Construcción de Engineered Definido Humanos cardíacos tejidos para estudiar los mecanismos de la terapia celular cardiaca

Resumen

This manuscript describes the creation of defined engineered cardiac tissues using surface marker expression and cell sorting. The defined tissues can then be used in a multi-tissue bioreactor to investigate mechanisms of cardiac cell therapy in order to provide a functional, yet controlled, model system of the human heart.

Resumen

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that replicate the biofidelity of three-dimensional native human myocardium, while also enabling a controlled level of biological complexity, and allowing non-destructive longitudinal monitoring of tissue contractile function. Initially, human engineered cardiac tissues (hECT) were created using the entire cell population obtained from directed differentiation of human pluripotent stem cells, which typically yielded less than 50% cardiomyocytes. However, to create reliable predictive models of human myocardium, and to elucidate mechanisms of heterocellular interaction, it is essential to accurately control the biological composition in engineered tissues.

To address this limitation, we utilize live cell sorting for the cardiac surface marker SIRPα and the fibroblast marker CD90 to create tissues containing a 3:1 ratio of these cell types, respectively, that are then mixed together and added to a collagen-based matrix solution. Resulting hECTs are, thus, completely defined in both their cellular and extracellular matrix composition.

Here we describe the construction of defined hECTs as a model system to understand mechanisms of cell-cell interactions in cell therapies, using an example of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSC) that are currently being used in human clinical trials. The defined tissue composition is imperative to understand how the hMSCs may be interacting with the endogenous cardiac cell types to enhance tissue function. A bioreactor system is also described that simultaneously cultures six hECTs in parallel, permitting more efficient use of the cells after sorting.

Introducción

Ingeniería de tejido cardiaco ha avanzado considerablemente en la última década, con múltiples grupos editoriales resultados de tejidos totalmente funcionales, superando confeccionada con cardiomiocitos murinos ^1-6 y, más recientemente, los miocitos cardíacos derivados de células madre humanas ^7-12. El campo de la ingeniería de tejido cardiaco se debe a dos objetivos primarios y esencialmente independientes entre sí: 1) para desarrollar injertos exógenos que pueden trasplantarse en su defecto corazones para mejorar la función ^4-6; y 2) el desarrollo de modelos in vitro para el estudio de la fisiología y la enfermedad, o como instrumentos de evaluación para el desarrollo terapéutico ^2,7.

Tridimensional (3-D) de cultivo celular se considera esencial para el desarrollo de herramientas de detección de próxima generación, como la matriz 3-D refleja un microambiente cardiaca más natural que la cultura tradicional monocapa de células 2-D; de hecho, algunos aspectos de la biología celular son fundamentalmente diferentes en 2-D culturas vs. 3-D ^13,14 . Además, los tejidos cardíacos ingeniería se construyen a partir de componentes completamente definidas: una matriz extracelular, y una población de células. Para los tejidos cardíacos humanos de ingeniería tradicionales, mientras que la composición de la matriz extracelular (por lo general de fibrina o colágeno ^{9 7,8,10)} está estrictamente controlada, la composición celda de entrada no está bien definido, con toda la mezcla de células a partir de una diferenciación cardiaca dirigido de cualquiera células madre embrionarias (ESC ^7,9) o células madre pluripotentes inducidas (IPSC ^10,12) que se añaden a los tejidos. Dependiendo de la línea celular específica y la eficiencia del protocolo de diferenciación se utiliza, el porcentaje resultante de los cardiomiocitos puede variar desde menos de 25% a más del 90%, el fenotipo de cardiomiocitos específico (es decir, ventricular-, atrial-, o similar al marcapasos) también puede variar, aunque la fracción no cardiomiocitos puede ser muy heterogéneo ^15,16 y alterar la madurez de la m cardiaca diferenciadayocytes ^17.

Recientes trabajos de ingeniería de tejido cardiaco ha intentado controlar la población de entrada de las células, ya sea con una superficie de la línea de células madre embrionarias humanas reportero cardiaca ⁸ o ¹⁸ células marcadores se utiliza para aislar el componente de los cardiomiocitos de la diferenciación. Aunque en un principio un tejido compuesto de sólo miocitos cardíacos parece ser el ideal, esto es, de hecho, no es el caso; hECTs compuestas únicamente de los miocitos cardíacos no pueden compactar en tejidos funcionales, con algunos grupos encontrar una relación 3: 1 de los miocitos cardíacos: fibroblastos producir la más alta fuerza de contracción ^8. Mediante el uso de diferentes métodos de selección de células, incluyendo marcadores de la superficie para la clasificación de células en vivo, es posible crear hECTs con poblaciones de células definidas. Mientras que los marcadores de las células del estroma no cardíacas han estado disponibles durante algún tiempo, tal como el marcador de fibroblastos putativo CD90 ^19,20, marcadores de superficie de los miocitos cardíacos han sido más difícilesidentificar. SIRPα estaba entre los primeros marcadores de superficie cardíacos identificados para los miocitos cardiacos humanos ¹⁸ y se ha demostrado ser altamente selectivo para el linaje cardiaco. Recientemente, hemos encontrado que la doble clasificación para SIRPα ⁺ y CD90 ^- células rendimientos cardiomiocitos casi puros, con el CD90 ⁺ de la población que presenta un fenotipo similar a fibroblastos (Josowitz, observaciones no publicadas). Sobre la base de estos hallazgos recogidos, Aquí se describe la creación de hECTs utilizando una mezcla 3: 1 de combinación SIRPα ⁺ / CD90 ^- cardiomiocitos y fibroblastos CD90 ^+.

La capacidad de diseñar un tejido cardiaco humano completamente definido es esencial no sólo para la creación de herramientas de detección sólidas, sino también para el desarrollo de sistemas modelo para investigar por células emergentes y las terapias basadas en genes cardiacos. En particular, numerosas terapias con células para la insuficiencia cardíaca, utilizando tipos de células incluyendo las células madre mesenquimales (MSC) ²¹ , las células madre cardiacas ²² y las células mononucleares de médula ósea ^23-25, se han probado en ensayos clínicos. Mientras que muchos de los resultados iniciales han sido prometedores ^21,23,25, el beneficio inicial con frecuencia disminuye con el tiempo ^26-29. Una tendencia similar se ha reportado en los tejidos cardiacos murinos ingeniería, que muestran un beneficio funcional significativa debido a la suplementación MSC, pero el beneficio no se mantiene durante el cultivo a largo plazo ^1. Subyace el rendimiento subóptimo es nuestro conocimiento limitado de los mecanismos que regulan las terapias celulares. Una comprensión más profunda de cómo las células terapéutica ejercer su influencia beneficiosa, así como las posibles consecuencias negativas de las interacciones de los miocitos-nonmyocyte, permitiría el desarrollo de mejores terapias produciendo beneficios clínicamente significativos y sostenidos, con efectos secundarios mínimos, para los pacientes con insuficiencia cardíaca.

A continuación, describimos el uso de hECTs definidos para interrogcomió mecanismos de terapia basada en células. La composición del tejido controlada es esencial para identificar los factores específicos que afectan el rendimiento de los cardiomiocitos. Directamente complementar hECTs con el tipo de célula terapéutico de interés (por ejemplo, MSC), puede revelar los efectos sobre el rendimiento de miocitos cardiacos, como hemos demostrado en el ECTS rata ^1.

El siguiente protocolo multi-paso comienza con la diferenciación de células madre cardiaca dirigida, seguido por la fabricación del biorreactor multi-tejido, y concluyendo con una descripción de la construcción de tejidos y análisis funcional. Nuestros experimentos se realizaron con la línea de células madre de embriones humanos aprobados por el NIH H7 (células madre). Sin embargo, los siguientes protocolos también se han probado utilizando una línea de células madre adicionales y tres líneas de célula madre pluripotente inducida (hiPSC) con resultados similares. Hemos encontrado que la eficiencia en la diferenciación de los cardiomiocitos y el éxito en Hect fabricación puede ser línea celular dependiente, particularmente folíneas r hiPSC derivadas de pacientes individuales. Siguiendo este protocolo, dos placas de 6 pocillos se sembraron con un total de 1,68 millones de hESCs (140.000 células por pocillo), que produce aproximadamente 2,5 millones de miocitos después de la diferenciación durante 20 días y clasificación, lo suficiente como para hacer seis tejidos definidos.

Protocolo

Nota: Realice todas las manipulaciones celulares en condiciones asépticas utilizando una cabina de seguridad biológica con filtro HEPA de clase II y esterilizar todas las soluciones filtrando a través de un filtro de 0,2 micras. Realizar creación de tejidos y pruebas de función, ya sea en las mismas condiciones asépticas o una campana de flujo laminar.

1. Siembra de hESCs H7 en preparación para la diferenciación cardiaca

1. (Día 1) Preparación de la membrana basal para la matriz
   1. Descongelar 150 l alícuota de la matriz de la membrana basal cualificado células madre en el hielo durante la noche a 4 ° C.
2. (Día 0-4) Revestimiento de hESCs sobre placas recubiertas
   1. Diluir la matriz descongelado en 12 ml de helado de DMEM / F12 y mezclar bien.
   2. Transferir 1 ml de la solución / F12-matriz de DMEM en cada pocillo de una placa de cultivo tisular de 6 pocillos tratada. Cada alícuota de la matriz de la capa es posible que dos placas de 6 pocillos.
   3. Se incuban las placas recubiertas a temperatura ambiente durante al menos 1 hora.
      Nota: Ennuestra experiencia, placas revestidas sellados con parafina se puede almacenar en solución de matriz a 4 ° C durante un máximo de 10 días antes de su uso.
   4. En aproximadamente 75% de confluencia, disociar el H7 hESCs de la placa de 10 cm usando 6 ml del reactivo de disociación no enzimática. Después de 5 min, raspar suavemente las células de la superficie de cultivo usando un rascador de células desechable y transferir la suspensión celular a un tubo de centrífuga de 15 ml estéril.
   5. Retirar 0,5 ml de la solución de disociación con las células desde el tubo de 15 ml y la transferencia a un nuevo tubo estéril ml 15 (dejando 5,5 ml del reactivo de disociación de disociar aún más la hESCs) para la propagación de la línea de células madre.
   6. Se precipitan los 0,5 ml de células a 300 xg durante 5 min a 20 ° C. Eliminar el sobrenadante y resuspender suavemente en 8 ml de medio de células madre pluripotentes que contiene penicilina-estreptomicina al 1% y luego transferir a una nueva, recubiertas, 10 cm placa de cultivo tisular y mantener 37 ° C y 5% de CO ₂ para mantener la línea de células madre.
      Nota: Mantenga los medios de células madre pluripotentes en hielo durante los cambios de los medios de comunicación.
   7. Mientras tanto, añadir 5,5 l de 10 mM inhibidor ROCA Y-27632 de la solución restante 5,5 ml de la disociación y continuar incubar a temperatura ambiente durante otros 5 a 10 min. Mezclar suavemente las células con una pipeta serológica de 5 ml. Continuar incubar hasta que se consigue una suspensión de células, entonces sedimentar las células a 300 xg durante 5 min a temperatura ambiente.
   8. Resuspender las células en 5 ml de medio de células madre pluripotentes y realizar un recuento de células usando un hemocitómetro.
   9. Seed cada pocillo de la placa de 6 pocillos a una densidad de 140.000 células por pocillo. Seed dos placas de 6 pocillos para crear un total de seis tejidos definidos. Disponer de cualquier resto de las células después de la siembra.
   10. Llenar los bien a 1 ml con medios de células madre pluripotentes y se incuba a 37 ° C, 5% de CO _2. Veinticuatro horas más tarde, saque la tarjeta y añadir 2 ml de medio de células madre pluripotentes fresca a cada pocillo (Figura 1A ).
   11. Compruebe la confluencia de las placas de cada día y comenzar la diferenciación una vez que las células alcanzan aproximadamente el 75% de confluencia (Figura 1B - D).

2. (día 4-24) diferenciación de células madre embrionarias humanas a cardiomiocitos ^30,31

1. (Día 4-7, 0-3 Diferenciación Día) mesodermo Inducción
   1. Preparar RPMI medio de diferenciación I (Tabla 1) mediante la combinación de 500 ml RPMI 1640 con 10 ml de suplemento B27 (sin insulina) y 5 ml de la solución madre de penicilina-estreptomicina (10.000 IU / ml de penicilina; 10.000 g / ml de estreptomicina). Alícuota, en el hielo, en tubos de 50 ml y se almacena a 4 ° C.
   2. (Día 4, Diferenciación Día 0) Preparar los medios de inducción del mesodermo mediante la adición de 2,4 l de la CHIR99021 pequeña molécula inhibidora de GSK3 (madre 10 mM, 6 mM de concentración final) a 12 ml de medio RPMI diferenciación I. Quitar medio de células madre pluripotentes de cada pocillo unnd sustituir con 2 ml de los medios de inducción del mesodermo por pocillo. Devolver la placa a la incubadora.
      Nota: la muerte celular significativa se produce normalmente con la adición de CHIR99021 (Figura 1E). La monocapa se recuperará, pero es importante para enjuagar las células muertas de la distancia con el enjuague DMEM / F12.
   3. (Día 5, diferenciación Día 1) preparar los medios de inducción del mesodermo fresco como se describe anteriormente. Eliminar los viejos medios de cada pocillo y se lava una vez con 1 ml de DMEM / F12 por pocillo. Añadir 2 ml de medio de inducción mesodermo fresco a cada pocillo.
      Nota: Enjuague de cada día desde el día 0 hasta 10 aumenta en gran medida el rendimiento y la pureza de los miocitos cardíacos.
   4. (Día 6, Diferenciación Día 2) Eliminar los medios de inducción cardíacos y enjuagar una vez con 1 ml de DMEM / F12 por pocillo. Vuelva a colocar el enjuague con 2 ml de RPMI medio de diferenciación I (no hay moléculas pequeñas añadido, pero aún con la B27 (sin insulina suplemento)) y volver a la incubadora.
2. (Día 7-13, Diferenciación Day 3-10) mesodermo cardíaco Inducción
   1. (Día 7, Día Diferenciación 3) Preparar los medios de inducción del mesodermo cardíaco mediante la adición de 6 l de la pequeña molécula inhibidor de Wnt-1 IWR (madre 10 mM, 5 mM final) a 12 ml de RPMI medio de diferenciación I.
   2. Retire el medio de cada pocillo, se lava una vez con 1 ml de DMEM / F12 por pocillo y reemplazar con 2 ml de medio de inducción del mesodermo cardíaco por pocillo.
   3. (Día 8 de Diferenciación día 4) Preparar un adicional de 12 ml de medio de inducción del mesodermo cardíaco como se ha descrito anteriormente. Eliminar los medios de comunicación añadió el día anterior, se lava una vez con 1 ml de DMEM / F12 por pocillo y se reemplaza con 2 ml de medio de diferenciación del mesodermo cardíaco fresco por pocillo y volver a la incubadora.
   4. (Día 9-10, Diferenciación Día 5-6) En ambos días, retire los medios de inducción del mesodermo cardíaco y enjuagar cada pocillo con 1 ml de DMEM / F12.
   5. Añadir 2 ml de RPMI fresco medio de diferenciación I (no hay moléculas pequeñas añadieron pero aún con la B27 (sin insulina) suplemento)a cada pocillo y la placa de volver a la incubadora.
3. (Día 11-24, Diferenciación Día 7-20) derivado de HES cardiaca Organización de los miocitos / Maduración
   1. Preparar el RPMI medio de diferenciación II (Tabla 1) mediante la combinación de 500 ml RPMI 1640 con 10 ml de suplemento B27 (con insulina) y 5 ml de la solución madre de penicilina-estreptomicina. Alícuota, en el hielo, en tubos de 50 ml y se almacena a 4 ° C.
   2. (Día 11, Día Diferenciación 7) Retire medio de diferenciación RPMI (sin insulina) de cada pocillo y enjuague con 1 ml de DMEM / F12. Reemplazar con 2 ml de los nuevos medios de diferenciación RPMI II (con insulina) a cada pocillo y volver a la incubadora.
      Nota: latido espontáneo primero debe observarse entre los días 7 y 10. Si golpeo no se observa durante este tiempo, por lo general indica una pobre eficiencia de diferenciación. El protocolo puede ser continuado hasta el día 15 en un esfuerzo por observar que late, pero si hay golpeo se observó el día 15 lo mejor es steres una nueva diferenciación.
   3. (Día 12-24, Diferenciación Día 8-20) Todos los días, quitar los viejos medios de diferenciación y reemplazar con 2 ml de RPMI medio de diferenciación II por pozo para permitir la maduración de las células y la organización de la monocapa de golpeo (Figura 1F, Video Figura 1 ).
      Nota: Dependiendo de la muerte celular residual, puede ser necesario enjuagar con 1 ml de DMEM / F12 hasta el día 10 de diferenciación.

3. (Día 24, Día Diferenciación 20) El aislamiento de miocitos cardíacos y células similares a fibroblastos

1. Disociar celdas de la monocapa
   1. Retire el medio de diferenciación y se lava una vez con 1 ml de PBS.
   2. Disociar las monocapas con 1 ml de la solución de disociación enzimática (0,04% de tripsina / 0,03% de EDTA) a cada pocillo.
   3. Mueva la placa en la incubadora durante 10 minutos. Mientras tanto, añadir 12 l de inhibidor de Rock a 6 ml de solución de tripsina neutralización.
   4. GenTLY Agregar 1 ml de la solución de tripsina de neutralización que contiene el inhibidor de la roca para cada pocillo de la placa para neutralizar la solución de tripsina.
   5. Con una pipeta de transferencia estéril, mezclar suavemente cada pocillo para separar los grupos de células.
   6. Transferir los 12 ml de la placa de 6 pocillos a un tubo de centrífuga de 15 ml.
      Nota: Puesto que dos placas de 6 pocillos se utilizan en este protocolo, se necesitarán dos tubos de 15 ml.
   7. Transferencia de 3 ml de PBS a un pocillo de la placa, y luego transferir secuencialmente los mismos 3 ml a cada pocillo subsiguiente para recoger las células residuales en el plato. La transferencia de los restantes 3 ml de la final bien en el mismo tubo de centrífuga de 15 ml que contiene las células.
   8. Pellet a 300 xg durante 5 min a 4 ° C.
2. Preparar las células para la clasificación de células en vivo por FACS
   1. Preparar el tampón de tinción mediante la adición de 5 ml de suero bovino fetal a 45 ml de PBS en hielo con 50 l de inhibidor de la roca.
   2. Eliminar el sobrenadante de la pel celulardejar que (en 3.1.8) y se vuelve a suspender en 1,2 ml de tampón de tinción.
   3. Transferir 200 l de la suspensión celular a un nuevo, pre-refrigerado, 50 ml tubo de centrífuga en hielo. Este será el control de la tinción negativa.
   4. Transferir el restante 1 ml de suspensión celular a un nuevo, pre-refrigerado, 50 ml tubo de centrífuga en hielo y añadir 2 l SIRPα-PE / Cy7 (dilución 1: 500) y 4 l de CD90-FITC (dilución 1: 250) . Mezclar suavemente la suspensión de células con una pipeta de transferencia y volver al hielo.
   5. Incubar tanto el control negativo y la muestra, en un agitador de eje de balancín, en hielo, a 4 ° C durante 1 hr.
   6. Preparar tubos de recogida de muestras mediante la adición de 3 ml de medio RPMI (con insulina) a dos tubos de centrífuga de 15 ml. Añadir 3 l de inhibidor de roca para cada tubo y almacenar en hielo.
   7. Sedimentar las células teñidas a 300 xg durante 5 min a 4 ° C y enjuagar dos veces con al menos 10 ml de PBS enfriado con hielo por enjuague.
   8. Añadir 1 l de DAPI (1 mg / ml) a 5 ml de tampón de tinción. Suavementeresuspender el precipitado muestra con 1-3 ml del tampón de tinción que contiene DAPI-utilizando una pipeta de transferencia.
   9. Añadir 500 l de tampón de tinción (sin DAPI añadido) con el control negativo.
   10. filtrado suavemente tanto el control negativo y la muestra a través de un filtro de 40 micras de células para eliminar grupos de células y transferir al poliestireno tubos FACS en hielo. Inmediatamente traer muestras a la clasificación de células.
   11. Similares a células vivas establecido métodos de clasificación ^18, use el control negativo para ajustar las puertas, seleccionar las células vivas (DAPI negativo) y recogen tanto el FITC ⁺ (es decir, CD90 ⁺ fibroblastos) y PE Cy7 ⁺ (es decir, SIRPα ⁺ cardiomiocitos / ) las poblaciones de forma independiente a 20 psi (Figura 2).
       Nota: Después de ajustar las puertas, el control negativo puede ser fijado en el 4% PFA para determinar la eficiencia de la diferenciación mediante la tinción de troponina T cardiaca.
       Nota: Algunos investigadores prefieren utilizar unacontrol de isotipo en lugar del control sin teñir para ajustar las puertas a fin de compensar por la unión de anticuerpo no específica. Un control de llamada de fluorescencia menos uno (FMO) es otra posibilidad. Debido a la clara distribución bimodal de las señales de PE-Cy7 FITC, y DAPI, que GaTeD de la población positiva, de manera conservadora que apunta lejos en la puerta positiva, lo que posiblemente excluye algunos verdaderos positivos, pero ayuda a minimizar los falsos positivos.
3. Reagrupamiento de células en preparación para la Ingeniería de Tejidos
   1. Después de que el tipo de células, Pellet ambos tubos de recogida y volver a suspender en 1 ml de DMEM que contiene 10% de suero bovino neonatal, 1% de penicilina-estreptomicina y 0,2% de anfotericina B ( "medios NBS").
   2. Recombinar la SIRPα ⁺ y células CD90 ⁺ en una proporción de 3: 1 y la placa de las células combinadas en una cultura no tejido tratado placa de Petri a una densidad de 2 millones de células por 60 cm ² (10 cm plato). Añadir 10 ml de medios del NBS y 101; l de inhibidor ROCA Y-27632.
   3. Coloque suspensión de células en la incubadora de cultivo de tejidos durante 48 horas para permitir la reagregación de células en pequeños clusters.

4. Ingeniería de Tejidos Humanos cardiaca

1. Fabricar el biorreactor Multi-tejido
   Nota: Para complementar las ilustraciones de la figura 3A, archivos CAD con esquemas de diseño de biorreactores detallada están disponibles bajo petición de los autores.
   1. Máquina del molde maestro PDMS mediante la perforación de seis agujeros uniformemente espaciados de 0,5 mm de diámetro en un 9 x 33 x 3,25 mm paralelepípedo de politetrafluoroetileno.
   2. El uso de una fresa radial, máquina de un fotograma de polisulfona de 25 x 35 x 11 mm ^3. El propósito de la trama es mantener los puestos de PDMS (construidas a partir del fundido hecho anteriormente) en alineación con los pozos de la placa de base.
   3. El uso de un 1 mm de fresa radial, máquina de 6 pocillos (6 x 1 x 1 mm ^3), 4 mm de separación, en un 20 x 40 x 5 mm ³ pieza de poli negrotetrafluoroetileno para formar la placa de base.
   4. Mezclar la base elastomérica y agente de curado para el polidimetilsiloxano (PDMS) en un 10: 1 w / w proporción y añadir al molde politetrafluoroetileno personalizado (etapa 4.1.1) para crear dos filas de seis puestos de detección de fuerza, y se incuba durante la noche y bajo vacío a 80 ° C. Después del curado, retire con cuidado el PDMS del molde principal y marque cuidadosamente la parte superior de cada poste con un marcador permanente negro para mejorar el contraste y automatizado de seguimiento posterior de desviación en tiempo real.
      Nota: politetrafluoretileno es bastante suave y se puede dañar fácilmente. Tenga cuidado al limpiar el molde maestro antes de PDMS fundición para garantizar la longevidad del sistema y la geometría palo PDMS consistente. Un alambre de 0,5 mm se puede usar para limpiar los orificios de los mensajes después de cada uso, pero tenga cuidado de no raspar el interior de los agujeros.
      Nota: Una alternativa es para desgasificar los PDMS bajo vacío durante varias horas a temperatura ambiente, a continuación, dejar que la cura mezcla a presión ambiente.Esto puede dar lugar a un menor número de burbujas de gas residual que se forman en el PDMS durante el proceso de curado.
   5. Esterilizar todos los componentes en un autoclave de vapor.
      Nota: El molde de PDMS maestra (paso 4.1.1) y el marco de polisulfona (paso 4.1.2) son tanto reutilizable. Los mensajes creados a partir de PDMS del molde (paso 4.1.4) también es reutilizable pero sólo durante unos 10 usos. Sin embargo, más puestos de PDMS se pueden crear como sea necesario con el molde maestro.
2. Recoger las células cardiacas reagregadas
   1. Eliminar las células reagregadas de la incubadora y transferir los 10 ml de los medios de comunicación reagregación a un tubo de centrífuga de 50 ml.
   2. Aclarar la placa con 3 ml de PBS y transferir el enjuague a la misma 50 ml tubo de centrífuga que contiene los medios de comunicación reagregación.
   3. Añadir 3 ml de 0,04% de tripsina / 0,03% de EDTA a la placa de 10 cm y volver a la incubadora durante 5 min.
   4. Después de 5 minutos, examinar la placa con un microscopio compuesto invertida en un aumento de 10X para asegurar dissocia celular completala de la placa. Si algunos grupos residuales todavía están unidos, agitar suavemente la placa para separar los grumos. Si los grupos permanecen unidos, volver a la incubadora durante otros 2-3 minutos. No incubar más de diez minutos o muerte celular significativa puede ocurrir.
   5. Una vez se separan todas las células, añadir 3 ml de solución de tripsina de neutralización. Mezclar suavemente la solución de neutralización con la solución de células con tripsina y traslado al tubo de centrífuga de 50 ml que contiene los medios de reagrupamiento y se lava una vez con PBS.
   6. Enjuague el plato entero con 5 ml de PBS y transferir al mismo tubo 50 ml que contiene las células.
   7. Sedimentar las células a 300 xg durante 5 min a temperatura ambiente.
   8. Eliminar el sobrenadante y resuspender el sedimento en 1 ml de medio de NBS, a continuación, transferir a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
   9. Se precipitan a 300 xg durante 5 min a temperatura ambiente y eliminar el sobrenadante. Las células cardíacas (células CD90 ⁺ estroma y SIRPα ⁺ MYOCytes) ahora están listos para la construcción de tejido.
3. (Opcional) recoger células Suplementarios de interés
   Nota: Además de los tejidos definidos que contienen sólo SIRPα ⁺ cardiomiocitos y células similares a fibroblastos CD90 ^+, es posible añadir las células de interés adicionales para interrogar a su efecto sobre la función del tejido. Por ejemplo MSC de rata se ha demostrado para mejorar la función de los tejidos cardiacos de rata ingeniería ^1. El siguiente paso opcional describe la colección de células suplementarios para el sistema definido.
   1. Recoger el tipo de célula suplementaria de interés (por ejemplo, células madre mesenquimales) usando 0,25% de tripsina / 0,1% de EDTA.
   2. Sedimentar las células a 300 xg durante 5 min a temperatura ambiente y después volver a suspender en 5 ml de medio de cultivo celular adecuado para el tipo de célula de interés. Por ejemplo, para las MSC, utilice DMEM suplementado con suero bovino fetal 20%, 1% de penicilina-estreptomicina y 0,2% anfotericina-B a la cultura de la cells.
   3. Realizar un recuento de células usando un hemocitómetro, entonces sedimentar las células de nuevo a 300 xg durante 5 min a temperatura ambiente.
   4. Eliminar el sobrenadante, resuspender en 1 ml de medio de cultivo celular y transferir a un tubo de 1.5 ml.
   5. Sedimentar las células a 300 xg durante 5 min a temperatura ambiente.
   6. Eliminar el sobrenadante. Las células suplementarios ya están listos para la construcción de tejido.
      Nota: si se añaden las células suplementarios a una concentración de 10% del número total de células en el tejido, a continuación, para los tejidos definidos, esto requerirá 50.000 células suplementarios por el tejido, ya que cada tejido contiene 500.000 células cardíacas (tanto las células del estroma CD90 ⁺ y miocitos SIRPα ^+).
4. Crear las Engineered cardíacos Tejidos Humanos
   Nota: Almacenar todas las soluciones en el hielo y las células a temperatura ambiente. Todos los volúmenes que aparecen abajo son por el tejido. Típicamente, aproximadamente seis tejidos pueden construirse a partir de dos de 6 pocillos plAtes de diferenciaciones cardíacas.
   1. Diluir 60,0 l de la 5 mg / ml de stock de colágeno a 3,125 mg / ml con 1,5 l de NaOH 1 M, 9,6 l de 10x PBS y 24,9 l de agua desionizada ultrapura estéril.
      paso crítico: evitar la introducción de burbujas de aire para cada solución durante la preparación como burbujas de aire interrumpir la formación de tejido adecuada.
   2. Añadir 12,0 l de 10x tanto MEM y 0,2 N HEPES pH 9 a la mezcla de colágeno diluido para crear la mezcla de colágeno. Añadir las dos soluciones por el lado del tubo de centrífuga de 15 ml con el fin de evitar la introducción de burbujas de aire en la mezcla de colágeno.
   3. Añadir la matriz de la membrana basal a una concentración final de 0,9 mg / ml a la mezcla de colágeno y almacenar en hielo para crear la mezcla final de tejido. La concentración final de colágeno debe ser de 2 mg / ml.
   4. Añadir 500.000 de las células reagregadas a la mezcla tejido (concentración de fibroblastos miocitos + es de 20 millones / ml) y rellenar hasta un volumen final de 25 l portejido, ya sea con medios NBS libres de células o 50.000 células del tipo de célula suplementaria de interés (por ejemplo, las hMSC) y mezclar bien para formar una suspensión celular uniforme.
      Nota: El número de células suplementadas variará de para diferentes aplicaciones. Aquí se utiliza la administración de suplementos 10%.
   5. Con cuidado, pipeta de 25 l de la suspensión celular en cada uno de los seis pozos de la placa de base biorreactor, sin introducir burbujas de aire en el pozo.
   6. Empuje dos filas de los sensores de fuerza PDMS en cada lado del bastidor de polisulfona, formando 6 pares de postes opuestos, a continuación, invertir el marco en la parte superior de la placa de base de modo que un par de postes entra en cada pocillo que contiene la suspensión celular.
      Nota: El marco de polisulfona incluye pestañas para ayudar en la alineación de los PDMS.
   7. Con cuidado, coloque el biorreactor, placa de base hacia abajo, en una placa de 60 mm, a continuación la cápsula sin su cubierta interior de una placa de 10 cm, coloque la cubierta de 10 cm en la parte superior, y mover todo el conjunto en biorreactora la incubadora de cultivo de tejidos, a la espera de dos horas para el tejido de gel.
   8. Después de 2 horas, retire el biorreactor de la incubadora y añadir 14 ml de medio de NBS a todo el conjunto, lo suficiente para cubrir la placa de base. Volver a la incubadora, y cambiar la mitad de los medios de comunicación todos los días.
   9. Cuarenta y ocho horas más tarde, retire con cuidado la base moviendo suavemente cada lado de la placa base fuera del marco de unos pocos milímetros a la vez, cambiar los medios de comunicación, a continuación, devolver el biorreactor, tejidos hacia abajo, a los medios de comunicación.
   10. Continuar el cambio medio de los medios de cultivo de NBS cada día.
       Nota: Las contracciones espontáneas de los tejidos pueden ser observados a los 3 días después de la construcción del tejido, generando fuerzas de contracción medibles ya en el día 5 a 7.

Resultados

Para obtener los miocitos cardíacos, una versión ligeramente modificada de los métodos de diferenciación Boheler y Lian se utiliza ^30,31. Es imperativo que la diferenciación se inicia durante el registro de la fase de crecimiento celular, sino también que la población inicial es suficientemente confluente para obtener un número utilizable de las células después de la clasificación (aproximadamente 75% es óptimo). Típicamente, para H7 hESCs, placas a una densidad de 140.000 hESCs por pocillo de un...

Discusión

Construcción de tejidos humanos definidos por ingeniería cardíacas (hect) puede proporcionar un modelo más consistente y fiable de la función de los cardiomiocitos humanos. Fundamentalmente, todos los componentes celulares y extracelulares en el sistema son conocidos y se pueden manipular como se desee, eliminando así la influencia de confusión de otros tipos de células desconocidos que resultan del proceso de diferenciación. Para equilibrar el crecimiento celular rápido y de alto rendimiento, es preferible qu...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell Culture	Company	Catalog Number	Comments
Amphotericin B	Sigma-Aldrich	A2411	Prepare a 2.5 mg/ml stock in DMSO and filter-sterilize
B27 with Insulin	Life Technologies	17505055
B27 without Insulin	Life Technologies	A1895601
CHIR99021	Stemgent	04-0004	Create 6 μM stock, then aliquot and store at -20 °C.
Essential 8 Media	Life Technologies	A1517001
H7 Human Embryonic Stem Cells	WiCell	WA07
hESC Qualified Matrix, Corning Matrigel	Corning	354277	Thaw on ice at 4 °C overnight then aliquot 150 μl into separate tubes and store at -20 °C.
IWR-1	Sigma-Aldrich	I0161	Create 10 mM stock and aliquot. Store at -20 °C
Neonatal Calf Serum	Life Technologies	16010159
Non-enzymatic Dissociation Reagent: Gentle Cell Dissociation Reagent	Stem Cell Technologies	7174
Penicillin-Streptomycin	Corning	30-002-CI
RPMI 1640	Life Technologies	11875-093	Keep refrigerated
Y-27632 (ROCK Inhibitor)	Stemgent	04-0012	Resuspend to a 10 mM stock concentration, aliquot and store at -20 °C. Avoid freeze thaw cycles.
Cell Sorting	Company	Catalog Number	Comments
4’,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI)	Life Technologies	D1306
CD90-FITC	BioLegend	328107
Enzymatic Dissociation Reagent: Cell Detach Kit I (0.04 % Trypsin/ 0.03% EDTA, Trypsin neutralization solution and Hanks Buffered Salt Solution)	PromoCell	C-41200
Fetal Bovine Serum	Atlanta Biologics	S11250
SIRPα-PE/Cy7	BioLegend	323807
Tissue Construction	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin/0.1% EDTA	Fisher Scientific	25-053-CI	Optional: For collection of supplemental cells of interest
10x MEM	Sigma-Aldrich	M0275-100ML
10x PBS Packets	Sigma-Aldrich	P3813
Collagen, Bovine Type I	Life Technologies	A10644-01	Keep on ice
DMEM/F12	Life Technologies	11330057
Dulbecco’s Modified Eagles Medium (DMEM), High Glucose	Sigma-Aldrich	D5648
Polydimethylsiloxane (PDMS)	Dow Corning	Sylgard 184
Sodium HEPES	Sigma-Aldrich	H3784
Sodium Hydroxide	Sigma-Aldrich	221465
Materials	Company	Catalog Number	Comments
1.5 ml microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	NC0536757
15 ml polyproylene centrifuge tube	Corning	352096
5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube	Corning	352235	With integrated 35 μm cell strainer
50 ml polyproylene centrifuge tube	Corning	352070
6-well flat bottom tissue-culture treated plate	Corning	353046
Cell Scraper, Disposable	Biologix	70-2180
Polysulfone	McMaster-Carr
Polytetrafluoroethylene (Teflon)	McMaster-Carr
Equipment	Company	Catalog Number	Comments
Dissecting Microscope	Olympus	SZ-61	Or similar, must have a mount for the high speed camera to attach
Electrical Pacing System	Astro-Med, Inc	Grass S88X Stimulator
High Speed Camera	Pixelink	PL-B741U	Or similar, but must be capable of 100 frames per second for accurate data acquisition
Plate Temperature Control			Used to maintain media temperature during data acqusition.
Custom Materials	Company	Catalog Number	Comments
LabView Post-tracking Program			available upon request from the authors