su desarrollo se compone de dos poblaciones progenitoras primarias, el labio rómbico y la zona ventricular. El labio rómbico se extiende alrededor de la región dorsal del neuroepitelio del cerebro posterior en la frontera con la placa de techo. Es el lugar de nacimiento de las neuronas excitadoras glutamatérgicas del cerebelo ^12.14. La zona ventricular da lugar a las neuronas del cerebelo GABAérgicas inhibitorias, lo más prominente las neuronas de Purkinje grandes ^14,15. Más adelante en el desarrollo (desde aproximadamente el día embrionario 13,5 en el ratón; e6 en chick ^16), Progen glutamatérgicaITORS migran tangencialmente desde el labio rómbico y formar una capa pial de progenitores: una zona progenitor secundaria llamada la capa de gránulos externa (EGL). Es esta capa que sufre la extensa amplificación de tránsito que lleva a la gran cantidad de neuronas granulares se encuentran en el cerebro maduro.

Proliferación en el EGL larga se ha relacionado con la localización sub-pial que resulta de la migración tangencial desde el labio rómbico ^17, con el interruptor de salida del ciclo celular y la diferenciación neuronal de células progenitoras que se asocia con su salida de la capa de EGL exterior hacia el centro EGL ^18. La migración tangencial extensivo de células granulares post-mitótico en el eje medial-lateral se produce en el medio y EGL ^interior 19, antes de la migración radial definitiva en la capa de gránulos interior de la corteza cerebelosa maduro. La migración de células del labio rómbico sobre la superficie cerebelosa es dependiente de la señalización de CXCL12 de la pia ^{20-22 de} Y células granulares expresan el receptor CXCR4 CXCL12. Su migración tangencial es, pues, que recuerda a la de la migración tangencial neocortical poblaciones interneuronas inhibitorias ^23-25. Curiosamente, los estudios de microscopía electrónica ¹⁷ han sugerido que las células EGL con una morfología proliferativa mantienen contacto pial, que une el comportamiento celular con capacidad proliferativa en una forma que recuerda de los progenitores basales de la corteza de mamíferos ^26. Esto se refleja en la estratificación antes mencionado de la EGL en tres subcapas que se definen por ambientes extracelulares distintos y donde los precursores de los gránulos tienen distinta expresión génica signaturas ^18.

Proliferación de los progenitores en el oEGL se produce con una distribución normal de tamaños de clones de tal manera que cuando los progenitores son individualmente marcadas genéticamente al final del desarrollo embrionario en el ratón, dan lugar a un promedio de 250-500 g mediana de postmitoticneuronas ranule ^27,28. Proliferación depende de la señalización de SHH mitogénica de las neuronas de Purkinje subyacente ^29-32. La capacidad de responder a SHH ha demostrado ser totalmente dependiente de la expresión autónoma de células del factor de transcripción Atoh1, tanto in vitro como in vivo ^{33 34,35.} Del mismo modo, salida del ciclo celular y la diferenciación se ha demostrado que dependen de la expresión del factor de transcripción aguas abajo NeuroD1 ^36, que es probable que un represor directa de Atoh1 ^37.

A pesar de este progreso, y un considerable avance en el desciframiento de la base biológica de células de salida del ciclo celular ^{38 a 42,} el mecanismo molecular fundamental (s) que subyacen a la decisión de salir del ciclo celular y la transición de un progenitor a una neurona diferenciación y la la migración tangencial postmitotic asociada en el EGL interior, así como el interruptor de tardea la migración radial, siendo incompleta entendido. Esto es en gran medida debido a la intratabilidad experimental de la EGL: se está desarrollando tarde, y difícil de dirigir genéticamente ya que muchas de las mismas moléculas neurogénicos también son cruciales antes en la vida de los precursores de gránulos en el labio rómbico. Para superar este problema, numerosos autores han desarrollado in vivo y ex vivo electroporación como un método para dirigir el cerebelo postnatal en roedores ^43-48. Aquí, pioneros en el uso de la electroporación ex vivo en chick para estudiar la EGL, que representa considerables ventajas en términos de coste y conveniencia. Nuestro método de electroporación y cultivo ex vivo rebanada de tejido cerebeloso chica utiliza el tejido diseccionado a partir del día embrionario 14 pollitos en el pico de la proliferación de EGL. Este método permite la orientación genética de la EGL independientemente del labio rómbico y será el escenario para la disección genética de la transición del gránuloprogenitoras de neuronas gránulo postmitotic en el cerebelo.

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Protocolo

Nota: Todos los experimentos se realizaron con arreglo a la del Kings College de Londres, Reino Unido y las pautas de cuidado de animales Reino Unido Home Office.

1. Disección de e14 Cerebelo

1. Incubar huevos marrones gallina embrionados a 38 ° C para el día embrionario 14.
2. Con una tijera de huevo decapitan embrión de pollo in ovo y quitar la cabeza a una placa de Petri que contiene el hielo frío PBS (Figura 1).
3. Con unas pinzas estándar, hacer incisiones detrás de cada ojo todo el camino a través del tejido, la eliminación de los ojos y la mandíbula superior. Hacer una segunda incisión todo el camino a través de la faringe retirar la mandíbula inferior (Figura 1B).
4. Con unas pinzas estándar, quitar toda la piel de la superficie del cráneo pelando lejos (Figura 1C) y retirar los huesos frontal y parietal, revelando cerebro.
5. Desde un aspecto ventral, eliminar el cartílago de la faringe y el mesénquima auxiliar.
6. Desde una cara dorsal, cuidadoly eliminar dorsal mesénquima al cerebro posterior teniendo cuidado de no dañar pia, y el cerebro entero separado (Figura 1D).
7. Hacer incisión todo el camino a través del tejido entre el cerebro medio y cerebro posterior y el cerebro posterior separada incluyendo cerebelo (Figura 1E).
8. Al hacer incisiones todo el camino a través del tejido en ambos cruces laterales del cerebelo y la placa alar del cerebro posterior, retire toda cerebelo, teniendo cuidado de mantener la integridad de la pia en toda la disección (Figura 1F). Retire la formación de plexo coroideo (Figura 1G).
9. Mueva el cerebelo diseccionado en hielo frío HBSS.

2. Cortar Cultura de e14 Cerebelo

1. Transferir todo el cerebelo a la plataforma estéril de un tejido Chopper usando una espátula o una pipeta Pasteur 3 ml con la punta cortada para ensanchar la abertura. Retire el exceso de líquido con una pipeta.
2. Cortar toda cerebelo todo en tque requiere orientación a 300 micras de espesor usando el cortador de tejidos ajuste a una velocidad de corte a 50% del máximo. La integridad del tejido es más fácil de conserva en corte sagital; Sin embargo, la orientación es también una consideración importante para el análisis de células (células de Purkinje dendritas se sagitalmente alineados, mientras que los axones de células granulares corren transversalmente, perpendicular al plano de las dendritas células de Purkinje).
3. Utilizando una pipeta Pasteur de 3 ml, cubra el cerebelo en rodajas en el hielo frío HBSS.
4. Transfiera las rebanadas en HBSS a una placa de Petri de 60 mm que contiene hielo frío fresco HBSS usando una pipeta Pasteur 3 ml con punta de corte.
5. Bajo un microscopio de disección iluminado con una fuente de luz de fibra óptica, que exista una separación de las rebanadas individuales utilizando fórceps relojero. Identificar las rebanadas que se electroporación, basada en su integridad del tejido y la posición medio-lateral.
   Nota: Cada disección del embrión a través de cortar la incubación en medio de cultivo tarda alrededor de 10 a 20 minutos dependiendo upoexperiencia n. Realizar disecciones uno a la vez para asegurar que cerebella pasar cantidad mínima de tiempo entre decapitación y cultivo ex vivo.

3. La electroporación de Slices

1. Construir una cámara de electroporación mediante la fijación del ánodo de un electroporador a la base de un 60 mm placa de Petri con cinta aislante. Añadir aproximadamente 1 ml de HBSS para cubrir el electrodo.
2. Coloque un inserto de 0,4 micras cultura en la parte superior del electrodo cubierto en HBSS. Deje que el inserto de la cultura para descansar en el electrodo asegurándose de que no siempre es el contacto entre el inserto y el electrodo.
   Nota: En esta configuración, el inserto de cultivo con las rodajas descansará sobre la superficie de la solución, manteniendo el circuito pero permitiendo la orientación espacial del cátodo.
3. Rebanadas identificados transferencia (hasta cinco por la cultura de inserción) sobre inserto de cultivo utilizando 3 ml pipeta Pasteur con la punta de corte. Separar y dejar reposar en inserto de cultivo en un sagittorientación al.
4. Con una pipeta, eliminar el exceso de HBSS para que las rebanadas ya no son bañados en solución.
5. Utilizando una punta de pipeta P10, el ADN de la pipeta (a una concentración de 1 g / l) diluido con 20% verde rápido sobre la superficie de la región de orientación de una rebanada. 20% verde rápido asegura solución de ADN viscoso y evita prohibitivamente amplia dispersión de ADN. Añadir aproximadamente 5 ADN l / solución verde rápido para cada sector (Figura 2B).
6. Coloque el cátodo sobre tejido objetivo deseado y electroporar con 3 x 10 V, 10 pulsos mseg de duración. Evitar el contacto directo del cátodo con el tejido. En lugar de ello, se aprovechan de la tensión superficial del líquido para mantener la conductancia (colocar el cátodo tan cerca del tejido como sea posible sin tocar realmente el tejido).
7. Repita la entrega de ADN y la electroporación a múltiples regiones de EGL en cada rebanada cerebelosa individuo si lo deseas.
8. Al término de la electroporación, inse cultura transferenciart a 30 mm placa de Petri.
9. Para cada cultivo, añadir 1 ml de medio de cultivo precalentado (medio basal de Eagle, 0,5% (w / v) D - (+) - glucosa, 1% de suplemento de B27, 2 mM L-glutamina, 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina) por debajo de la inserción de cultivo de tal manera que el inserto de cultivo está en contacto con el medio, pero rodajas no se bañan en ella.
10. Incubar los cultivos a 37 ° C / 6% de CO ₂ durante un máximo de 3 días. Reemplace todo el medio de cultivo cada 24 hr con medio precalentado fresco.
11. A raíz de la cultura, fijar las rebanadas en la cultura inserta durante 1 hora en paraformaldehído al 4% (o O / N a 4 ° C) en un nuevo plato de 30 mm sin medios de cultivo.

4. Obtención de imágenes de cerebelosos Rebanadas

1. Después de la fijación, lavar rebanadas 3 veces durante 5 min en PBS.
2. El uso de una hoja de afeitar, diseccionar cada rebanada cerebelosa electroporación y culta de la inserción del cultivo cortando alrededor de la porción y la eliminación de la división y la región de inserción que se adhiere a. HacerNo intente extraer la rebanada de la superficie de inserción del cultivo.
3. Mount rodajas de aproximadamente 1 ml de medio de montaje que contiene DAPI (si se desea) bajo un cubreobjetos con cuidado de no introducir burbujas, y la imagen mediante escaneo láser microscopía confocal.
   Nota: los parámetros de imagen se pueden variar de acuerdo con las construcciones de electroporación, y a discreción del usuario individual.

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Resultados

En esta sección se ilustra ejemplos de los resultados que se pueden obtener mediante electroporación y la cultura del cerebelo rebanada de embriones Día 14 pollitos. La disección del cerebelo se ilustra en la Figura 1 y la cámara de electroporación establecido se muestra en la Figura 2. Se demuestra que es posible para electroporar y con éxito rebanadas cerebelares de cultivo, que retienen su estructura y morfolog...

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Discusión

El protocolo informó aquí describe un método para la disección, la electroporación y cultivo de rebanadas de embrionario Día 14 cerebelo del polluelo. Este protocolo permite la focalización de electroporación para pequeñas regiones focales de la EGL, incluyendo aislados focalización de los lóbulos del cerebelo individuales. Permite el análisis genético y de imagen en alta resolución y conveniencia, ya un bajo costo en comparación con las técnicas establecidas en roedores ^43-47. Este análisis ...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
McIlwain tissue chopper	Mickle Laboratory Engineering Ltd		Cut at 300 μm for best results.
Basal Medium Eagle (Gibco)	Life Technologies	41010-026
L-glutamine	Sigma	G7513
penicillin/streptomycin	Sigma	P4333
0.4 μm culture insert	Millipore	PICM0RG50
TSS20 Ovodyne electroporator	Intracel	01-916-02	Use 3 x 10 V, 10 msec pulses for electroporation.