Preparación de muestras para análisis de masas Citometría

Resumen

This article describes the collection and processing of samples for mass cytometry analysis.

Resumen

Masa utiliza citometría de anticuerpos conjugados con etiquetas de metales pesados, un enfoque que ha aumentado considerablemente el número de parámetros y oportunidades para el análisis profundo mucho más allá de lo que es posible con el flujo basado en la fluorescencia convencional citometría. Como con cualquier nueva tecnología, hay pasos críticos que ayudan a asegurar la generación fiable de datos de alta calidad. Se presenta aquí un protocolo optimizado que incorpora múltiples técnicas para el procesamiento de muestras de células para análisis de masas citometría. Los métodos descritos aquí ayudarán al usuario a evitar los errores comunes y lograr resultados consistentes al minimizar la variabilidad, que puede conducir a datos inexactos. Para informar el diseño experimental, la razón de pasos opcionales o alternativos en el protocolo y su eficacia en el descubrimiento de nuevos hallazgos en la biología del sistema que está siendo investigado está cubierto. Por último, los datos representativos se presenta para ilustrar resultados esperados de la Presente técnicasd aquí.

Introducción

Citometría permite la medición simultánea de múltiples objetivos de anticuerpos en un único nivel celular a través de grandes poblaciones de células. En tradicional citometría de flujo basada en fluorescencia, el número de parámetros que pueden cuantificarse está limitada por la superposición espectral entre el espectro de emisión de múltiples fluoróforos, que requiere cálculos de compensación cada vez más complejos como el número de parámetros aumenta. Estas limitaciones se abordan en masa citometría, donde se detectan y cuantifican por tiempo de vuelo (TOF) espectrometría de masas para ampliar en gran medida el número de parámetros recogidos simultáneamente y producir un alto perfil de proteínas-abundancia dimensional para cada célula individual anticuerpos conjugados de metales pesados.

Un conocimiento básico del funcionamiento de los medios de citometría de instrumentos es beneficioso para el usuario y puede ser esencial para la resolución de problemas. Para una descripción más completa de ajuste y funcionamiento de una máquina de masa citometría,ver el manuscrito relacionado ^1. Brevemente, una muestra celular se marca con un panel de anticuerpos conjugados de metal de orientación marcadores de superficie celular, proteínas citoplásmicas, proteínas nucleares, proteínas de la cromatina unida u otros epítopos de interés (Figura 1i). Las células marcadas se cargan en la máquina, ya sea de una en una por inyección manual o el uso de un muestreador automático que las muestras de una placa de 96 pocillos. Las células cargadas se inyectan a través de un nebulizador, que genera una pulverización de gotitas líquidas que encapsulan las células (Figura 1ii). Este spray se coloca de modo que las células son ionizados por un soplete de plasma de argón. Esta ionización genera una nube de partículas comprendido de todos los átomos constituyentes de cada célula (Figura 1III). Como esta nube de partículas viaja al detector, átomos de baja masa atómica se separan de los altos iones de masas por un filtro de masas de cuadrupolo. Los iones de masas de alta restantes siguen el detector, donde el abundance de cada isótopo se cuantifica (Figura 1iv). Los datos brutos recogidos por el detector, son analizados por el software del instrumento de citometría de masas para identificar eventos celulares. Para cada evento célula identificada, la señal detectada en cada canal se cuantifica y se guarda en el archivo una salida .fcs. Los canales de masa utilizados para la detección de los anticuerpos de metales pesados ​​conjugados exhiben solapamiento espectral mínimo, que oscila de 0-4% con la mayoría de las contribuciones por debajo de 1%. Debido a esta baja diafonía entre canales, generalmente es innecesario para transformar los datos con una matriz de compensación antes del análisis ^2. Sin embargo, se debe tener cuidado durante el diseño del panel experimental de anticuerpos para garantizar que un anticuerpo con un epítopo de alta abundancia no se asigna a un canal de masa que contribuye señal a un canal asignado a un anticuerpo de baja abundancia, ya que puede crear una población artificialmente alta en el canal de recepción de la contribución de la señal.

La preparación exacta de muestras para análisis de citometría de masa es altamente dependiente de los tipos de muestras que se recogió y la hipótesis experimental se está probando. Proporcionamos ejemplos de dos protocolos para la recolección de diferentes tipos de células (células madre embrionarias humanas) y células primarias (tumor de mama aislar de células epiteliales de ratón). Al comenzar un estudio de citometría de masas, es aconsejable llevar a cabo primero un pequeño experimento piloto para asegurar que todos los protocolos y los anticuerpos que se utilizarán están trabajando bien en manos del investigador. Esto es especialmente esencial cuando se van a utilizar anticuerpos conjugados de encargo, como la reacción de reducción parcial durante la conjugación de anticuerpos tiene el potencial de interrumpir la afinidad del anticuerpo; Por lo tanto, cada anticuerpo a medida necesita ser validado empíricamente para garantizar la exactitud de los datos. Otras consideraciones incluyen la determinación de si los anticuerpos de la superficie celular que se utilizarán en el ensayo reconocerá sus epítopos después de la fijación o si need a ser aplicado a células vivas. Algunos de fijación puede evitar la tinción adecuada con anticuerpos de la superficie celular como se sabe que ocurre con el péptido-MHC tinción ^{3, 4.} Realización de la tinción de anticuerpos de la superficie celular en células vivas puede ser necesario para algunos anticuerpos, pero esto excluye la opción de códigos de barras antes del marcaje de anticuerpos como la mayoría de los métodos de código de barras se realizan después de la fijación ^5, aunque el código de barras basado en anticuerpos ^{6, 7} es una excepción.

Al determinar el número de células que se preparó para el análisis, es importante saber que será detectado sólo una fracción de las células cargadas en la máquina y producir datos. Esta pérdida se debe principalmente a las ineficiencias cuando el nebulizador pulveriza de la muestra a la antorcha. La pérdida exacta ciento depende de la masa de citometría de configuración de la máquina y el tipo celular, pero puede variar de 50-85% y debe estarcuenta en el diseño del experimento. Este protocolo se ha optimizado para 2x10 ⁶ células por muestra, pero puede ser adaptado para el procesamiento de tamaños de muestra más pequeños o más grandes. Este protocolo se puede utilizar con modificaciones mínimas para tamaños de muestra de 1 x 10 ⁶ 4 x 10 ^6, sin embargo, es crítico que tamaño de la muestra se mantiene constante dentro de un experimento. Los cambios en el número de células pueden afectar a la intensidad de los códigos de barras y la tinción de anticuerpos y debe ser mantenido más o menos constante a través de muestras que deben compararse directamente.

Algunos procedimientos, como el etiquetado de células muertas y de marcaje de ADN, deberían llevarse a cabo en la gran mayoría, si no todos los diseños experimentales. El etiquetado de células muertas en los experimentos de análisis de marcadores de superficie sólo se puede lograr utilizando Rh103, pero Rh103 se debe evitar por experimentos en los que se requiere la permeabilización, que resultará en la pérdida de tinción. Para los experimentos que implican la permeabilización, es aconsejable utilizar cisplatino 8 y, cuando sea posible, un anticuerpo que reconoce PARP exfoliados o exfoliados caspasa para detectar células apoptóticas y muertas.

Muestras de código de barras pueden reducir el consumo de anticuerpo, disminuir el tiempo de adquisición y eliminar de la muestra a muestra variabilidad ^9. El proceso de código de barras consiste en aplicar un código de muestra específica única para todas las células, que se utiliza para asignar a cada célula a su muestra de origen. Después de códigos de barras las muestras podrán mezclarse antes de la tinción de anticuerpo, un proceso que asegura todas las muestras se tiñen por igual. Para reducir al mínimo el error experimental, es prudente código de barras y Piscina ninguna de las muestras que van a ser directamente comparados entre sí. Actualmente existen varios métodos para códigos de barras muestras para análisis de citometría de masa ^{5, 6, 7,} dos de los cuales se presentan aquí (véase abajo).

Con reagen disponibles en la actualidadts es posible cuantificar la abundancia de 38 dianas de anticuerpos, identificar las células en la fase S ^10, distinguir las células vivas y muertas ⁸ y medir los niveles celulares de la hipoxia ¹¹ en un experimento de multiplexado de múltiples muestras. Esta capacidad de recoger datos de células individuales alta de parámetros para las poblaciones de células grandes permite mejorar de perfiles de poblaciones de células altamente heterogéneos y ya ha producido una serie de puntos de vista biológicos novedosos ^{12, 13, 14, 15, 16.} Destilar los datos complejo resultante a la información interpretable ha requerido el uso de algoritmos computacionales incluyendo Spanning Tree progresión de la densidad de Eventos normalizada (SPADE) ¹⁷ y Visne ^18.

En este artículo se presenta un formato accesiblevisión general de cómo diseñar y llevar a cabo una masa citometría de experimento e introduce el análisis básico de datos de citometría de masas.

Protocolo

1. La recolección celular

1. Recolección de células de tejido primario
   NOTA: El proceso descrito para las células de recolección de tejido primario es específicamente aplicable a los tejidos de tumor de mama de ratón y puede no ser aplicable como es de tejidos primarios de otras fuentes.
   1. Preparar tampón de digestión por disolución de 5 mg de hialuronidasa y colagenasa 30 mg en 10 ml de medio DMEM / F12 por gramo de tejido a procesar. Filtrar esterilizar tampón de digestión.
   2. Aislar tumor de la glándula mamaria primaria de ratón y tumor ficha peso.
   3. Picar tejido con # 10 bisturí durante al menos 5 min.
   4. Añadir tejido picado a volumen apropiado de tampón de digestión (10 ml de tampón por gramo de tejido).
   5. Agitar tejido picado en tampón de digestión a 100 rpm durante 1-3 h a 37 ° C.
   6. Obtener suspensión de células individuales haciendo pasar las células a través de 0,4 micras filtro en un tubo de 50 ml.
   7. Centrifugar las células a 300 xg durante 10 min a 4 °;DO. Decantar o aspirar cuidadosamente el sobrenadante sin perturbar el sedimento.
   8. Resuspender el sedimento en 4 ml de DMEM / F12 y la transferencia a 5 ml de tubos de fondo redondo.
2. Recolección de células de cultivo de tejidos
   1. Lavar la placa o matraz de células adherentes con calcio y magnesio fosfato libre solución salina tamponada (PBS) a temperatura ambiente.
      NOTA: La técnica descrita para las células de recolección es específicamente aplicable a adherente células de cultivo de células madre embrionarias humanas (células madre). Sin embargo, el resto del protocolo descrito es ampliamente aplicable a otras líneas celulares cultivadas, líneas no adherentes y células primarias.
   2. Añadir tripsina calentado (37 ° C) u otro reactivo de digestión enzimática optimizada para lograr una única suspensión celular de las células adherentes. Siga el protocolo del fabricante.
      NOTA: La tripsina y otros reactivos de disociación enzimáticos tienen el potencial de afectar marcadores celulares.
   3. Incubar la placa a 37° C durante 2-5 min para separar las células. Para los cultivos de altos confluencia, golpear suavemente la placa para ayudar a separar las células.
   4. Transferencia de células completamente separados de la placa en un tubo de fondo redondo de 5 ml y suavemente pipeta usando una pipeta de 1 ml para disociar las células.
      NOTA: Para el procesamiento de grandes cantidades de muestras de todos los pasos, alternativamente, se puede realizar en una placa de fondo redondo de 96 pocillos. Para el procesamiento de muestras en un formato de 96 pocillos todos los lavados se pueden realizar en un volumen de 250! L. Los volúmenes descritos en otras etapas pueden ser ajustados de modo que el volumen total no exceda de 300! L.
   5. Se inactiva el reactivo de digestión enzimática con un tampón de lavado igual volumen (0,5% de BSA y azida sódica al 0,02% en PBS).
      NOTA: La azida sódica es una sustancia química peligrosa. las precauciones de seguridad deben tener en cuenta para su preparación y manipulación.
   6. Centrifugar las células a 300 xg durante 5 min a 37 ° C. Decantar o aspirar cuidadosamente el sobrenadante sin perturbar el sedimento.
   7. Resuspenderlas células en medio libre de 1 ml de suero.
   8. Recuento de células mediante la transferencia de 10? L de la suspensión celular a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Diluir alícuota a una relación conocida en azul de tripano y la transferencia a un hemocitómetro o sistema de conteo de células automatizado.
3. Etiquetado de la población de la fase S
   NOTA: Si el etiquetado de la fase S no a realizar es proceder para contener 1,4.
   1. Preparar 1 ml de 10? M de 5-yodo-2'-desoxiuridina (IDU) en suero F12 DMEM libre u otros medios apropiados para que se analizaron cada 2 x 10 ⁶ células.
   2. Añadir 500! L de 10? M UDI en medio libre de suero por cada 2 x 10 ⁶ células.
      NOTA: Mientras etiquetado IdU se puede realizar en medios que contienen suero, proteína libre reaccionará con cisplatino, la prevención de etiquetado apropiado de células muertas. Si se usa un medio que contiene suero durante IdU etiquetado de una etapa de lavado adicional es medio libre de suero es necesario para eliminar las proteínas de suero antes de cisplatino en vivo sta / muertosnando.
   3. resuspender suavemente pellets con 1 ml pipeta.
   4. Incubar durante 10 min a 37 ° C con agitación suave.
4. Etiquetado Live / Dead
   1. Para cada muestra de preparar 500 l de 50? M de cisplatino en suero libre de DMEM-F12 o tipo de célula medio de comunicación adecuado.
      NOTA: Si el etiquetado de la población de la fase S por IdU no se va a realizar, las muestras de volver a suspender a una concentración de 4 x 10 ⁶ células / ml. Resuspensión de las células antes de añadir cisplatino permite mezclar más rápido de soluciones para el etiquetado uniforme en vivo / muerto.
   2. Añadir 500 l de 50? M cisplatino por 2 x 10 ⁶ células a las muestras.
   3. Se incuba a temperatura ambiente (RT) durante 1 min en un agitador orbital con mezclado constante.
   4. Se detiene la cisplatino con un volumen igual de tampón de lavado.
   5. Centrifugar las células a 300 xg durante 5 min a TA. Decantar o aspirar cuidadosamente el sobrenadante sin perturbar el sedimento.
   6. Lavar las muestras dos vecescon 500! l de tampón de lavado para eliminar el exceso cisplatino.
   7. muestras de lavado dos veces con 500 l de PBS para eliminar el exceso de proteínas.
5. la fijación de la muestra
   1. muestra Resuspender en 500! l de PBS.
   2. Añadir un volumen igual de PFA al 4% en PBS para una concentración final de 2%; pipeta para mezclar.
      NOTA: Preparar 4% PFA fresco a partir de polvo, ajustar el pH a 6,9 y pasar a través de un filtro de 0,44! M. PFA al 4% en PBS se puede almacenar a 4 ° C durante hasta dos semanas. Evitar formalina premade suministrado en ampollas, a menos probado específicamente, ya que a menudo contiene contaminantes metálicos que pueden interferir con los canales de masa medida. menor concentración de PFA puede ser suficiente y ayudar a minimizar el efecto de fijación en la unión del anticuerpo, pero debe ser probado empíricamente.
   3. Incubar durante 15 min a TA en un agitador orbital con mezclado constante.
   4. Centrifugar las células a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Decantar o aspirar con cuidado el sobrenadante wiThout perturbar el sedimento.
   5. muestras de lavado con PBS para eliminar la solución PFA.
      NOTA: En este paso muestras puede almacenarse brevemente a 4 ° C. el almacenamiento prolongado a 4 ° C puede dar lugar a la degradación de la muestra y la disminución de la tinción.

2. El código de barras

NOTA: Mientras metodología para la utilización de códigos de barras monoisotopic cisplatino y paladio códigos de barras se presenta de forma simultánea, ya sea se puede utilizar independientemente o evitarse por completo si no es requerido por el experimento.

1. El código de barras monoisotopic cisplatino
   NOTA: Dado que los códigos de barras cisplatino y cisplatino tinción Live / Dead se basa en la superposición de canales de atención deben tomarse medidas para garantizar que los antecedentes cisplatino tinción Live / Dead en las células vivas se reduce al mínimo, ya que puede interferir con la precisión del código de barras cisplatino.
   1. Diluir 1 mM cisplatino monoisotopic soluciones de reserva hasta 200? M en PBS.
   2. DelanteroACH cisplatino único código de barras preparar un tubo de 1,5 ml con 500 l de PBS por cada 2 x 10 ⁶ células que reciben que código de barras.
   3. Para preparar cada código de barras único añadir cada cisplatino monoisotopic aplicable a una concentración final de 200 nM.
   4. Resuspender las células en 500 l de PBS por 2 x 10 ⁶ células.
   5. Añadir un volumen igual de la solución de código de barras correspondiente a cada muestra.
   6. Incubar las muestras a temperatura ambiente durante 5 min en un agitador orbital con mezclado constante.
   7. Se inactiva cisplatino con un volumen igual de tampón de lavado.
   8. Centrifugar las células a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Decantar o aspirar cuidadosamente el sobrenadante sin perturbar el sedimento.
   9. muestras de lavado dos veces con tampón de lavado 500 l para eliminar el exceso cisplatino.
2. El código de barras paladio
   NOTA: reactivos de código de barras de paladio pueden ser preparados ⁵ o comprar comercialmente.
   1. transitoria parcialpermeabilización ¹⁹
      NOTA: los códigos de barras Palladium quelación requiere la permeabilización parcial para los reactivos pasen a través de la membrana celular y la etiqueta robustamente la célula.
      1. muestras de lavado con 500 l de PBS.
      2. muestras de lavado con 500! l de PBS más 0,02% de saponina.
      3. Resuspender el sedimento en el volumen residual.
   2. Aplicar el código de barras paladio.
      1. Diluir de stock 100x de reactivo de códigos de barras de paladio en 1 ml de PBS enfriado en hielo más 0,02% de saponina.
      2. Rápidamente añadir códigos de barras del reactivo diluido para la muestra se volvió a suspender.
      3. Incubar durante 15 min a TA en un agitador orbital a con mezclado constante.
      4. muestras de lavado dos veces con 500! l tampón de lavado.

3. celular tinción de la superficie

NOTA: tinción de la superficie celular se puede realizar en células vivas antes de la fijación. Esto puede ser necesario para los anticuerpos que pierden afinidad por their epítopo después de la fijación. Algunas muestras de células pueden beneficiarse de bloqueo adicional, tal como Fc de bloqueo para los leucocitos, antes del marcaje de anticuerpos para reducir el fondo. bloqueo óptima debe determinarse empíricamente para el tipo específico de la muestra.

1. Preparar la superficie celular panel de tinción de anticuerpos.
   1. Combinar 0,5 ml, o determinada empíricamente la cantidad, de cada 0.5 mg / mL de anticuerpo de la superficie celular por muestra en un tubo de 1,5 ml. Añadir tampón de lavado si es necesario para llevar el volumen hasta 10 l por muestra. Mezclar con la pipeta.
      NOTA: Determinar dilución de trabajo para cada anticuerpo antes del experimento empíricamente por experimento de valoración.
   2. pool de anticuerpo de la superficie celular divide por igual en uno 1,5 tubo ml para cada muestra a ser manchado.
   3. Preparar 500 l de tampón de lavado en un tubo de 1,5 ml para cada muestra.
2. Aplicar tinción de la superficie celular para muestras de volumen normalizado para todas las muestras.
   NOTA: Para ensure etiquetado anticuerpo consistente a través de múltiples muestras es vital para controlar cuidadosamente el volumen de muestra y la concentración de anticuerpo. Los pasos siguientes pretenden lograr esta consistencia, garantizando que los volúmenes finales de la muestra después de que el anticuerpo ha sido añadido son uniformes.
   1. Centrifugar las células a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Decantar o aspirar cuidadosamente el sobrenadante sin perturbar el sedimento.
   2. Con una pipeta conjunto 200! L de 50! L, eliminar la solución remanente de pellet de muestra y transferir a un tubo de la piscina alícuotas de anticuerpo de la superficie celular.
   3. Pipetear hasta que todo el líquido en el tubo alícuota sin aire en la punta de la pipeta.
   4. Mientras sostiene el émbolo de la pipeta para evitar aspirar aire mover la punta en un tubo preparado de 500! L de tampón de lavado y liberar el émbolo.
   5. Volver a agregar el contenido de la punta de la pipeta de la muestra y volver a suspender la muestra en el líquido con pipeteo suave.
   6. Incubar las muestras para 1h a TA en un agitador orbital con mezclado constante.
   7. muestras de lavado dos veces con tampón de lavado 500 l para asegurar que todo el anticuerpo libre se elimina por lavado.
   8. muestras de lavado con 500 l de PBS.
   9. Resuspender el sedimento celular en 500 l de PBS.
   10. Añadir un volumen igual de PFA al 4% en PBS; pipeta para mezclar.
   11. Incubar durante 10 min en un agitador orbital.

4. Cell permeabilización e intracelular tinción

1. permeabilización celular
   1. Centrifugar las células a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Decantar o aspirar cuidadosamente el sobrenadante sin perturbar el sedimento.
   2. Resuspender las células en el volumen residual agitando con vórtex suavemente hasta que se disocia el sedimento.
      NOTA: Si no disociar células antes de la adición de MeOH dará lugar a células que se adhieren entre sí y producir una película delgada que se traducirá en la pérdida de muestra parcial.
   3. Inmediatamente añadir 1 ml de 100% de MeOH por 2 x 10 ^{6 <}/ Sup> células y suavemente la pipeta para mezclar.
      NOTA: Otros métodos de permeabilización puede ser sustituido por MeOH y puede ser necesario para lograr la permeabilización óptima para algunos tipos de células. Para algunas fuentes de células de un 0,1% de Triton X-100, 0,2% de Tween-20 o 0,1% de saponina en solución de PBS para la permeabilización puede mantener la integridad celular mejor, mientras que todavía proporciona permeabilización consistente.
   4. Incubar las muestras durante al menos 1 h o hasta un máximo de 24 horas a 4 ° C para la permeabilización.
      NOTA: En este paso muestras en MeOH se pueden almacenar durante un máximo de 1 mes a -80 ° C.
   5. Centrifugar las células a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Decantar o aspirar cuidadosamente el sobrenadante sin perturbar el sedimento.
   6. Añadir 1 ml de tampón de lavado por cada ml de MeOH utiliza para permeabilizar la muestra. resuspender suavemente el sedimento celular.
   7. Lavar la muestra dos veces con 500! L tampón de lavado.
2. Preparar panel de tinción de anticuerpos intracelular.
   1. Combinar 0,5 ml, o determinada empíricamente la cantidad, de cada 0.5 mg / mL de anticuerpo intracelular por muestra en un tubo de 1,5 ml. Añadir tampón de lavado si es necesario para llevar el volumen hasta 10 l por muestra. Mezclar con la pipeta.
   2. Dividir pool de anticuerpo intracelular igualmente en un tubo de 1,5 ml para cada muestra.
   3. Preparar 500 l de tampón de lavado en un tubo de 1,5 ml para cada muestra.
3. Aplicar la tinción intracelular para muestras de volumen normalizado para todas las muestras.
   NOTA: Para garantizar el etiquetado de anticuerpos consistente a través de múltiples muestras es vital para controlar cuidadosamente el volumen de la muestra y la concentración de anticuerpos.
   1. Centrifugar las células a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Decantar o aspirar cuidadosamente el sobrenadante sin perturbar el sedimento.
   2. Con 200 pipeta l ajustado a 50 l eliminar la solución de sedimento de la muestra y la transferencia restante a un tubo de la piscina alícuotas de anticuerpo de la superficie celular.
   3. Pipetahasta que todo el líquido en el tubo alícuota sin aire en la punta de la pipeta.
   4. Mientras sostiene el émbolo de la pipeta para evitar aspirar aire mover la punta en un tubo preparado de 500! L de tampón de lavado y liberar el émbolo, la elaboración de tampón de lavado para un volumen total de muestra de 50 mL.
   5. Volver a agregar el contenido de la punta de la pipeta de la muestra y volver a suspender la muestra en el líquido con pipeteo suave.
   6. Se incuban las muestras durante 1 hora a RT en un agitador orbital con mezclado constante.
   7. muestras de lavado dos veces con 500! l tampón de lavado.
   8. muestras de lavado con 500 l de PBS.

5. Iridium etiquetado

1. Fix muestras
   1. muestras Resuspender en 500 l de PBS.
   2. Añadir 500 l de PFA al 4% en PBS.
   3. Incubar durante un mínimo de 15 min a TA en un agitador orbital con mezclado constante.
2. Aplicar etiquetado Iridium de DNA
   1. Diluir el 125? M de reactivo intercalante 500x iridio en PFA al 4% en PBS a una concentración de 62,5 nM.
   2. Añadir solución de PFA 500 l 62,5 nM iridio a las muestras.
      NOTA: Para los experimentos utilizando células permeabilizadas, se diluye la 500x Ir191 / 193 de stock para una dilución final de 1: 2000 para evitar la sobretinción.
   3. Incubar durante 15 min a TA en un agitador orbital con mezclado constante.
      NOTA: Si la realización de códigos de barras cisplatino monoisotopic No incubar las muestras con iridio durante más de 15 min desde fuertes señales Ir193 pueden contribuir a la canal de masa Pt194 y perjudicar la calidad del código de barras.
   4. Centrifugar las células a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Decantar o aspirar cuidadosamente el sobrenadante sin perturbar el sedimento.
   5. muestras de lavado dos veces con 500! l de 0,1% de BSA en agua desionizada filtrada.
      NOTA: Una vez preparadas las muestras se recomienda correr el plazo de 24 horas si es posible. Las muestras preparadas se pueden almacenar a corto plazo a 4 ° C,pero se debe tener cuidado para evitar la degradación. Si es posible los lavados finales deben realizarse en agua desionizada filtrada sin BSA como esto disminuirá la deposición en la cámara de pulverización y Sampler conos de la máquina que disminuirá la limpieza de instrumentos. Para hESCs es necesario para llevar a cabo estos lavados mientras incluyendo BSA para evitar la pérdida de muestra se pegue a la superficie del tubo.

6. Preparar muestras para Adquisición

1. Recuento de células
   1. Resuspender las células en 500 l 0,1% de BSA en agua desionizada filtrada y el filtro en un tubo fresco a través de un tapón de filtro de 35 micras celular.
      NOTA: Reducir el nivel de BSA durante los lavados finales disminuye el residuo dejado en el nebulizador citometría de masas. Las células no adherentes se pueden lavar y se resuspendieron en agua desionizada filtrada.
   2. Recuento de células mediante la transferencia de 10? L de la suspensión celular a un tubo de microcentrífuga. Diluir alícuota a una relación conocida enazul de tripano (para ayudar con la visualización de células) y transferir a un hemocitómetro o sistema de conteo de células automatizado.
   3. Centrifugar las células a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Decantar o aspirar cuidadosamente el sobrenadante sin perturbar el sedimento.
2. Preparar y muestras de carga
   1. Para preparar perlas de calibración retirar del refrigerador y agitar vigorosamente para resuspender.
   2. Si se ejecuta muestras usando una masa citometría de inyector automático, añadir 50 l de perlas de calibración a cada pocillo de placa de muestra a continuación, añadir el número deseado de células a analizar. Si las muestras que se ejecutan por inyección manual añaden 50! L de perlas de calibración a la muestra, diluir la muestra en agua desionizada filtrada, mezclar bien y muestra de carga en el puerto de inyección de muestras de citometría de masas. La dilución apropiada de la muestra puede variar dependiendo del tipo de célula que se está analizando, pero una dilución de 10 ⁶ es generalmente apropiado ^1.

Resultados

El protocolo que se presenta aquí se puede aplicar en general a una amplia variedad de muestras de células cultivadas y primario con sólo modificaciones menores. Dependiendo de los requisitos del experimento, se puede realizar de una manera modular cuando ciertos elementos, tales como códigos de barras o de la superficie celular de la tinción, no son necesarios. Utilizado en su totalidad este protocolo permite la preparación de la masa multiplexada citometría de muestras marcadas ...

Discusión

El protocolo aquí presentado se ha empleado con éxito para el tratamiento de varias líneas cultivadas de células (H1 y H9 hESCs, mESCs, MCF7, HEK 293, KBM5, HMEC, MCF10A) y muestras de tejidos primarios (médula ósea de ratón, el hígado embrionario de ratón, ratón adulto hígado, tumor de ratón). Independientemente de la fuente, cualquier tejido que puede ser disociado en las células individuales, preservando el estado celular debe ser susceptibles de análisis por citometría de masa, pero puede requerir alg...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
mTeSR1 medium kit	Stem Cell technologies	05850	Warm at room temperature before use
DMEM F-12	ThermoFisher	11330-032	Warm at 37 °C before use
Accutase	Stem Cell technologies	07920	Warm at 37 °C before use
Bovine serum albumin	Equitech	BAH62
phosphate buffered saline	Hyclone	SH30256.01
Saponin	Sigma-Aldrich	47036
Cell ID Pt194	Fluidigm		Provided at 1 mM
Cell ID Pt195	Fluidigm		Provided at 1 mM
Cell ID Pt196	Fluidigm		Provided at 1 mM
Cisplatin	Enzo Life Sciences	ALX-400-040-M250	Soluble to 25 mg/mL in DMSO
Cell-ID 20-plex Pd Barcoding Kit	Fluidigm	201060
5-Iodo-2'-deoxyuridine	Sigma-Aldrich	I7125	Soluble to 74 mg/mL in 0.2 N NaOH
Rhodium 103 intercelating agent	Fluidigm	201103A
Methanol	Fisher	BP1105-4	Chill at -20 °C before use
Sodium Azide	Sigma-Aldrich	S2002
5 mL round bottom tubes	Falcon	352058
5 mL 35 μm filter cap tubes	Falcon	352235
EQ four element calibration beads	Fluidigm	201078
Hyaluronidase Type I-S	Sigma-Aldrich	H3506
Collagenase from Clostridium histolyticum	Sigma-Aldrich	C9891
Disposable Scalpel #10	Sigma-Aldrich	Z69239