Un método rápido para el procesamiento de sangre para aumentar el rendimiento de los niveles plasmáticos de péptido en la sangre humana

Resumen

El método de transformación rápida de sangre se puede utilizar en los seres humanos y los rendimientos más altos niveles de péptidos, así como permite la evaluación de la forma molecular correcto. Por lo tanto, este método será una herramienta valiosa en la investigación de péptidos.

Resumen

La investigación en el campo de la regulación de la ingesta de alimentos está ganando importancia. Esto a menudo incluye la medición de péptidos que regulan la ingesta de alimentos. Para la correcta determinación de la concentración de un péptido, debería ser estable durante el procesamiento de sangre. Sin embargo, este no es el caso para varios péptidos que se degradan rápidamente por peptidasas endógenas. Recientemente, hemos desarrollado un método de procesamiento de la sangre empleando temperaturas R relucida, cidification A, P rotease inhibición, que sotopic controles exógenos y ilution D (RAPID) para el uso en ratas. Aquí, hemos establecido esta técnica para el uso en seres humanos y se investigó la recuperación, forma molecular y haciendo circular la concentración de las hormonas reguladoras de consumo de alimentos. El método RAPID mejoró significativamente la recuperación de ¹²⁵ somatostatina-28 (+ 39%) marcado con I, péptido similar al glucagón-1 (+ 35%), la grelina de acilo y glucagón (+ 32%), la insulina y kisspectina (+ 29% ), nesfatin-1 (+ 28%), la leptina(+ 21%) y el péptido YY _3-36 (+ 19%) en comparación con el procesamiento estándar (sangre con EDTA en hielo, p <0,001). cromatografía de líquidos de alto rendimiento mostró que la elución de la grelina acilo endógeno en la posición esperada después de un procesamiento rápido, mientras que después del procesamiento estándar 62% de la grelina acilo se degrada lo que resulta en un pico anterior probable que representa la grelina desacil. Después de un rápido procesamiento de la relación de la grelina acilo / desacil en la sangre de los sujetos de peso normal fue de 1: 3 en comparación con 01:23, tras su transformación estándar (p = 0,03). También los niveles endógenos Kisspeptina fueron mayores después de RAPID en comparación con el procesamiento estándar (+ 99%, p = 0,02). El método de procesamiento de sangre RAPID se puede utilizar en los seres humanos, produce niveles de péptido más altas y permite la evaluación de la forma molecular correcta.

Introducción

A la luz de la creciente prevalencia de la obesidad en todo el mundo ^1,2, la investigación en el campo de la regulación de la ingesta de alimentos está ganando importancia. Mientras que se conoce hasta ahora sólo un péptido que se produce en la periferia y de acción central para estimular la ingesta de alimentos, a saber, la grelina ^3, dentro de las últimas décadas, una amplia gama de péptidos se ha identificado que reducen la ingesta de alimentos, por ejemplo. la leptina, el péptido YY (PYY) y también péptido similar al glucagón-1 (GLP-1) y la insulina ^4, Por lo tanto, en los estudios que investigan los mecanismos de regulación de los niveles de hambre y de péptidos de saciedad a menudo se evalúa y, al mismo tiempo, se supone que el péptido estudiado es estable y se recuperó en altos rendimientos durante la formación de plasma. Sin embargo, muy a menudo esto no es el caso debido a la rápida descomposición endógena como se muestra antes de para, por ejemplo. grelina que se degrada de acilo a desacil grelina ^5. Por lo tanto, hemos descrito recientemente el método rápido para elaboración de sangrecantar en ratas que emplean temperaturas R relucida, cidification A, P rotease inhibición, que sotopic controles exógenos y ilution D ^6. Este método mejoró la recuperación para 11 de 12 péptidos ensayados y permitidos para la determinación de la forma molecular de circulación correcta en comparación con el procesamiento de sangre estándar (sangre EDTA en hielo) ^6. Este método se ha utilizado en varios estudios posteriores ^7-12 para la detección de circulación de la grelina, así como factor de ¹³ de liberación de corticotropina. Por lo tanto, el método ha demostrado ser útil para la investigación de péptidos en los roedores. Sin embargo, ya que los estudios de roedores no son siempre traducible a otra especie, el método debe ser establecido para el uso en la sangre humana también.

El objetivo del presente estudio fue probar el método rápido para el procesamiento de sangre en los seres humanos en comparación con el estándar de procesamiento de la sangre, la sangre EDTA sobre hielo, que es ampliamente recomendado y con frecuencia u ¹⁴sed en el ámbito clínico, así como la investigación. Hemos probado la recuperación de una selección de ¹²⁵ péptidos marcados-I que participan en la regulación de la ingesta de alimentos incluyendo péptidos establecidos, así como nuevos candidatos recientemente propuesto para desempeñar un papel en la alimentación de regulación (efectos sobre la ingesta de alimentos se muestran en la Tabla 1) tras su procesamiento con ambos métodos. Las hormonas también fueron elegidos para representar péptidos de diferente longitud y carga (Tabla 2). Por otra parte, para la grelina se investigó la forma molecular (s) siguiendo el método estándar y rápida. Por último, se evaluó la grelina endógena (acilo y grelina desacil), así como los niveles de Kisspeptina, un péptido también sugerido recientemente que desempeñar un papel en la regulación de la ingesta de alimentos ^15,16 tras un procesamiento rápido o estándar. Además, también se investigó estos niveles de péptidos en una población de sujetos con una amplia gama de índice de masa corporal (que va de 10.2-67.6 kg / m ²⁾ para estudiar possibLe diferencias relacionadas con el peso corporal alterada crónicamente.

Diagnóstico, evaluación, y el Plan:
Los participantes del estudio
Todos los participantes del estudio fueron pacientes recientemente hospitalizados (inclusión fue dentro de los dos días de ingreso en el hospital) de la División de Medicina Psicosomática en la Charité-Universidad de Berlín y dieron su consentimiento informado por escrito. Para evitar cualquier impacto de género sólo se incluyeron pacientes de sexo femenino. Un total de 42 sujetos participaron en este estudio y se dividieron en tres grupos: peso normal (IMC de 18,5-25 kg / m ^2, n = 12), la anorexia nerviosa (IMC <17,5 kg / m ^2, n = 15) y obesidad (IMC> 30 kg / m ^2, n = 15). Anoréxica y los pacientes eran obesosdiagnosticados de acuerdo con la Clasificación Internacional de Enfermedades-10 y hospitalizados por el aumento de peso (anorexia nerviosa) o la reducción de peso (obesidad), respectivamente. Todos los pacientes con peso normal fueron hospitalizados exclusivamente debido a los síntomas somáticos sin trastornos somáticos relevantes. Se excluyeron los pacientes con síntomas gastrointestinales somatomorfos o con antecedentes de cirugía gastrointestinal. Los criterios de exclusión abarcaron también una edad <18 años, embarazo actual y las enfermedades psicóticas no tratados. La recogida de sangre se realizó el día 2 o 3 después de la admisión hospitalaria antes de recibir tratamiento dietético con el fin de aumentar o reducir el peso corporal, respectivamente. parámetros antropométricos fueron evaluados en el mismo día.

Protocolo

El protocolo fue aprobado por el comité de ética local para la investigación humana (número de protocolo EA1 / 114/10).

Procesamiento 1. Sangre

1. Recoger la sangre venosa 07:00-08 a.m. después del ayuno nocturno de una vena del antebrazo y el procedimiento de acuerdo con el procedimiento estándar o el método RAPID. Instruir a los sujetos que no ejercicio o fumar antes de la extracción de sangre.
2. Para el procesamiento estándar, recoger la sangre en tubos que contenían EDTA y se centrifuga refrigerada a menos de 10 min a 3.000 xg durante 10 min a 4 ° C. Se recoge el sobrenadante y mantener a -80 ° C hasta su posterior procesamiento por radioinmunoensayo.
3. Para el procesamiento de RAPID, diluir inmediatamente sangre (a menos de 1 min después de la retirada de la sangre) 01:10 en tampón enfriado con hielo (pH 3,6) que contiene acetato de amonio 0,1 M, 0,5 M NaCl e inhibidores de enzimas (diprotina A, E-64-d, antipaína , leupeptina, quimostatina, 1 mg / ml). A continuación, se centrifuga dentro de 10 min a 3.000 xg durante 10 min a 4 ° C y recoger nos sobrenadanteing una pipeta en tubos de polipropileno como se detalla anteriormente en ratas ^6.
   1. cartuchos de cromatografía de carga (360 mg, 55 a 105 micras) con 100% de acetonitrilo (tasa de 10 ml / min), se equilibran con 0,1% de trifluoroacetato (TFA, la tasa de 10 ml / min) y de la carga con el sobrenadante a una velocidad constante de 1 ml / min utilizando una bomba de jeringa.
   2. A partir de entonces, se lava con cartuchos de 3 ml 0,1% de TFA (tasa de 10 ml / min) y se eluye lentamente con 2 ml 70% de acetonitrilo que contiene 0,1% de TFA (2 ml / min).
   3. Secas muestras eluidas mediante centrifugación al vacío y se almacena a -80 ° C hasta su posterior procesamiento por radioinmunoensayo.
      NOTA: Llevar a cabo todos los pasos de polipropileno (procesamiento rápido) y borosilicato (radioinmunoensayo) tubos que presentan significativamente menor propiedades de unión a la superficie y por lo tanto minimizan la pérdida de péptido para la mayoría de los péptidos estudiados antes del ^26.

2. Las mediciones

NOTA: Los pasos de esta sección debe realizarse en un laboratoriocertificada para trabajar con material radiactivo. Las precauciones estándar para el trabajo con ^125I se deben tomar.

1. La recuperación de péptidos radiomarcados
   1. Obtener ¹²⁵ péptidos humanos I-radiomarcados (por ejemplo. Acil-grelina, GLP-1, el glucagón, la insulina, kisspectina, leptina, nesfatin-1, PYY _3-36 y la somatostatina-28).
   2. Mantenga péptidos en forma de polvo hasta que el experimento, a continuación, recién diluido en 0,1% de ácido acético (~ 100.000 cpm por ml).
   3. Para el procesamiento de sangre estándar, directamente después de la extracción de sangre en EDTA refrigerado que contiene tubos, de transferencia de 1 ml de sangre en un tubo con 50 l de radiomarcador que contiene 3.000-6.000 cpm (contados directamente antes del comienzo del experimento).
   4. Para un rápido procesamiento, transferencia de 1 ml de sangre de EDTA que contiene sangre en un tubo que contiene 9 ml de tampón RAPID (para la composición véase el punto 1.3) y 500 l marcador radiactivo que contiene 30.000-60.000 cpm. Debido a la utilización dilución 1:10 10 veces mayor volumen de radiolabel para un procesamiento rápido.
   5. Después, muestras de proceso como se describe en los pasos 1.2 a 1.3.2.
   6. Para los experimentos de recuperación, hacer muestras no secas por centrifugación al vacío y no almacenar a -80 ° C. En su lugar, evaluar la recuperación de los péptidos marcados radioactivamente directamente después usando un contador gamma.
   7. Mida todo el sobrenadante en las muestras testigos, mientras que en RAPID muestras analizan 1/10 del volumen total para obtener la comparabilidad de la cantidad de radiomarcador utilizado. Para la medición, se transfiere el sobrenadante en tubos que encajan en el contador gamma y evaluar las cuentas por minuto
   8. Como estándar 100%, utilice dos muestras con 50 l de péptido ^125-I radiomarcado que no se someten al proceso. Mida al mismo tiempo con otras muestras como se describe en 2.1.7.
   9. Realizar el experimento de cinco a seis veces para cada péptido.
2. Cromatografía Líquida de Alta radiomarcados de grelina
   1. Extraer sangre en cEDTA hilled que contiene los tubos y la transferencia de 1 ml a tubos que contenían 200 l grelina radiomarcado-acilo que contiene 15.000-20.000 cpm (contados directamente antes del comienzo del experimento).
   2. Para un rápido procesamiento, transferencia de 1 ml de sangre en un tubo que contiene 9 ml de tampón RAPID (para la composición véase el punto 1.3) y 200 l acil radiomarcado grelina que contiene 15.000-20.000 cpm.
   3. Después, muestras de proceso como se describe en los pasos 1.2 a 1.3.2.
   4. Para más análisis por HPLC de fase inversa, cargar directamente las muestras en una columna estable C18 Bond (2,1 mm x 50 mm, 1,8 micras) equilibrada en 17% de acetonitrilo en agua (ambos suplementado con 0,1% de TFA).
   5. Después de 5 min de equilibrado, usar un gradiente de 17-40% de acetonitrilo para eluir la muestra en 40 min (velocidad de 1 ml / min de flujo).
   6. Recoger fracciones de 1 ml por minuto y analizar la radiactividad usando un contador gamma.
   7. En un experimento separado, la carga de 200 l acilo radiomarcado grelina que contiene 15.000-20.000cpm en la columna directamente y llevar a cabo HPLC como se describe en los puntos 2.2.4 a 2.2.6.
3. radioinmunoensayo
   1. Para radioinmunoensayo, descongelar sobrenadantes congelados (procesamiento estándar) y aspirar polvo seco (método rápido) a temperatura ambiente.
   2. Inmediatamente antes de radioinmunoensayo, volver a suspender las muestras de secado rápido en la doble H ₂ O destilada de acuerdo con el volumen original del plasma (500 l).
   3. Evaluar kisspectina y total (incluyendo tanto desacil y la grelina de acilo), así como la grelina de acilo como se ha descrito antes usando radioinmunoensayos ^12,27 comerciales de acuerdo con los protocolos de los fabricantes. Utilizar tubos de borosilicato que permiten la formación de gránulos estable.
      1. En el primer día, incubar las muestras con tampón de ensayo y el anticuerpo primario (por ejemplo. Anti-ghrelina) en la dilución proporcionado por el fabricante durante un período de 24 horas.
      2. En el segundo día, añadir el trazador ^125I (por ejemplo, ^{125I-ghrelina),} voRTEX e incubar durante un período de 24 horas.
      3. En el tercer día, añadir el reactivo precipitante, vórtice y se incuba según lo recomendado por el fabricante. Entonces, los tubos de centrífuga a 3.000 xg durante 20 min a 4 ° C. Eliminar los sobrenadantes y contar la radiactividad en los gránulos usando un contador gamma
   4. Calcula desacil grelina como la diferencia del total de la grelina menos acilo. Evaluar la relación de grelina acilo / desacil dividiendo acilo por desacil grelina para cada muestra individual.
   5. Procesar todas las muestras - si es posible - en un solo lote para evitar la variabilidad inter-ensayo. La variabilidad intra-ensayo en el presente experimento fue <8% para kisspectina, <7% para el total y <9% de la grelina acilo.

3. Análisis estadístico

1. Determinar la distribución de los datos mediante la prueba de Kolmogorov-Smirnov. Expresar los datos como media ± error estándar de la media (SEM).
2. Evaluar las diferencias entre los dosgrupos de t-test. Evaluar las diferencias entre varios grupos de todos los procedimientos múltiples por pares de comparación (prueba de Tukey post hoc) o de dos vías ANOVA seguido por el método de Holm-Sidak.
3. Considere p <0,05 significativo y realizar análisis utilizando un programa de estadísticas.

Resultados

Procesamiento de sangre rápido incrementa el rendimiento de ¹²⁵ péptidos I-radiomarcados en la sangre humana en comparación con el procesamiento de sangre estándar.
Después del procesamiento de sangre estándar (sangre EDTA en hielo), la recuperación de péptidos radiomarcados fue de ~ 60% en 9/9 péptidos (que van desde 48 hasta 68%, la Figura 1A - K). Procesamiento rápido mejorado el rendimiento en todos los ¹²⁵ pép...

Discusión

Hemos informado anteriormente que el método rápido para el procesamiento de la sangre mejoró la recuperación de 11/12 péptidos en comparación con el procesamiento de sangre estándar en ratas ^6. En el presente estudio hemos demostrado que este método también es adecuado para el uso en seres humanos. Después de un rápido procesamiento, la recuperación de 9 de 9 ¹²⁵ péptidos marcados-I probado se mejoró en comparación con el procesamiento de sangre estándar (sangre con EDTA en hielo). ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Diprotin A	Peptides International, Louisville, KY, USA	IDP-4132
E-64-d	Peptides International, Louisville, KY, USA	IED-4321-v
Antipain	Peptides International, Louisville, KY, USA	IAP-4062
Leupeptin	Peptides International, Louisville, KY, USA	ILP-4041
Chymostatin	Peptides International, Louisville, KY, USA	ICY-4063
Sep-Pak C18 cartridges	Waters Corporation, Milford, MA, USA	WAT051910	360 mg, 55-105 µm
Acyl-ghrelin	Millipore, Billerica, MA, USA	9088-HK	Radioactive
GLP-1	Millipore, Billerica, MA, USA	9035-HK	Radioactive
Glucagon	Millipore, Billerica, MA, USA	9030	Radioactive
Insulin	Millipore, Billerica, MA, USA	9011S	Radioactive
Leptin	Millipore, Billerica, MA, USA	9081-HK	Radioactive
Kisspeptin-10	Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA	T-048-56	Radioactive
Nesfatin-1	Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA	T-003-26	Radioactive
PYY3-36	Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA	T-059-02	Radioactive
Somatostatin-28	Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA	T-060-16	Radioactive
ZORBAX Rapid Resolution HT SB-C18 column	Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA	822700-902	2.1 mm x 50 mm, 1.8 µm
Agilent 1200 LC	Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA		HPLC, several components, therefore no single catalog number
Kisspeptin  RIA	Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA	# RK-048-56	Radioactive
Total ghrelin RIA	Millipore, Billerica, MA, USA	# GHRT-89HK	Radioactive
Active ghrelin RIA	Millipore, Billerica, MA, USA	# GHRA-88HK	Radioactive
SigmaStat 3.1	Systat Software, San Jose, CA, USA	online download