Láser de Thulium de onda continua para calentar las células cultivadas para investigar los efectos térmicos celulares

Resumen

Aquí se introduce una configuración experimental original para calentar células en un plato de cultivo usando radiación de láser de onda continua de 1,94 μm. Utilizando este método, se pueden investigar las respuestas biológicas de las células epiteliales del pigmento retiniano (RPE) después de diferentes exposiciones térmicas.

Resumen

Aquí se introduce un método original para calentar células cultivadas usando un láser de thulium de onda continua de 1,94 μm para la evaluación biológica. La radiación láser de túlio es fuertemente absorbida por el agua, y las células en el fondo del plato de cultivo son calentadas por difusión térmica. Una fibra láser con un diámetro de 365 μm se coloca aproximadamente a 12 cm por encima del plato de cultivo, sin ninguna óptica, de manera que el diámetro del haz de láser sea casi equivalente al diámetro interior del plato de cultivo (30 mm). Al mantener una cantidad constante de medio de cultivo en cada experimento, es posible irradiar las células con un aumento de temperatura altamente reproducible.

Para calibrar el aumento de temperatura y su distribución en un plato de cultivo celular para cada ajuste de potencia, se midió la temperatura durante 10 s de irradiación en diferentes posiciones ya nivel celular. La distribución de la temperatura se representó utilizando un software de gráficos matemáticosPrograma, y ​​su patrón a través del plato de la cultura estaba en forma gaussiana. Después de la irradiación con láser, se pueden realizar diferentes experimentos biológicos para evaluar las respuestas celulares dependientes de la temperatura. En este manuscrito, se introduce la tinción de viabilidad ( es decir, distinguir las células vivas, apoptóticas y muertas) para ayudar a determinar las temperaturas umbral para la apoptosis celular y la muerte después de diferentes puntos en el tiempo.

Las ventajas de este método son la precisión de la temperatura y el tiempo de calentamiento, así como su alta eficiencia en células de calentamiento en un plato de cultivo de células enteras. Además, permite estudiar con una amplia variedad de temperaturas y duraciones de tiempo, las cuales pueden ser bien controladas por un sistema operativo computarizado.

Introducción

La comprensión de las respuestas biológicas celulares dependientes de la temperatura es de gran importancia para los tratamientos exitosos de hipertermia. La fotocoagulación láser retiniana con láser térmico, utilizada en oftalmología, es uno de los tratamientos con láser más establecidos en medicina. La luz visible, sobre todo de longitudes de onda verdes a amarillas, se utiliza en el tratamiento láser de la retina. La luz es altamente absorbida por la melanina en las células epiteliales del pigmento retiniano (RPE), que forman la monocapa celular más externa de la retina. Ha habido un interés reciente entre los médicos y los investigadores en la irradiación térmica muy leve (fotocoagulación sub-visible) como una nueva estrategia terapéutica para diferentes tipos de trastornos de la retina ^{1 , 2} . Siguiendo esta tendencia, nuestro interés está en calentar letalmente células RPE bajo un control preciso de la temperatura, una técnica llamada terapia fototérmica con temperatura controlada (TC-PTT).

Opto recienteAcústica de nuestro instituto ha permitido la medición en tiempo real de los aumentos de temperatura en los sitios irradiados en la retina. Esto permite controlar el aumento de la temperatura durante la irradiación ³ . Sin embargo, dado que la hipertermia sub-letal en la retina, causada por el calentamiento de las células RPE sub letalmente, no se ha considerado previamente debido a la imposibilidad de medir y controlar la temperatura, las respuestas celulares dependientes de la temperatura de las células RPE tras la irradiación con láser térmico Se ha estudiado muy poco hasta la fecha. Además, no sólo se ha discutido en detalle la diferencia de temperatura, sino también la diferencia en el comportamiento celular de las células supervivientes después de la irradiación letal y letal. Por lo tanto, para reunir evidencia científica sobre los tratamientos basados ​​en TC-PTT, nuestro objetivo es elucidar las respuestas biológicas dependientes de la temperatura de las células de RPE y sus mecanismos utilizando configuraciones experimentales in vitro .

Para tSu propósito, es necesario establecer un sistema de calentamiento de células que cumpla con las siguientes condiciones: 1) una posibilidad de aumentos rápidos de temperatura, 2) un tiempo y temperatura controlados con precisión, y 3) un número relativamente alto de células examinadas para experimentos biológicos . Respecto al método de calentamiento, un láser clínico, tal como un láser Nd.YAG de frecuencia doble (532 nm), desafortunadamente no es adecuado para el calentamiento del cultivo celular. Esto es debido al número fuertemente reducido de melanosomas en células RPE cultivadas. La absorción de la luz láser puede ser heterogénea, y el aumento de la temperatura a nivel celular es variable entre los experimentos, incluso cuando se irradia con la misma potencia de radiación. Varios estudios anteriores han informado sobre el uso de papel negro bajo el fondo del plato durante la irradiación ⁴ o el uso de melanosomas adicionales que son fagocitados por las células de cultivo antes de los experimentos ^{5 ,} Muchos deLos estudios biológicos in vitro para evaluar las respuestas de células inducidas por hipertermia se han realizado utilizando una placa caliente, un baño de agua o una incubadora de CO ₂ con un ajuste de temperatura ⁷ . Estos métodos requieren un largo período de calentamiento porque lleva algún tiempo ( es decir, varios minutos) alcanzar la temperatura deseada. Además, utilizando estos métodos, es difícil obtener un historial térmico detallado ( es decir, la temperatura multiplicada por el tiempo) a nivel celular. Además, la temperatura entre las células en diferentes posiciones en un plato de cultivo puede diferir debido a la difusión de temperatura variable. En la mayoría de los casos, esta información de temperatura temporal y espacial durante la hipertermia no ha sido tomada en consideración para los análisis biológicos, aunque la respuesta celular biológica puede ser afectada críticamente por la temperatura y la duración del tiempo de aumento de la temperatura.

Para superar estos problemas,El láser de thulium de onda nuous se usó aquí para calentar las células. La radiación láser de thulium (λ = 1,94 μm) es fuertemente absorbida por el agua ⁸ , y las células en el fondo del plato de cultivo son estimuladas térmicamente únicamente por difusión térmica. La fibra láser con un diámetro de 365 μm se coloca alrededor de 12 cm por encima del plato de cultivo, sin ninguna óptica entre ellas. El diámetro del haz láser diverge de tal manera que es casi equivalente al diámetro interior del plato de cultivo (30 mm) en la superficie del medio de cultivo. Con una cantidad constante de medio de cultivo, es posible irradiar las células con el aumento de temperatura De alta repetibilidad. Los ajustes de potencia variable permiten la irradiación con hasta 20 W, y la temperatura del medio en el nivel celular puede aumentarse hasta ΔT ≈ 26 ° C en 10 s.

Mediante la modificación de las condiciones de irradiación, también es posible cambiar el perfil del haz de láser para variar la distribución de la temperaturaEn un plato de cultivo. Por ejemplo, es posible investigar con una distribución de temperatura de tipo gaussiano, como en el presente estudio, o con una distribución de temperatura homogénea. Este último puede ser ventajoso para investigar los efectos de las respuestas celulares dependientes de la temperatura más específicamente para aumentos de temperatura sub-letales, pero no para el estrés por muerte celular o las respuestas de cicatrización de heridas.

En conjunto, la irradiación láser de thulium puede permitir la investigación de diferentes tipos de factores biológicos, como la expresión de genes / proteínas, la cinética de muerte celular, la proliferación celular y el desarrollo de la funcionalidad celular, después de diferentes exposiciones térmicas.

Protocolo

1. Cultivo celular de RPE

1. Aislamiento de células RPE de ojos porcinos
   1. Obtenga los ojos de porcino recién enucleados del matadero local. Manténgalos frescos (4 ° C) y en un ambiente oscuro.
   2. Quitar los tejidos extracelulares con tijeras y remojar los ojos en una solución antiséptica durante 5 min.
   3. Coloque los ojos en solución salina tamponada con fosfato esterilizada sin calcio y magnesio (PBS (-)) hasta su uso.
   4. Usando un bisturí, penetre la esclerótica a unos 5 mm por detrás del limbo corneal. Resect toda la parte anterior del ojo cortando con tijeras a través de todo, paralelo al limbo corneal.
   5. Quitar la parte anterior del ojo ( es decir, la córnea y la lente) y el vítreo. Añadir 1 ml de PBS (-) y retirar suavemente la retina neural.
      NOTA: Esta "copa ocular", que consiste en la esclerótica, coroides y RPE, está lista.
   6. Añadir tripsina pre-calentada (37 ° C) al 0,25% en PBS (-) a la copa del ojo. Ajustar el volumen de modo que se llene aproximadamente el 80% de la copa del ojo con esta solución de tripsina.
   7. Incubar la copa ocular con la solución de tripsina en una incubadora de CO2 al 5% a 37 ° C durante 10 min.
   8. Quitar la copa ocular de la incubadora y reemplazar la solución de tripsina al 0,25% con una solución de PBS (-) con 0,05% de tripsina + sal tetrasódica de ácido etilendiaminotetraacético al 0,2% (EDTA · 4N). Incubar el vaso del ojo en la incubadora durante 45 min.
      NOTA: Después de 45 minutos, las células de RPE serán o bien ligadas de forma suelta a la membrana de Bruch o ya separadas y flotando en la solución de tripsina-EDTA.
   9. Recoger las células RPE por pipeteado suave. Recoger las células y la solución en un tubo cónico llenado con 10 ml de medio de cultivo (DMEM glucosa alta con L-glutamina), incluyendo suero porcino al 10%, antibiótico / antimicótico y piruvato sódico (1 mM).
      NOTA: El suero puede neutralizar el efecto de la tripsina.
   10. Centrifugar elDe células a 400 xg durante 5 min a temperatura ambiente.
   11. Se retira el sobrenadante y se añaden 10 ml de medio fresco. Centrifugar de nuevo bajo las mismas condiciones durante 5 min.
   12. Se retira el sobrenadante y se añade nuevo medio, de modo que la concentración celular da como resultado 5 x 105 células / ml (determinado contando las células utilizando un hemocitómetro). Mezclar bien por pipeteado suave.
   13. Distribuir la suspensión celular en placas de cultivo celular. Utilice 3 mL por 60 mm de diámetro de cultivo de plato.
       NOTA: Este cultivo se denomina paso cero (P0).
   14. Mantener las células en una incubadora de CO2 al 5% a 37 ° C. Cambie la mitad del medio acondicionado a medio fresco cada dos días.
   15. Subcultivo (paso 1.2) si se convierte en confluente.
2. Subcultura del cultivo celular de RPE
   1. Eliminar el medio de cultivo y enjuagar las células dos veces con PBS (-).
   2. Incubar las células con solución de PBS (-) con 0,05% de tripsina + 0,2% de EDTA iNa 5% CO ₂ incubadora a 37 ° C durante 5 min.
   3. Separar las células de RPE por pipeteado suave y recoger la suspensión de células en un tubo cónico lleno con 10 ml de medio de cultivo, incluyendo el 10% de suero porcino.
   4. Centrifugar la suspensión celular a 400 xg durante 5 min a temperatura ambiente.
   5. Se retira el sobrenadante y se añade nuevo medio de cultivo, haciendo que la concentración celular sea de 5 x 10 ⁵ células / mL (determinada contando el número de células con un hemocitómetro). Distribuir las células en nuevas placas de cultivo de 60 mm de diámetro, como se describe en el paso 1.1.13.
      NOTA: El cultivo celular es ahora el paso 1 (P1).
   6. Después de alcanzar la confluencia, subcultivo el cultivo P1 a P2, usando el mismo procedimiento descrito en los pasos 1.2.1-1.2.5. A partir del cultivo P2, siembra las células en placas de cultivo más pequeñas (diámetro interior de 30 mm) en lugar de placas de cultivo de 60 mm de diámetro.
   7. Para los experimentos, utilizar cultivos P2 o P3.

2. ThulIum Irradiación láser

1. Construcción de la estación de irradiación
   1. Conecte un dispositivo láser de thulium (1,94 μm, rango de potencia: 0-20 W) a una fibra de 0,22-NA y 365 μm de diámetro central.
   2. Fije mecánicamente la punta de la fibra al brazo metálico que está fijado horizontalmente al poste metálico vertical de la estación de irradiación. Coloque el poste vertical de modo que la punta de la fibra láser se sitúe por encima de la placa caliente sobre la cual se va a colocar el plato de cultivo celular durante la irradiación.
   3. Coloque un papel blanco sobre la placa caliente y gire el rayo de enfoque (λ = 635 nm, máx = 1 mW, diámetro al nivel del papel ≈ 30 mm). Marque la circunferencia del haz de orientación sobre el papel blanco de modo que se conozca la posición en la que se coloca el plato de cultivo durante la irradiación.
      NOTA: El plano z de la punta de la fibra puede ser cambiable. Sin ninguna óptica de formación de imágenes adicional, el diámetro del punto láser en el plano de cultivo celular, situado a 12 cm por debajo de la punta de la fibra, iS de aproximadamente 30 mm, que es casi equivalente al diámetro interior del plato de cultivo celular. Un dibujo esquemático de la configuración se muestra en la Figura 1 .

Figura 1: Imagen Esquemática de la Estación de Irradiación Láser de Túlio. Se coloca un plato de cultivo sobre la placa calefactora. Las células se colocan 12 cm por debajo de la punta de la fibra láser de thulium de manera que el tamaño del haz es casi idéntico al diámetro interior del plato de cultivo (aproximadamente 30 mm). El procedimiento de irradiación con láser es controlado por una rutina controlada por el tiempo de la plataforma de diseño del sistema a medida. El ajuste de potencia debe determinarse antes de iniciar el programa de irradiación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La irradiación con láser del cultivo celular

1. 1 h antes de la irradiación, reemplazar completamente el medio de cultivo con 1,2 ml de medio fresco.
   NOTA: Este es un PASO CRÍTICO y debe ser estrictamente seguido.
2. Coloque la estación de irradiación ( es decir, la placa caliente y el poste con el que fijar la fibra láser) sobre un banco limpio.
3. Retire el plato de cultivo celular de la incubadora y colóquelo en la posición marcada en la placa caliente (paso 2.1.3).
4. Use gafas protectoras. Encienda el láser de thulium. Ajuste la potencia deseada en el dispositivo láser (sintonizable de 0 a 20 W). Encienda la emisión.
5. Iniciar una plataforma de diseño del sistema que controla el protocolo de irradiación y sincronización con láser (archivo suplementario).
6. Inmediatamente después de colocar el plato de cultivo en la placa caliente, haga clic en el "tiempo de precalentamiento" para iniciar el temporizador durante 140 s ("tiempo de precalentamiento 1"); Esto mantendrá la temperatura del medio de cultivo en 37 ° C antes de la irradiación.
   NOTA: Después de 140 s, se activará un pitido y el siguiente temporizador ("tiempo de precalentamiento 2") comenzará a contar automáticamente 8 s. Durante estos 8 s, el examinador puede abrir el plato de cultivo. Después de 148 s de precalentamiento, se llevará a cabo automáticamente una irradiación con láser de 10 s de longitud sobre el cultivo celular. En caso de emergencia, equipar el dispositivo láser con un botón de parada de fuerza para detener el láser inmediatamente. Este es un PASO CRÍTICO y debe ser estrictamente seguido. Un punto especial de precaución se refiere a abrir la tapa del plato justo antes de la irradiación, al comienzo del tiempo de precalentamiento de 8 s. Abrir la cubierta puede enfriar la superficie del soporte muy rápidamente.
7. Después de la irradiación, vuelva a colocar la tapa sobre el plato de cultivo, deje el plato de cultivo sobre la placa caliente durante 7 s adicionales y colóquelo de nuevo en el incubador de CO ₂ al 5% a 37 ° C.

Medición de la distribución de la temperatura enNivel celular (calibración de temperatura)

1. Hacer pequeños orificios (cerca de 300 μm de diámetro) cerca del fondo en cuatro lados (cada 90 °) de un plato de cultivo de 30 mm de diámetro (sin células); Use la punta de una aguja (20G) calentada con un quemador Bunsen. Sellar los orificios con cinta de aislamiento eléctrico desde el exterior y hacer un agujero pequeño con una aguja fina para que sólo un termopar fino (200 μ m de diámetro) se puede insertar a través de este agujero en condiciones de estanqueidad.
2. En el exterior del fondo del plato de cultivo, dibujar 2 diámetros perpendiculares y establecer el punto de cruce ( es decir, el centro del lado inferior) como el cero de coordenadas (0). Marque cada 3 mm radialmente al exterior fuera del plato ( es decir, 0, 3, 6, 9, 12 y 15 mm) en cada dirección a lo largo de las líneas ( Figura 2 , puntos azules); El número de puntos debe ser 21 en total.
3. Llene el plato de cultivo celular con 1,2 ml de nuevo medio de cultivo. Coloque la cultura dEn una placa caliente a 37 ° C, introduzca un termopar fino (200 μm de diámetro) en el orificio lateral, y coloque su punta sensible sobre una posición marcada a medir.
4. Use gafas protectoras. Encienda el láser de thulium y ajuste manualmente la potencia (entre 0 y 20 W, en incrementos de 0,1-W) del dispositivo láser.
   NOTA: Para la calibración de la temperatura, las mediciones con la potencia en incrementos de 3 W deberían ser suficientes.
5. Encienda la plataforma de diseño del sistema y haga clic en el botón "Start Temp. Acquisition" (archivo suplementario) para iniciar la medición de la temperatura.
6. Realizar el mismo procedimiento que en el paso 2.2.6.
   NOTA: El programa de control mide la temperatura del termopar insertado cada 100 ms y muestra la progresión de la temperatura durante la irradiación en la GUI.
7. Lleve a cabo estos procedimientos para los 21 puntos de medición y con diferentes ajustes de potencia. Repetir todo el procedimiento tres veces para todos los puntos y para todos los settin de potenciaGs para obtener datos confiables.
8. Exportar datos de temperatura como datos csv, que eventualmente pueden convertirse en una hoja de cálculo. Promediar la temperatura máxima al final de la irradiación para las mediciones triplicadas en cada punto. Promedio de los valores de los puntos en el mismo círculo (4 puntos en total, excepto el punto central).
9. Trace la temperatura máxima promedio obtenida en un gráfico, haciendo la distancia desde el centro del plato (mm) como el eje xy el aumento de temperatura (ΔT, ° C) como el eje y. Utilice la función de ajuste de un programa de software matemático para ajustar un modelo gaussiano a los datos sin procesar. Cree una distribución de temperatura gaussiana.

Figura 2: Los puntos para la calibración de temperatura en un plato de cultivo celular. Los datos de temperatura se midieron en el centro y en 5Puntos radiales sobre 4 ángulos diferentes (puntos azules). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. Evaluaciones biológicas de las respuestas celulares después de diferentes irradiaciones térmicas

1. Evaluación de la viabilidad celular ( es decir, vivos, apoptóticos y muertos) después de diferentes ajustes de potencia y la determinación del umbral de muerte celular
   1. En los puntos de tiempo indicados ( es decir, 3, 24 y 48 h después de la irradiación), lavar las células con PBS (-) y utilizar un kit disponible comercialmente para evaluar la viabilidad celular ( es decir, vital, apoptótico, muerto) protocolo.
   2. Preparar una solución de tinción añadiendo 5 μl de isotiocianato de fluoresceína (FITC) -nexina V, 5 μl de homodímero de etidio III y 5 μl de Hoechst 33342 a 100 μl de tampón de unión 1x (todos son kitComponentes). Preparar suficiente solución de tinción para cubrir las células. Incubar las células durante 15 min.
   3. Lavar el cultivo de células con el tampón de unión dos veces, sustituir el tampón de unión con PBS (-), y establecer el cultivo en la etapa de un microscopio de fluorescencia.
   4. Cambie el trayecto de la luz a la lente ocular, seleccione el filtro 4 ', 6-Diamidin-2-phenylindol (DAPI), active la luz de iluminación y encuentre el plano enfocado con el objetivo 4x.
   5. Cambie la trayectoria de la luz a la cámara, encuentre la imagen en la pantalla de la computadora en el software de la proyección de imagen del microscopio, y ajuste el foco.
   6. Utilice la función de puntada ( es decir, la función para grabar múltiples imágenes a través del plato y luego crear una sola imagen grande) del software específico del microscopio para obtener la imagen de fluorescencia del plato de cultivo de células completo. Utilice 3 conjuntos de filtros diferentes: DAPI, FITC y tetrametilrhodamina (TRITC), para la imagen de células positivas a Hoechst 33342 (todos los núcleos celulares), FITC-anexina V-positiVe (apoptóticas) y las células homodímero III de ethidium (muertas), respectivamente.
   7. Medir el radio (mm) de la región muerta (región homodímero III de etidio) y el radio exterior / interior de la región de la banda en forma de banda apoptótica (anexina V-positiva) en los cultivos celulares teñidos. Aplique estos radios a la función Gaussiana de la distribución de temperatura para el ajuste de potencia correspondiente. Calcular la temperatura exacta en el borde de la región muerta o apoptótica para aclarar las temperaturas umbral de la muerte celular y el cambio apoptótico.

Resultados

Distribución de la temperatura después de diferentes ajustes de potencia

Todos los desarrollos de temperatura para cada irradiación simple se controlaron en la calibración de temperatura. A partir de estos datos, se obtuvo la temperatura máxima en el punto medido y se definió como T _{_} { _max} (° C). Como se muestra en la Figura 3A , el programa se ejecutó en el momento en...

Discusión

Al discutir las respuestas celulares biológicas relacionadas con la temperatura, no sólo la temperatura, sino también la duración del tiempo de aumento de la temperatura, es importante, ya que la mayoría de los procesos bioquímicos son dependientes del tiempo. Particularmente en el campo de la hipertermia inducida por láser en oftalmología, debido al corto intervalo de tiempo -desde milisegundos a segundos- es difícil investigar los efectos térmicos celulares con un control preciso de la temperatura. Por lo ta...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - high glucose	Sigma-Aldrich	D5796-500ML	Add (2)-(4) before use. Warm in 37 °C water bath before use.
Antibiotic Antimycotic Solution (100 ×)	Sigma-Aldrich	A5955-100ML	Containing 10,000 units penicillin, 10 mg streptomycin and 25 μg Amphotericin B in 1mL. Add 5.5 mL in 500 mL medium bottle (1) before use.
Sodium pyruvate (100 mM)	Sigma-Aldrich	S8636-100ML	Add 5.5 mL in 500 mL medium bottle (1) before use (final concentration: 1 mM)
Porcine serum	Sigma-Aldrich	12736C-500ML	Add 50 mL in 500 mL medium bottole (1) before use (final: 10%)
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537-500ML
Trypsin from porcine pancreas	Sigma-Aldrich	T4799-25G
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich	ED-100G
Human VEGF Quantikine ELISA Kit	R&D System	DVE00
Oxiselect Total Glutathione Assay Kit	Cell Biolabs, Inc	STA-312
Apoptotic/Necrotic/Healthy Cells Detection Kit	PromoKine	PK-CA707-30018
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipments
Thulium laser	Starmedtec GmbH	Prototype	0-20 W
365 mm core diameter fiber	LASER COMPONENTS Germany	CF01493-52
Thermocouple	Omega Engineering Inc	HYP-0- 33-1-T-G-60-SMPW-M
Heating plate	MEDAX
Microplate reader (spectrofluorometer)	Molecular Device	Spectramax M4
cell homogenizer	QIAGEN	TissueLyser LT
Fluorescence microscope	Nikon	ECLIPSE Ti
mathematical software program	The Mathworks. Inc	MATLAB Release 2015b
system-design platform	National Instrument	Labview	Laboratory Virtual Instrument Engineering Workbench