El seguimiento y cuantificación de los procesos de desarrollo en<em&gt; C. elegans</em&gt; Uso de las herramientas de código abierto

Resumen

Here it is shown how to track and quantify developmental processes in C. elegans. The methods presented are based on open-source tools that can be easily implemented. It is demonstrated how to reconstruct 3D cell-shape models, how to manually track subcellular structures, and how to analyze cortical contractile flow.

Resumen

Cuantitativamente capturar los procesos de desarrollo es crucial para derivar modelos mecanicistas y clave para identificar y describir los fenotipos mutantes. Aquí se presentan los protocolos para la preparación de los embriones y de adultos C. elegans animales para microscopía de lapso de tiempo corto y largo plazo y los métodos para el seguimiento y cuantificación de los procesos de desarrollo. Los métodos presentados se basan en C. cepas disponibles desde el Caenorhabditis Centro de Genética y en software de código abierto elegans que se pueden implementar fácilmente en cualquier laboratorio independiente del sistema de microscopía utilizado. Una reconstrucción de un modelo de células en forma de 3D usando el IMOD software de modelado, seguimiento manual de las estructuras subcelulares marcadas con fluorescencia utilizando el polivalente programa de análisis de imágenes Endrov, y un análisis de flujo contráctil cortical usando PIVlab (Resuelta en el Tiempo Digital por imágenes de partículas Velocimetría Herramienta para MATLAB) se muestran. Se discute cómo estos métodos también se pueden implementar to cuantitativamente capturar otros procesos de desarrollo en diferentes modelos, por ejemplo, el seguimiento de la célula y del linaje de rastreo, seguimiento del flujo de vesículas.

Introducción

Con las mejoras constantes de las proteínas fluorescentes, la ingeniería del genoma, microscopía óptica y soft y hardware, ahora es posible grabar el desarrollo de muchos organismos modelo con resolución espacio-temporal sin precedentes. Esto permite a los investigadores hacen preguntas que no podían ser abordadas con anterioridad o para revisitar los procesos de desarrollo conocidos con el fin de buscar los aspectos pasados ​​por alto. Este progreso ha despertado el campo de la biología del desarrollo cuantitativo, cuyo objetivo es la transformación de los modelos cualitativos e informales en los modelos cuantitativos mediante mediciones exhaustivas y análisis estadísticos.

Seguimiento células y estructuras subcelulares ha hecho posible obtener modelos cuantitativos del desarrollo embrionario, la actividad del sistema nervioso, o división celular ^1-12. Mediante el seguimiento de los restos de la división celular durante el desarrollo temprano de la C. elegans embrión, podríamos recientemente revelan que siguen un estéreoruta escrito y constituyen importantes factores de polarización ^13,14.

Aquí, los protocolos se presentan que hacen biología cuantitativa del desarrollo se acerca accesible para los no expertos. La atención se centra en tres herramientas recta hacia adelante, libremente disponibles que son implementables en cualquier laboratorio que tiene acceso a la microscopía confocal estándar y computadoras. Estos incluyen un protocolo para generar formas de células en 3D, un protocolo para realizar un seguimiento de los restos de la división celular, y un protocolo para describir cuantitativamente la dinámica actomyosin corticales. El nematodo C. elegans se utiliza como un caso ejemplar, sin embargo, los métodos y herramientas descritos aquí son adecuados para una variedad de preguntas en otros modelos biológicos, por ejemplo, células cultivadas, explantes de tejido, organoides o esferoides, otros embriones, etc.

En general, algunos de los análisis que se muestran aquí también se puede realizar con el popular herramienta ImageJ código abierto (http://imagej.nih.gov/ij/docs/index.html; o FIJI, las "baterías incluidas" versión de ImageJ, http://fiji.sc/Fiji) para los que se dispone de muchos plugins para diferentes análisis cuantitativos. Sin embargo, los programas aquí descritos están diseñados para hacer frente a problemas específicos.

En primer lugar, IMOD, el procesamiento de imágenes, el modelado y la suite de pantalla puede ser utilizado para reconstrucciones en 3D de secciones seriadas de electrones o microscopía de luz ^15. IMOD también contiene herramientas para la visualización de los datos 3D a partir de cualquier orientación. En segundo lugar, Endrov, un programa Java diseñado para realizar análisis de imágenes, procesamiento de datos, y la anotación de las redes o pistas (entre otros) sobre la base de una arquitectura de plugin extendida, con ImageJ compatibilidad plug-in ^16. Contiene más de 140 operaciones de procesamiento de imágenes y una interfaz de usuario extensible en el que el modelo y los datos brutos se muestran por separado. Su código fuente se puede encontrar en https://github.com/mahogny/Endrov. En tercer lugar, PIVlab, un MHerramienta MATLAB para partículas digital de imagen velocimetría que permite al usuario analizar cuantitativa y cualitativamente campos de flujo de partículas ^17. El uso de estos programas requiere una licencia de MATLAB que incluye la Imagen Processing Toolbox (http://mathworks.com). PIVlab es un programa diseñado para describir cuantitativamente el flujo. Se calcula la distribución de velocidad, magnitud, vorticidad, divergencia o cizalla dentro de pares de imágenes o series. Para esto, es cruzada correlaciona áreas pequeñas de las imágenes (llamados 'pases' en la sección de protocolo) de un par de imágenes para derivar el desplazamiento de partículas más probable. Esta correlación cruzada se obtiene una matriz de correlación que se puede analizar en el dominio del espacio o de la frecuencia usando cualquiera de correlación cruzada directo o una transformación rápida de Fourier (FFT), respectivamente.

El equipo utilizado aquí es un microscopio invertido equipado con un Nipkow ('hilar') del disco, un EMCCD, 488 y 561 nm sólido-estándarláseres de estado, y 20x o 40x o aire 60x / plan apochromat objetivos inmersión en aceite o agua. Sin embargo, también es posible realizar formación de imágenes de lapso de tiempo con otras modalidades de imagen, por ejemplo, punto-, de línea o microscopía de barrido de hoja basado en láser, microscopía multi-fotón, así como microscopía de epi-fluorescencia combinado con deconvolución o estructurada iluminación. La ventaja de usar un sistema de disco de Nipkow es la adquisición de imágenes extremadamente rápido, especialmente si un modo de transmisión (movimiento continuo y de exploración del objeto en la dimensión z) está disponible. Además, para mejorar la resolución, un extensor de aumento 1,5 veces en la parte delantera de la EMCCD se puede utilizar.

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Protocolo

1. Preparación de C. elegans embriones para Microscopía Time-lapse usando Microbeads

1. Transferencia gusanos adultos grávidas mediante el uso de un pick gusano (alambre de platino) en una gota de tampón M9 y limpiar las bacterias por primera agitando vigorosamente y luego transferir cada gusano a una caída adyacente de M9 utilizando un latigazo del ojo montado en un / punta de la pipeta selección del diente o utilizar un capilar de vidrio con punta.
2. Se diluye la dispersión que contiene las 20 micras perlas de poliestireno de diámetro 10 veces en tampón de M9 (1 L de tampón M9 contiene 3 g KH ₂ PO _4, 6 g de Na ₂ HPO _4, 5 g de NaCl, y, después de tratamiento en autoclave (20 min, 120 ° C), añadir un adicional de 1 ml de una solución 1 M _MgSO4).
3. Hacer una pipeta de boca de cualquier tipo de capilar de vidrio delgado (por ejemplo, el derretimiento de los capilares de punto o capilares utilizados para tirar de agujas de inyección), una más o menos 0,5 m de largo pedazo de caucho, silicona o tubería material similar (lo ideal es transparente), unos 200 lpunta de la pipeta, la tapa de un tubo de PCR 200 l, un filtro hidrófobo para jeringas pequeñas (por ejemplo., un 0,2 hasta 0,45 micras de tamaño de poro y de 15-50 mm de diámetro de nylon, PTFE o un filtro de material similar) de punta, y una pipeta de 1.000 l . Este tipo de boca pipeta asegura que ningún material biológico puede ponerse en contacto con el experimentador.
4. Montar la pipeta mediante la inserción de la punta de pipeta 200 l con la punta primero en el tubo y conectarlo con la tapa de un tubo de PCR que tiene una perforación central que coincide con el diámetro del capilar utilizado. Una aguja punzón o preparación muy puntiaguda se puede utilizar para generar la perforación.
5. Dibuja un capilar fino y la inserta en la perforación. Colocar el filtro en el otro extremo del tubo e insertar una punta de pipeta 1.000 l como pieza de la boca (Figura 1).
6. Diseccionar adultos grávidas cortando transversalmente gusanos en la vulva con una hoja de afeitar limpia o escalpelo.
   NOTA: Por lo general, muchos embriones serán correoxpulsed después del corte. Sin embargo, si se necesitan embriones tempranos, que a veces tienen que ser liberado de la canal mediante un latigazo del ojo de la aguja o punta.
7. Pipetear una gota de la dispersión diluida perla de poliestireno (~ 4 l) sobre un vidrio de cubierta 24x60 mm y embriones de transferencia en esta caída usando la pipeta de boca.
8. Con cuidado, coloque una pequeña (por ejemplo, 18x18 o 20x20 mm) cubierta de cristal en la parte superior de la gota y asegúrese de que la caída se ha extendido totalmente fuera.
   NOTA: La caída también debe ser lo suficientemente pequeño como para no tocar los bordes de la pequeña cubierta de vidrio.
9. Selle el montaje con vaselina licuado. Añadir una gota de aceite de inmersión en el lado de deslizamiento mm cubierta de 24x60 y proceder a la sección 'Time-lapse microscopía'.

2. Preparación de adulto C. elegans Animales de Microscopía Time-lapse usando nanobeads

NOTA: En general, el protocolo para el montaje de los animales adultos es una adaptación del protocolo de ref. 18.Con este protocolo, es posible llevar a cabo la microscopía confocal de lapso de tiempo a largo plazo de los animales adultos.

1. Preparar un 1,5% (w / v) solución de agarosa en tampón M9, hervir (1 min, 100 ° C en baño de agua o en el microondas). No se recomienda el uso de concentraciones más altas de agarosa ya que esto puede conducir a la extrusión del intestino y / o partes de la gónada.
2. Pegue abajo 2-3 capas de cinta en dos portaobjetos cada uno. Coloque una diapositiva sin cinta entre las dos diapositivas con cinta.
3. Utilice una punta de pipeta y colocar una gota de la solución de agarosa caliente en el centro de la diapositiva medio. Colocar rápidamente otra diapositiva a la caída de manera que con el apoyo de las capas de cinta en cada lado. Esto creará una ronda y la almohadilla de agar plana de alrededor de 10 mm de diámetro.
4. Ponga una gota de solución de bolas 100 nm (sin diluir, que es 2,6% (w / v)) en la almohadilla. Traslado 1-10 gusanos adultos limpiados en la gota con un pico gusano. Selle con 18x18 mm cubierta de vidrio y de vaselina como se explica en Protocol 1.

Microscopía 3. Time-lapse

1. Ponga una gota de aceite de inmersión sobre el portaobjetos de microscopio o el sándwich de vidrio de cobertura. Use campo claro a bajo aumento (5x o 10x lentes) para localizar la muestra.
   NOTA: Limite la exposición a la luz azul tanto como sea posible (en particular para C. elegans embriones), por ejemplo, no utilice la microscopía epifluorescencia para encontrar / enfocar la muestra pero el uso de campo claro en su lugar.
2. Cambie a mayor aumento (40x o 60x objetivos), llevar la muestra en el foco (ya sea plano central o superior / inferior planos de la muestra, en función del software de adquisición).
3. Establecer los intervalos de muestreo a 30 aviones en 1 m distancia registran cada 1 min. En caso de que una etapa xyz xy o automatizado está disponible, múltiples manchas se pueden grabar en una sesión. Cambie a imágenes de fluorescencia y comprobar de nuevo el enfoque.
   NOTA: Trate de evitar el uso de poderes alta láser, en lugar utilizar tiempos de exposición más largos ligeramentea intensidades muy bajas. Medida adquirió imágenes de inmediato, ya sea en el programa de adquisición de la imagen o en ImageJ para evitar la saturación, que cultivos varían las dinámicas y significa también la exposición excesiva a la radiación.
4. Comience a grabar la serie de lapso de tiempo.
   NOTA: Para excluir el análisis de artefactos, comience con largos intervalos (10/03 min) tiempo entre la exploración de la muestra y aumentar gradualmente muestreo temporal de los intervalos deseados. Calendario de desarrollo, así como puntos finales en ambos casos deben ser similares cuando se realiza un análisis estadístico. Por otra parte, a menudo es necesario para evaluar las tasas de supervivencia y fototoxicidad. Por lo tanto, recuperar la muestra desde el monte después de la microscopía de lapso de tiempo a largo plazo y comprobar si continúan desarrollando / live.

4. La reconstrucción de un modelo celular de la forma 3D con IMOD

NOTA: El software IMOD está disponible en la página Web IMOD: http://bio3d.colorado.edu/imod/. La instalación del software es describird allí. Cuando se utiliza el sistema operativo Windows, un conjunto de herramientas de Unix tiene que ser instalado, que también se puede encontrar como un paquete en la página web IMOD. Por otra parte, hay una introducción 3dmod excelente compilado disponible en la página web IMOD (http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/3dmodguide.html).

1. Abra el shell de Unix y escriba "imod". La ventana IMOD se abrirá. Seleccione el archivo con los datos en bruto (lo ideal sería un tif apilados o similar) desde el que generar un modelo 3D.
2. Busque la parte inferior y superior de los objetos en la ventana de Zap utilizando la ventana de información (arriba y abajo herramienta de desplazamiento).
3. Comience trazando las líneas celulares. Es importante destacar que, asegúrese de que cada célula es un objeto. Comience con el plano superior de cada célula y crear el primer contorno allí utilizando la ventana de información. Desplácese hacia abajo en z y crear un nuevo contorno para cada plano z.
4. Haga lo mismo con la mayor cantidad de células, según sea necesario para modelar en 3D. No te olvides de crear un nuevo objeto cuando se parte de una nueva célula.
   norteNOTA: Hay muchas maneras diferentes para el seguimiento de contorno y varios plugins votos. Por favor, visite la página web IMOD y tutoriales en línea para obtener más información. En el caso que se muestra aquí, la configuración predeterminada se ha utilizado.
5. Abra el "Model View" de la ventana para inspeccionar los objetos y sus contornos.
6. En el "Model View" barra de herramientas seleccione "Edit" - "Objetos". La ventana de edición correspondiente se abrirá.
7. Para modelar células como objetos llenos y cerrados, elija "Mesh" como "Draw Tipo de datos" y "relleno" como "estilo del dibujo". Haga clic en "roces" en la selección de desplazamiento en la parte inferior izquierda de la ventana. Compruebe el "Cap" opción en la selección en la parte inferior derecha. Compruebe tantos objetos como sea necesario y haga clic en "Mesh todos". El programa generará objetos sólidos de las pilas de contornos. El factor z-muestreo se puede ajustar cambiando "Z-escala" en la "Vista" de la ventana.
8. Mover / girar el obje 3Dt ("Edit" - "Ver") y guardar instantáneas o películas ("Archivo" - "Snap Tiff como ..." o "Película / Montaje").

5. Seguimiento fluorescencia estructuras etiquetadas con Endrov

NOTA: Con el fin de realizar un seguimiento de los restos de la división celular, utilizar una cepa con un marcador de membrana nuclear o plasma para la identificación de célula (por ejemplo, H2B, PH-PLC-d1) y un marcador remanente división celular (por ejemplo, NMY-2, ZEN-4 ). El marcador de membrana nuclear o plasma es importante para determinar qué celda hereda el remanente de la división celular.

1. Para una carga rápida y facilidad de uso, los datos en bruto tiene que ser convertido a un archivo TIFF (por ejemplo, en ImageJ). A continuación, abra Endrov y cargar el archivo a ser analizados por la elección de la opción "Cargar archivo" en el menú archivo. Haga clic en el icono de "visor 2D" en la barra de herramientas.
2. Ajuste del histograma haciendo clic en el icono de "gama Fit" (el icono azul en la esquina inferior derechade la pantalla Endrov). Ajuste el XYZ resolución por ir a "Datos" - "Nombre de archivo" - "ImageSet" - "Canal" - "Establecer XYZ-resolución". Llene en los valores para X, Y, y Z, por ejemplo, 5, 5, 1 si X e Y resolución es de 0,2 micras y muestra cada 1 m en Z.
3. Para anotar los núcleos, pasar al plano de interés y haga clic en "visor 2D". Seleccione "Lineage" en el menú desplegable y seleccione "Nueva linaje".
4. Al hacer clic y arrastrar en el núcleo, que puede estar marcado. Para nombrar el núcleo, haga clic derecho y elegir la opción "Cambiar el nombre de partículas" en el menú desplegable. Para aumentar o disminuir el diámetro del círculo, arrastre el icono de la flecha que aparece a la izquierda del círculo marcado. Para marcar el plano central del núcleo, haga clic en el icono de la derecha. Cuando se utiliza un marcador de membrana de plasma, una gran esfera se puede extraer que cubrirá la mayor parte de la célula.
5. Para continuar en el tiempo y el plano, elija el "Marco" y "Z"opciones en la barra de herramientas inferior. Después de pasar al siguiente punto del tiempo, ajustar la posición o el tamaño del círculo que marca el núcleo en consecuencia. Repita esto hasta que la célula se divide rastreados.
6. Cuando hay una división celular, marcar los núcleos hijos y cambiar a "espectador Lineage". Esto se puede seleccionar haciendo clic en el icono de "Windows" en la barra de herramientas superior. Marcar todos los tres núcleos simultáneamente, ir a la opción "Lineage" en la barra de herramientas superior y seleccione "padre Asociado".
7. Cuando se termina el seguimiento celular, cambiará al canal que marca el resto de la división celular para el seguimiento. Para cambiar de canal, haga clic en el nombre del archivo en la esquina inferior izquierda de la barra de herramientas. El remanente de la división celular (o cualquier otra estructura) pueden ser rastreados como se ha descrito anteriormente para el núcleo.
8. Al regresar al software después de cerrar, hay que ir a "Visor 2D" - "Lineage" - "Editar" y hacer clic en el número de linaje que se editará.

6. Analizar cortical Flujo Actomiosina con PIVlab

NOTA: PIVlab es un software disponible gratuitamente en: http://pivlab.blogspot.de/; puede ser invocado desde el entorno de línea de comandos del Matlab tecleando PIVlab_GUI. Cuando se trabaja con PIVlab, se recomienda guardar la serie de imágenes en una carpeta separada.

1. Iniciar una nueva sesión del menú "Archivo". Cargue los archivos de imagen haciendo clic en el botón "Cargar imágenes".
2. Seleccione el estilo de secuenciación 1-2, 2-3, ... y navegue hasta el directorio que contiene la secuencia de las imágenes deseadas. Seleccione las imágenes y haga clic en el botón "Agregar" y de importación.
3. Ir a "Configuración de Análisis" y seleccione "Exclusiones (ROI, Máscara)". Como alternativa, presione la tecla "Ctrl + E". Utilice el botón "Draw máscara (s) para el marco actual" para desactivar la parte no deseada de la imagen / s (es decir, la zona de las afueras de embriones).
4. Seleccione "Configuración de PIV" from el menú "Ajustes de Análisis". Como alternativa, presione la tecla "Ctrl + S". Seleccione la opción "ventana FFT deformación" como el algoritmo PIV deseado.
   NOTA: la transformación rápida de Fourier (FFT) reduce el coste computacional pero sólo se recomienda la señal es muy por encima de ruido y si el desplazamiento de las partículas estudiadas no exceda de la mitad del área pase analizado (véase 6.5).
5. Introduzca los siguientes valores para los tres pasos, que son la zona de interrogación para la correlación cruzada de intensidad entre las imágenes siguientes: Pase 1: Interrogación área de 64 píxeles con un paso de 32. Pass 2: Interrogación superficie de 32 píxeles con un paso de 16 . Seleccione "lineal" de la deformación de la ventana del menú desplegable. Elija el método 2 * 3 puntos de Gauss para el desplazamiento de estimación sub-pixel.
6. Seleccione "Analizar!" desde el menú Análisis y utilice el botón "Analizar todos los marcos" para comenzar un análisis.
7. Para el procesamiento posterior seleccione "validación vector" de "; Menú y establecer el umbral de filtro de desviación estándar (DESVEST) a 7 y se aplican a todos los marcos Publicar procesamiento ".
8. Elija "Derivar parámetros / modificar datos" en el menú "Plot". Seleccione "Vectors [px / marco]" en el menú desplegable. Ajuste la suavidad de vectores y filtro de paso alto y se aplican a todas las tramas.
9. Para calcular los vectores de medias de todos los marcos, establezca los "marcos de segunda mano" a 1: final y haga clic en el botón "Calcular vectores medios".

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Resultados

Mediante el uso de protocolos de 2, 3 y 4, time-lapse de las gónadas de tipo salvaje C. elegans adultos se realiza (OD58 cepa (UNC-119 (ed3) III; ltIs38 [PAA1; pastel-1 :: GFP :: PH (PLC1delta1) + UNC-119 (+)]), que expresa un marcador de membrana de un promotor de la línea germinal ). Centrándose en el turno de la gónada, un modelo 3D de las células germinales se genera a partir de los datos de microscopía (Figura 2). Este modelo permite analizar los cambios en el tamaño celular, mientr...

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Discusión

A través de seguimiento de objetos en el desarrollo, en particular, de seguimiento nuclear, ha sido posible dilucidar los mecanismos centrales de modelado de C. elegans embriogénesis ^1,23,24. Ampliando esta estrategia para un mayor rendimiento, ha sido recientemente posible descubrir reglas de modelado adicionales y proponer un método de cómo deducir patrones gobierna de novo ^10. Para muchos mutantes, sin embargo, los defectos de modelado precisas son todavía desconocidos. Lo...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stereo microscope	Motic/VWR	OT4005S	Stereo microscope for dissection and mounting
Polybead Polystyrene Microspheres,	Polysciences	18329	Embryo mounting
20 µm
Polybead Polystyrene Microspheres,	Polysciences	876	Adult animal mounting
0.1 µm
Microscope slides	VWR	631-0902	Adult animal mounting
Cover glass 18x18 mm	VWR	631-1331	Embryo/adult mounting
Cover glass 24x60 mm	VWR	631-1339	Embryo mounting
Scalpel	VWR	233-5455	Embryo dissection
Silicone tubing	VWR	228-1501	Tubing for mouth pipette
30 mm PTFE membrane filter	NeoLab	Jul-01	Filter for mouth pipette
Capillary tubes	VWR	621-0003	Pipette tip for mouth pipette
Vaseline	Roth	E746.1	Embryo/adult mounting
Agar	Roth	5210.5	Adult animal mounting
Potassium-di-hydrogenphosphate	Roth	P018.2	M9 buffer
Di-sodium- hydrogenphosphate	Roth	P030.2	M9 buffer
Sodium chloride	Roth	3957.1	M9 buffer
VisiScope Spinning Disc Confocal System	Visitron Systems	n/a	Confocal microscopy