Un filtro de papel sumergido Sandwich para el largo plazo<em&gt; Ex Ovo</em&gt; Time-lapse de pollo temprano embriones

Resumen

Here, we present a new technique to culture chick embryos ex ovo for time-lapse imaging using transmitted light and fluorescence microscopy. The submerged filter paper sandwich is a variant of the well-established filter paper carrier technique¹ that allows for the culturing of chick embryos fully-submerged in a liquid culture medium.

Resumen

Debido a su disponibilidad, bajo coste, la geometría plana, y la transparencia, la ex ovo embrión de pollo se ha convertido en un importante modelo animal vertebrado para el estudio de la morfogénesis eventos, tales como la gastrulación ^2, neurulation ^{3 - 5 de,} somitogenesis ^6, corazón doblado ^{7, 8,} y el cerebro la formación de ^{9 - 13 de,} durante la embriogénesis temprana. La clave para entender los procesos morfogenéticos es seguir de forma dinámica por la imagen de lapso de tiempo. La adquisición de películas a intervalos de polluelo embriogénesis ex ovo se ha limitado ya sea a las ventanas de tiempo cortos o a la necesidad de una incubadora para controlar la temperatura y la humedad en todo el embrión ^14. A continuación, presentamos una nueva técnica para la cultura de pollo embriones ex ovo de alta resolución de imagen de lapso de tiempo utilizando microscopía de luz transmitida. El sándwich de papel de filtro sumergida es una variante de la Techn portador de papel de filtro bien establecidaique (EC-cultivo) ¹ y permite el cultivo de embriones de pollo sin la necesidad de una cámara climática. El embrión se intercala entre dos soportes de papel de filtro idénticos y se mantiene totalmente sumergido en un medio simple, con control de temperatura cubierto por una capa de aceite mineral ligero. A partir de la fase de línea primitiva (Hamburger-Hamilton etapa 5, HH5) ¹⁵ hasta al menos la etapa 28 somitas (HH16) ^15, los embriones pueden ser cultivadas ya sea con su ventral o dorsal hacia arriba. Esto permite la adquisición de películas a intervalos que cubren aproximadamente el 30 hr del desarrollo embrionario. se muestran cuadros y películas a intervalos representativos. Los embriones se comparan morfológicamente a un embrión cultivado en las CE-cultivo estándar.

El sándwich de papel filtro sumergido proporciona un entorno estable para estudiar dorsal principios y procesos morfogenéticos ventrales. También permite la formación de imágenes de fluorescencia en vivo y micromanipulaciones, tales como la microcirugía, imp granolantation, microinyección, el silenciamiento de genes, y la electroporación, y tiene un gran potencial para ser combinados con los objetivos de inmersión para la formación de imágenes basada en láser (incluyendo microscopía de lámina de luz).

Introducción

Embriogénesis ha fascinado al hombre desde el comienzo de la historia. ¿Cómo la estructura y morfología del embrión se desarrollan de manera temporal y espacial, bien definido? El embrión de pollo se ha convertido en uno de los modelos animales vertebrados clásicos para la embriogénesis por varias razones: Es fácilmente disponible, barato, transparente en sus primeras etapas, y accesible para las manipulaciones experimentales, ya que se desarrolla fuera de la madre. Además, tiene una geometría casi plana durante los eventos morfogenéticos tempranas, tales como el corazón y la formación del cerebro, la gastrulación, neurulación, y somitogenesis ^15.

procesos morfogenéticos pueden entenderse mejor si se estudian de forma dinámica, como por ejemplo a través de la adquisición de imágenes con lapso de tiempo. El embrión de pollo se puede visualizar in ovo ¹⁶ pero con mala accesibilidad para las manipulaciones experimentales y visibilidad limitada para obtener imágenes de microscopía de luz de transmisión. Por lo tanto, cortarAL técnicas se han propuesto a los embriones de pollo de cultivo ex ovo, ya sea en sistemas de cultivo de yema enteros ^{13,17 - 19} o como cultivos de explantes ^{de 1,20 - 23.} En sistemas de cultivo de yema de enteros, el embrión permanece en la parte superior de la yema intacta, y todo el contenido del huevo se transfiere a otro recipiente para la incubación. Este recipiente puede ser una cáscara de huevo sustituto ^17, una placa de Petri ^{de 19,} o una hamaca hecha de plástico se aferran abrigo ^13,18. Los embriones en cultivos de yema enteros pueden ser, idealmente, se cultivaron hasta la eclosión y son accesibles a micromanipulaciones. Estas técnicas son especialmente útiles para el estudio del desarrollo de los embriones después de la iniciación de la circulación de la sangre (que aumenta el contraste), mientras que los embriones más jóvenes permanecen difícil de visualizar. Estos embriones tempranos se pueden obtener imágenes mejor si se escindieron de la yema y se cultivaron como explantes in vitro. Los explantes son fácilmente accesibles para el experimentoAL manipulaciones y requieren menos espacio para el cultivo. Durante muchos años, una técnica iniciada por Denis nuevo en 1955 y sus variaciones fueron las normas de oro de los métodos de cultivo de explantes de embriones de pollo, con lo que el embrión accesible para la microscopía de lapso de tiempo y las intervenciones de microcirugía ^20,21. A pesar de su gran éxito, la técnica de nuevo es relativamente exigente y consume mucho tiempo. Blastodermo menudo se separa cuando la membrana vitelina, que lleva el blastodermo, se estira alrededor de un anillo de vidrio para lograr la tensión adecuada ^1. Por otra parte, el embrión sólo puede ser cultivado con su lado ventral hacia arriba. El cultivo CE (Early polluelo), una técnica más reciente desarrollada por Chapman y Collignon ^1, evita el estiramiento de la membrana vitelina mediante el uso de un soporte de papel de filtro con una abertura central. El papel de filtro se une a la membrana vitelina, lo cual mantiene su tensión natural, y rodea al embrión como un cuadro ^1.Los embriones se cultivan a continuación en una parte inferior de agar-albúmina, por lo general con su lado ventral hacia arriba. El cultivo dorsal hacia arriba parece sólo es posible para los embriones en HH8 ¹⁵ años o más. Muchos grupos han adaptado el soporte de papel de filtro para sus necesidades, tales como mediante la sustitución de la parte inferior agar-albúmina con un soporte hecho a partir de fibras de sutura quirúrgica ²⁴ o un colágeno de la membrana ²⁵ recubierto. A menudo, los embriones cultivados con la técnica de Nuevo o con la cultura CE están expuestos, con su aleta dorsal o ventral de aire para facilitar la difusión de oxígeno ^{de 1,20.} Estos cultivos de explantes tienen que ser mantenidos en una atmósfera humidificada para evitar la evaporación del medio y para evitar que el embrión se sequen. Esto se consigue mediante la incubación de la cápsula con la cultura explante en un plato más grande de Petri que contiene un pañuelo de papel humedecido ^1. La adquisición de imágenes con lapso de tiempo de estos embriones requiere o bien el uso de una incubadora con temperatura controlada alrededor de todo el microscopio o un temperamentoATURALEZA controlado recipiente con una tapa térmica para evitar la condensación en la trayectoria luminosa ^14. Sin embargo, los embriones de pollo también pueden desarrollar ex ovo completamente sumergido en medio de cultivo en forma de cultivos de papel de filtro ^25, emparedada entre una capa de aceite mineral pesado y la albúmina en adaptaciones de la técnica de New ^2,21, o como explantes blastoderm plegables en la "Cornish Pasty Cultura ^"23,26, sin contacto directo con el aire.

El sándwich de papel de filtro sumergido es una nueva variante de la técnica de soporte de papel de filtro. Al combinar el conocimiento anterior sobre el cultivo de embriones de pollo ex ovo, hace que la incubadora de temperatura controlada y la tapa térmica prescindible. El embrión se intercala entre dos portadores de papel idéntico (cortado con láser) ^de filtro ²⁴ y se cultivaron totalmente sumergido en un medio de cultivo sencillo (Pannett-Compton solución salina ^27,28 y albúmina fina en una proporción de 3: 2) en una temperatura controlada contenerer. Una capa de aceite mineral ligero que flota en la parte superior del medio impide ^2,21 evaporación y minimiza la pérdida de calor al ambiente. El fondo del contenedor tiene una ventana de vidrio, y toda la configuración se lleva a cabo en un microscopio distancia zoom largo de trabajo en posición vertical. Esta configuración permite la adquisición de alta resolución de campo claro y campo oscuro películas a intervalos de aproximadamente 30 h de desarrollo embrionario, que van desde la etapa temprana línea primitiva a la etapa 28 somitas (equivalente a las etapas de Hamburger y Hamilton 5 a 16, HH5-16 ) ^15. Los embriones pueden cultivarse igualmente bien con su ventral o dorsal hacia arriba. Por lo tanto, los embriones son accesibles a la observación y manipulación de ventral (por ejemplo, ^7,8 cardíaca temprana y somitogenesis ⁶⁾ y dorsal (por ejemplo, a finales de la gastrulación ^2, cierre del tubo neural ^{3 - 5 de,} y principios de cerebro ^{9 - 13 de)} el desarrollo. El filtro sumergido papel sándwich provides un entorno sencillo y estable para la microcirugía, la implantación de bolas, la microinyección, el silenciamiento de genes, y los estudios de electroporación. Su potencial de formación de imágenes puede ser empujado mucho más mediante el uso de imágenes basado en láser (incluyendo microscopía de hoja de luz) y objetivos de inmersión.

Protocolo

Todos los procedimientos experimentales se realizaron de acuerdo con los experimentos en los Países Bajos Ley de Animales.

NOTA: El método del papel de filtro sumergido sándwich se modifica ^a partir del ^1.

1. Filtro de papel sumergido Preparación Sandwich

1. Pannett-Compton (PC): solución salina ^27,28
   1. Preparar soluciones madre A (1 L de ultrapura H ₂ O, 121 g de NaCl, 15,5 g de KCl, 10,42 g de CaCl ₂ · H ₂ O, y 12,7 g de MgCl ₂ · 6H ₂ O) y B (1 L de ultrapura _H2O, 2,365 g de Na ₂ HPO ₄ · 2H ₂ O y 0,188 g de NaH ₂ PO ₄ · 2H ₂ O) en botellas de 1 l limpias. Almacenarlos a 4 ° C.
   2. Preparar 1 L de PC-solución salina mezclando 900 ml de ultrapura H ₂ O con 40 ml de solución madre de A y 60 ml de la solución madre B (en este orden para evitar la precipitación). Preparar fr recién PC-solución salinaom soluciones madre A y B cada semana.
      NOTA: Las soluciones madre se pueden almacenar a 4 ° C durante varios meses. El tratamiento en autoclave y / o la adición de antibióticos o antimicóticos no son necesarios.
2. La incubación de los huevos de gallina fertilizados
   1. En un incubador humidificado, poner los huevos de su lado y los incuban a 37,5 ° C hasta que alcancen la edad deseada.
      NOTA: Guarde los huevos no más de dos semanas (preferiblemente a 12 - 15 ° C) antes de la prueba, ya que el porcentaje de nacimientos disminuirá significativamente
3. Portadoras de papel de filtro (adaptado de ¹⁾
   1. Si está disponible, utilice una máquina de corte láser para cortar las compañías de papel de filtro con forma de reloj de arena de papel de filtro grueso (28 mm x 22 mm). Taper la anchura en el centro de 22 mm a 10,4 mm. Cortar una abertura elíptica central (10,6 mm x 5,5 mm), con el eje más largo de la elipse orientada paralela al lado mayor de la portadora de papel de filtro (Figura 1-M).
      1. Opcionalmente, preparar una plantilla de cartón con las dimensiones correctas y transferir su contorno y la de la abertura central de papel de filtración de espesor con un lápiz. Cortar el soporte de papel de filtro con unas tijeras finas.
   2. Cortar dos soportes de papel de filtro idénticos para cada embrión para ser explantado. Preparar las compañías de papel de filtro adicionales como respaldo en caso de un embrión se pierde durante la explantación.
4. Con control de temperatura del baño de aceite (en el día del experimento)
   1. Colocar el vaso de precipitados con control de temperatura en el centro de la xy platina motorizada del microscopio zoom en posición vertical y conectar el vaso de precipitados a su controlador de temperatura.
   2. Ponga cuatro anillos grandes de acero inoxidable (30 mm de diámetro exterior, 4 mm de alto, 1,5 mm de espesor de pared) en una placa de 6 cm Petri para actuar como pesos y colocar el plato en el centro del vaso de precipitados con control de temperatura.
      NOTA: Este plato Petri simplemente sirve como un marcador de posición para ajustar el aceite level.
   3. Llenar el vaso de precipitados con control de temperatura con 130 ml de aceite mineral ligero. Ajuste el nivel de aceite si es necesario de modo que termine aproximadamente 3 mm por debajo del borde superior de la 6 cm placa de Petri.
   4. Retire la placa de Petri de 6 cm desde el vaso de precipitados con control de temperatura y ajustar la temperatura a 40 ° C.

2. Filtro de papel sumergido Sandwich Producción

1. El medio de cultivo (en el día del experimento)
   1. Verter 30 ml de PC-solución salina (como se ha preparado en los pasos 1.1.1 a 1.1.2) en un tubo de centrífuga de 50 ml. Preparar un tubo de centrífuga de 50 ml llenado con 30 ml de PC-solución salina por cada dos embriones a ser explantado.
   2. Con cuidado, romper un huevo no incubados en una placa de Petri de 10 cm.
   3. Cosecha de albúmina fina moviendo una pipeta de transferencia de plástico a lo largo de las paredes de la placa de Petri y la succión en la albúmina fina. Recoger 30 ml albúmina fina en un tubo de centrífuga de 50 ml por cada dos embriones a ser explantado. Asegúrese de obtener sólo el thin albúmina.
      NOTA: Por lo general, 3 - 4 huevos permiten la cosecha de alrededor de 30 ml de albúmina fina.
   4. Verter 20 ml de albúmina fina en cada PC-rellenos de solución salina 50 ml tubo de centrífuga (tal como se preparó en el paso 2.1.1).
   5. Mezclar la PC-solución salina con la albúmina fina invirtiendo suavemente los tubos varias veces. Se deja reposar durante varios minutos y comprobar si la mezcla, llamado medio de cultivo a partir de aquí, está claro. Si el medio de cultivo no está claro, preparar fresca PC-salina de la solución madre y la cosecha de albúmina fina frescas.
2. Coloque dos pequeños anillos de acero inoxidable (20 mm de diámetro exterior, de 4 mm de altura, espesor de pared de 1,5 mm, 6,5 mm hueco en el anillo) tan distantes como sea posible en un nuevo máximo de 6 cm placa Petri de plástico y llenarlo con 22 ml de cultivo medio (como se ha preparado en los pasos 1.4.1 a 1.4.4) usando una pipeta de plástico 25 ml (Figura 1-H). Asegúrese de que los residuos acumulados en la parte superior del medio se mantiene en el tubo de centrífuga.
3. Eliminar los residuos or burbujas a partir del medio utilizando una pipeta de transferencia de plástico.
4. Llenar un plato de 10 cm de Petri con 75 ml de PC-solución salina (para ser utilizado en el paso 2,15).
5. Retirar un huevo de la incubadora y se deja reposar en el banco en su lado durante 1 minuto para dejar que el embrión llega a la parte superior de la yema.
6. Con cuidado, romper el huevo en una placa de Petri (Figura 1-A). Remojar el borde de un pedazo de papel de seda fina en las albúmina gruesa y centrar el blastodermo tirando, si es necesario.
7. Eliminar la mayor parte de la albúmina delgado y grueso de la placa de Petri con una pipeta de transferencia de plástico (con la punta cortada para facilitar la absorción de las albúmina gruesa).
8. Crear una ventana en la albúmina gruesa alrededor del embrión frotando suavemente las albúmina gruesa con un trozo de papel de seda, alejándose del centro (Figura 1-B). Evitar que el papel de seda se adhiera a la membrana vitelina.
9. Con unas pinzas, cuidadosamente coloque un soporte de papel de filtro en la Vitemembrana lline alrededor del embrión, con el eje más largo de la abertura elíptica paralelo al eje anterior-posterior del embrión (Figura 1-C).
10. Pellizcar una punta de las tijeras de uñas a través de la membrana vitelina cerca del soporte de papel de filtro y cortar rápidamente por todo el portador de papel de filtro (Figura 1-D).
11. El uso de pinzas, levantar el portador de papel de filtro fuera de la yema de huevo en una dirección oblicua paralela al eje anterior-posterior del embrión (Figura 1-E).
12. Gire el soporte de papel de filtro en torno a tener la cara ventral del embrión en la parte superior y sumergirlo en el PC-solución salina. Sumergir el soporte de papel de filtro a lo largo del eje anterior-posterior del embrión en una dirección oblicua.
13. Deshacerse de toda la yema todavía unida la membrana vitelina y blastodermo lavando suavemente con PC-solución salina de una pipeta de transferencia de plástico. Mantenga la totalidad del soporte de papel de filtro sumergido a unall veces (Figura 1-F).
14. Retire el soporte de papel de filtro de la PC-solución salina a lo largo del eje anterior-posterior del embrión en una dirección oblicua y deshacerse del exceso de líquido taponando el borde del soporte de papel de filtro en un papel de seda.
15. Mantenga el papel de filtro en posición horizontal, con el lado ventral del embrión hacia arriba, y colocar otro portador de papel de filtro en la parte superior de la primera, el uso de un segundo par de pinzas. Sus aberturas deben coincidir exactamente, intercalando de ese modo el embrión entre las dos capas de papel de filtro (Figura 1-G).
16. Inmediatamente sumerja el sándwich de soporte de papel de filtro en el medio de cultivo en una dirección oblicua a lo largo del eje-posterior-anterior del embrión. Colocarlo en la zona que abarca el espacio entre los dos anillos de acero (Figura 1-H).
17. Fijar el sándwich de papel de filtro mediante la colocación de dos más anillos de acero en la parte superior de los otros dos, asegurándose de que la abertura con el correombryo permanece completamente cubierto (Figura 1-I).
18. Compruebe el nivel medio y asegurarse de que el espaciador superior se acaba sumergido en el medio. Si es necesario, añadir o eliminar pequeñas cantidades de medio.
19. Con cuidado, coloque la placa de Petri en el centro del baño de aceite de temperatura controlada y estabilizar el plato lateralmente mediante la colocación de tres grandes anillos de acero inoxidable (diámetro 30 mm exterior, 4 mm de alto, 1,5 mm de espesor de pared) al lado del plato en el aceite . Asegúrese de que los anillos de acero tocan los bordes del plato (Figura 1-J).
20. Pipetear lentamente aproximadamente 6 ml de aceite mineral ligero en la parte superior del medio con una pipeta de transferencia de plástico, de modo que el medio está cubierto con una capa continua de aceite mineral (Figura 1-K).
21. Configurar la adquisición de lapso de tiempo.
    NOTA: imágenes de los embriones como panorámicas horizontales de cinco sub-imágenes superpuestas (azulejos) permite obtener imágenes detalladas (objetivo 5X), con un Overvi generalesew de la morfología ^29-30. Intervalos de imagen entre 3 y 10 minutos permiten el seguimiento detallado de los cambios morfológicos ^{de 31 años,} y la adquisición de pequeñas z-pilas (de cinco a siete diferentes planos con una distancia de 30 micras) compensa la mayor parte del engrosamiento y giro del embrión ³⁰ . Z-planos con el mayor contraste se pueden seleccionar antes del procesamiento adicional de ³² cuadros para formar películas a intervalos (véase la sección Resultados Representante para obtener información detallada sobre la adquisición de imágenes).

Figura 1: Configuración de la Sumergido Sandwich papel de filtro. (A) Un huevo se quebró en una placa de Petri. (B) La mayoría de la albúmina gruesos y finos se retira de la placa de Petri con una pipeta de transferencia de plástico (no mostrado). A continuación, se crea una ventana en la albúmina gruesa unaalrededor del embrión frotando suavemente las albúmina gruesa con un pañuelo de papel. Soporte de papel (C) Un filtro se coloca alrededor del blastodermo en la parte superior de la yema. (D) El soporte de papel de filtro se corta suelto de la membrana vitelina que rodea y (E) retirado de la parte superior de la yema. (F) La yema restante se lava cuidadosamente en un baño de PC-solución salina. (G) El embrión se intercala con un segundo soporte de papel de filtro idénticos. (H) El sándwich de papel filtro se sumerge en el medio y se coloca en los anillos de acero inoxidable de dos metales (embrión dorsal frente o de lado ventral hacia arriba). (I) dos anillos estabilizan el sándwich de la parte superior. (J) La placa de Petri que contiene el embrión se transfiere al baño de aceite de temperatura controlada. anillos de acero inoxidable estabilizan lateralmente la placa de Petri. (K) El medio de cultivo se cubre con una capa de aceite mineral.(L) Esquema del sándwich de filtro sumergido. (M) Las dimensiones de los soportes de papel de filtro utilizados para el sándwich de papel de filtro sumergido. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Resultados

Figura 2: Comparación morfológica entre los embriones en cultivo CE ¹ y en Sumergida Papel de filtro Sandwich Cultura. marcos con lapso de tiempo seleccionados muestran los embriones a intervalos de 3 horas. Las tramas se cambian de tamaño para dar una visión general de la morfología del embrión completo. Los embriones fueron emparejados por edad a la etapa 7 somitas (HH9) ^15. 0 hr indica el inicio de cada experimento. Anterior es siempre a la izquierda. Las imágenes fueron adquiridas mediante la iluminación de campo oscuro. (A) de embriones en cultivo CE ^1, culta lado ventral hacia arriba sobre un agar-albúmina inferiores ^{a 1,33.} Imágenes de alta calidad pueden ser adquiridas, como el embrión está confinado en la dirección z. (B y C) Dos embriones cultivados en el sándwich de papel de filtro sumergido: (B) lado ventral y (C) dorsal hacia arriba.Los embriones en el sándwich de papel filtro se desarrollan sin diferencias cualitativas durante al menos 27 horas. Desarrollan la circulación sanguínea funcional y flexión craneal y cervical y se convierten con éxito. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

adquisición de lapso de tiempo depende del sistema de microscopio disponible. En este estudio, una larga distancia de trabajo, se utilizó el microscopio zoom vertical. El factor de zoom se establece en 5X. En combinación con la ampliación 16X del ocular, esto dio lugar a 80X de ampliación total, con una resolución teórica de 1,3 m / pixel (como se indica en el software de microscopio) ^30. Para aumentar el campo de visión, los embriones fueron imágenes panorámicas horizontales como de cinco sub-imágenes (azulejos). Por lo tanto, una región de baldosas, que consta de cinco baldosas superpuestas, se definió ^29. Esta región azulejofue posicionado de manera que cubra completamente la abertura elíptica del soporte de papel de filtro en su extensión horizontal (Figura 2B - 0 hr). Cada baldosa tenía un tamaño de 2.048 x 2.048 píxeles, que cubre un campo de visión de aproximadamente 2,7 mm, y las baldosas se adquirieron con un solapamiento de 10%, resultando en total del campo de visión de aproximadamente 12 mm x 2,7 mm para el panorama. El xy platina motorizada mueve con respecto al objetivo con una velocidad de aproximadamente 1,75 mm / sec entre la adquisición de las baldosas separadas ^29. La imagen en directo se centró en el mesodermo presomitic anterior y los somitas más formadas recientemente (el enfoque de la investigación de nuestro grupo). Para compensar el engrosamiento y la curvatura de los embriones en la dirección z, z-pilas pequeñas (de cinco a siete planos diferentes, con una distancia de 30 micras) fueron adquiridas en cada punto de tiempo ^30. Estos fueron seleccionados alrededor del plano focal de la punta anterior del mesodermo presomitic. La duración del intervalo de tiempo ACQuisition se fijó a 50 h, y los intervalos de imágenes de 3, 4, o 10 min se eligieron ^31. La calidad de la adquisición de lapso de tiempo podría mejorarse mediante la reorientación de cada de 5 - 10 h, y la redefinición de la pila Z alrededor del nuevo plano focal óptima. Al final del experimento, toda la serie de tiempo fue editado manualmente, y subconjuntos de imágenes que contienen el plano z con el mejor enfoque se crea y se guarda en una carpeta independiente ^32. Estos subconjuntos de imágenes fueron el tiempo cosido para crear una serie temporal completa de imágenes con enfoque óptimo. Las fichas de cada imagen de esta serie de tiempo completo se cosen y se fusionan juntos sin corrección de sombreado ^30, y los marcos de lapso de tiempo se exportan como imágenes JPEG de tamaño 100% y el 95% de compresión ^32. Los marcos de lapso de tiempo se importan como una secuencia de imágenes en el software de edición de vídeo profesional. Las detalladas 100% zooms se estabilizaron, y el contraste total se ajustó a nuestro gusto. Los últimos tiempos de lapsos eran codificard con el códec H.264 y exportados en formato MPEG-4 contenedores. Las películas se muestran a una velocidad de 15 fotogramas / segundo (fps) y una resolución de 1.920 x 1.080 píxeles.

La Figura 2 muestra una comparación entre un embrión en CE cultura ¹ (Figura 2A) y dos embriones en el cultivo de papel de filtro sumergido sándwich, uno de haber sido cultivadas lado ventral hacia arriba (Figura 2B) y el otro lado uno dorsal (Figura 2C). Todos los embriones fueron a los siete somite etapa (HH9) ¹⁵ y la imagen con una resolución temporal de 4 minutos (Figura 2A y B) o 10 min (Figura 2C) de la misma edad. Los cuadros seleccionados de intervalos de 3 horas se representan. El cultivo CE (Figura 2A) permitió imagen muy estable debido a que el embrión se reclina sobre un agar estables albúmina inferiores ^{a 1,33.} Todo el embrión se mantuvo en un plano focal a lo largo de tse entera de lapso de tiempo. Esto podría ser beneficioso para los experimentos más cortos (varias horas) y embriones muy tempranos, pero viene con una fuerte confinamiento del embrión en la dirección z, posiblemente impidiendo su éxito en el desarrollo de tres dimensiones en el largo plazo. En el principio, el confinamiento sólo dio lugar a un ligero aplanamiento lateral de la cabeza del embrión en comparación con un embrión cultivaron en el sándwich de papel de filtro sumergido con su lado ventral hacia arriba (comparar Figura 2A y 2B en 0 hr). Más tarde, se deteriora el giro de la cabeza (Figura 2 A - 21 horas) y el latido del corazón se ralentizó. circulación de la sangre casi se detuvo. Ver Suplementario película 1 para el lapso de tiempo completa del embrión en la cultura de la CE. El panel superior en esta película muestra una visión completa del embrión, mientras que el panel de la izquierda inferior visualiza el desarrollo del corazón en la resolución completa. La segmentación del mesodermo presomitic en somitas puede ser seen detalle en la parte inferior derecha.

Los embriones en el sándwich de papel de filtro sumergido, por otro lado, fueron limitados en su expansión tridimensional sólo por la tensión natural de las membranas que rodean ellos. Podrían ser cultivadas ya sea con su ventral (Figura 2B) o el lado dorsal hacia arriba (Figura 2C). De cualquier manera, los embriones mostró somitogenesis continua, y las cabezas vueltas. Desarrollaron flexión craneal y cervical y la circulación sanguínea funcional. Tanto los embriones en el sándwich de papel filtro se obtuvieron imágenes con el foco en el mesodermo de segmentación, de manera que las partes de la cabeza se movió poco a poco fuera de foco como los embriones crecieron, engrosadas, y comenzaron a girar, mientras que la parte segmentación del mesodermo se mantuvo en el foco (comparar Figura 2B y 2C a las 21 horas a 27 horas). Película suplementario 2 muestra la película de lapso de tiempo completa del embrión representadoen la Figura 2B. El intervalo de imagen fue de 4 min. El panel superior de esta película muestra una visión completa del embrión. El desarrollo del embrión fue fotografiada consecutivamente durante 46 horas, pero después de aproximadamente 30 horas, el foco en el mesodermo segmentación se perdió debido al engrosamiento general y giro del tejido embrionario. El panel inferior izquierdo muestra el desarrollo temprano del corazón en la resolución completa de los marcos de lapso de tiempo adquiridos. A través de la fusión de los primordios cardiaca emparejado en ambos lados de la línea media, se forma una estructura tubular casi recta, que más tarde comienza a latir y doblado a la derecha. El panel inferior derecho muestra el mayor número de somitas formadas recientemente y la punta anterior del mesodermo presomitic en alta resolución y seguimiento de la formación de nuevos somitas lo largo del tiempo. Película suplementario 3 muestra otro embrión cultivado y fotografiado lado ventral hacia arriba en el sándwich de papel filtro sumergido. El intervalo de imagen fue de 4 min. La película cubre THel desarrollo del embrión e de la etapa HH5-6 aproximadamente etapa HH14 ^15, más o menos 27 horas de tiempo de cultivo. La cabeza doblez formas y progresa en sentido posterior. El corazón se forma a partir de su primordios bilateral, comienza a latir, y dobla a la derecha. Los primeros tres a cuatro somitas se forman simultáneamente. somitas adicionales desprenden de forma secuencial desde la punta anterior del mesodermo presomitic. El panel inferior muestra la región de la cabeza del embrión en resolución completa, permitiendo la observación del pliegue cabeza y la formación del corazón temprano en gran detalle. Debido a la transparencia del embrión, el cierre del tubo neural se puede observar en el futuro región de la cabeza. Suplementario Película formación de somite 4 pantallas en el mismo embrión en su totalidad la resolución sobre la imagen en tiempo completo en el panel inferior. Película suplementario 5 muestra el lapso de tiempo completa del embrión dorsal cultivadas hacia arriba (Figura 2C). El intervalo de imágenes fue de 10 min. Mientras que la UPPer panel muestra el desarrollo del embrión a partir de los siete somite etapa (HH9) a aproximadamente etapa HH16-17, el panel inferior se recorta para mostrar los cambios morfológicos en el cerebro temprano en esa etapa de resolución completa. La inflamación local del tubo neural se puede observar, lo que lleva a la regionalización del prosencéfalo, el mesencéfalo y rombencéfalo, que se dividirá en las cinco subregiones del cerebro embrionario en etapas posteriores ^13. Además, el crecimiento de las vesículas ópticas se puede ver claramente. Después de aproximadamente 30 horas en cultivo, el embrión se está muriendo.

Para mostrar la compatibilidad de la sándwich de papel de filtro sumergido con manipulaciones de microcirugía, varias microperlas de poliestireno (~ 40 m de diámetro) se implantaron en o en las proximidades del mesodermo presomitic de un embrión de pollo en el cultivo de papel sándwich de filtro sumergido. Las microperlas se lavaron en PBS para eliminar el tampón de almacenamiento y IMPlanted antes de cubrir el medio de cultivo con la capa de aceite mineral ligero (comparar con el paso 2.18 de la sección de protocolo). Una pipeta Pasteur de vidrio se utiliza para transferir las perlas a la superficie de embriones, en observación a través de los oculares del microscopio. Cinco hoyos fueron creados en el endodermo raspando suavemente con una aguja de acupuntura. Una herramienta en forma de J a medida, creado por estiramiento y plegado de una pipeta Pasteur de vidrio en una llama, se usa para manipular las perlas y empuje con cuidado en los agujeros hasta que se convirtieron inmóvil. Tres agujeros se llenaron con una perla cada uno (Figura 3A - 3B 0 h, y *) y dos agujeros con dos bolas cada uno (Figura 3 A - 0 hr). La figura 3A muestra, en marcos de lapso de tiempo seleccionados, el desarrollo del embrión de pollo después de la implantación de microcirugía de las perlas. Tres bolas fueron incorporados con éxito en el tejido en el lugar deseado, y su movimiento fue fotografiada sobre elcurso del experimento en gran detalle (Figura 3B). No pareció verse afectada por la manipulación o la presencia de las perlas del desarrollo del embrión. Ver Suplementario película 6 para la película completa de lapso de tiempo. El intervalo de imagen fue de 4 min.

Figura 3: Time-lapse después Microbead implantación. La prueba de principio experimento que muestra la compatibilidad de la sándwich de papel de filtro sumergido con implante de microperlas. La cabeza del embrión está a la izquierda, pero no fue fotografiada durante este experimento. Las imágenes fueron adquiridas mediante la iluminación de campo oscuro. (A) seleccionado de lapso de tiempo marcos que muestra el embrión manipulado a intervalos de 3 horas después de la implantación de siete microperlas (~ 40 m de diámetro). El embrión alargada y continua formada somit adicionalES. Tres bolas parecen haber sido correctamente instalado y se movió en sentido medial con el flujo de tejido de más de 18 horas de cultivo. Las otras cuatro cuentas salieron de sus agujeros de entre 6 y 9 horas de cultivo y se dejó posteriormente. (B) Vista detallada de las tres perlas individuales (B1 a B3) implantado en el mesodermo presomitic al inicio del experimento (0 h, B *) y después de 12 horas de incubación (B **). El número de los somitas just-forman se indica (S9 en B * y S18 en B **). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Suplementario Película 1: EC-cultura ventral hacia arriba. Embrión en cultivo CE ^1, culta lado ventral hacia arriba, desde la etapa de siete somitas (HH9) ¹⁵ en adelante en una Botto agar-albúminam ^1,33. El intervalo de imagen fue de 4 min. El tiempo relativo se muestra en la esquina superior izquierda. Imágenes de alta calidad podrían ser adquiridas, como el embrión fue confinado en la dirección z. Después de 21 horas, el latido del corazón y el flujo sanguíneo casi fueron detenidos y el embrión se habían empezado a desintegrarse. El panel superior muestra una visión general el cambio de tamaño del embrión, mientras que los paneles inferiores visualizar el desarrollo del corazón (panel izquierdo) y la segmentación del mesodermo presomitic (panel derecho) en resolución máxima (100% de zoom). (Haga clic derecho para descargar).

Película suplementario 2: Filtro sumergido Sandwich del papel Hasta lado ventral. De embriones cultivados en el sándwich de papel sumergido desde la etapa de siete somitas (HH9) ¹⁵ en adelante, sid ventrale hacia arriba. El intervalo de imagen fue de 4 min. El tiempo relativo se muestra en la esquina superior izquierda de la FC y el mínimo, el reinicio después de 24 horas. El panel superior muestra una visión general redimensionada del desarrollo del embrión durante 46 horas, de forma consecutiva. El panel inferior izquierdo visualiza el desarrollo del corazón temprano durante las primeras 10 h de la adquisición de imágenes en resolución máxima (100% de zoom). El panel inferior derecho representa la segmentación del mesodermo durante aproximadamente 30 h de desarrollo en resolución máxima (100% de zoom) hasta que el enfoque se pierde debido al engrosamiento general y torneado de tejido embrionario. (Haga clic derecho para descargar).

Película suplementario 3: Cabeza Fold Formación. De embriones cultivados lado ventral hacia arriba en el sándwich de papel filtro sumergido desde el quead-process / etapa de la cabeza veces (HH5-6) ¹⁵ hasta aproximadamente la etapa 22 somitas (HH14) ¹⁵ durante aproximadamente 27 horas de tiempo de cultivo. El intervalo de imagen fue de 4 min. El tiempo relativo se muestra en la esquina superior izquierda de horas y minutos, el reinicio después de 24 horas. El panel superior muestra una visión general redimensionada del desarrollo del embrión. El panel inferior muestra la región de la cabeza del embrión en resolución máxima (100% de zoom). se puede observar la formación del pliegue cabeza y el corazón temprana y el cierre del tubo neural. (Haga clic derecho para descargar).

Película suplementario 4: somitogenesis. De embriones cultivados lado ventral hacia arriba en el sándwich de papel filtro sumergido desde el / la cabeza veces escenario al proceso de la cabeza (HH5-6) ¹⁵aproximadamente a la etapa 22 somitas (HH14) ¹⁵ durante aproximadamente 27 horas de tiempo de cultivo. El intervalo de imagen fue de 4 min. El tiempo relativo se muestra en la esquina superior izquierda de horas y minutos, el reinicio después de 24 horas. El panel superior muestra una visión general redimensionada del desarrollo del embrión. El panel inferior muestra el mesodermo paraxial segmentar en resolución máxima (100% de zoom). (Haga clic derecho para descargar).

Película suplementario 5: Filtro sumergido Sandwich del papel Hasta lado dorsal. Embrión lado dorsal cultivadas en el sándwich de papel filtro sumergido de la somite etapa siete (HH9) ¹⁵ hasta aproximadamente la etapa HH16-17 ^15. El intervalo de imágenes fue de 10 min. Se muestra el tiempo relativoen la esquina superior izquierda de la FC y el mínimo, el reinicio después de 24 horas. El panel superior muestra una visión general redimensionada del desarrollo del embrión. El panel inferior muestra los cambios morfológicos en el cerebro temprano en resolución máxima (100% de zoom). El embrión murió después de aproximadamente 30 horas en cultivo. (Haga clic derecho para descargar).

Película suplementario 6: microperlas implantados. Embryo cultivaron lado ventral hacia arriba en el sándwich de papel de filtro sumergido durante aproximadamente 19 horas, a partir de la etapa de somite nueve (HH9-10) ^15. El intervalo de imagen fue de 4 min. El tiempo relativo se muestra en la esquina superior izquierda de horas y minutos. El panel superior muestra una visión general el cambio de tamaño de la región de la cola con siete microperlas implantan en el prmesodermo esomitic. El panel inferior muestra la región con microperlas implantadas en resolución máxima (100% de zoom). (Haga clic derecho para descargar).

Discusión

Como una nueva variante de la cultura CE bien ^{establecida-1,} el sándwich de papel filtro sumergida facilita la adquisición de campo claro y campo oscuro películas de lapso de tiempo a largo plazo de la temprana del embrión de pollo ex ovo haciendo una temperatura y humedad controlada alrededor de la incubadora el microscopio prescindible. En lugar de ser cultivadas en un semi-sólido inferior agar-albúmina, los embriones se mantienen totalmente sumergidos en un medio de cultivo simple que consiste en PC-solución salina y albúmina fina. La evaporación y la pérdida de calor se reducen al mínimo por una capa de aceite mineral flotando en la superficie del medio de cultivo. Los embriones pueden cultivarse fácilmente, ya sea dorsal o lateral ventral hacia arriba, sin diferencias visibles en la calidad. Como se muestra aquí, los embriones en el sándwich de papel filtro sumergido son accesibles para intervenciones de microcirugía, como la aplicación de los granos de morfogenes empapado. Las futuras aplicaciones incluyen fluorescencia en vivo de imágenes, microinyección y electroporación, y silenciamiento de genes a manipulate y el estudio de una amplia gama de eventos morfogenéticos durante el desarrollo ventral (por ejemplo, corazón temprano y somitogenesis) y dorsal (por ejemplo, la gastrulación tardía, cierre del tubo neural, y principios del cerebro). Un tratamiento con fármacos dependiente del tiempo es factible si la placa de Petri que contiene el sándwich de papel de filtro se reemplaza con una cámara de perfusión, que permite el intercambio del medio de cultivo por debajo de la capa de aceite mineral. El filtro de papel sándwich sumergida va a desarrollar su potencial completo de imágenes en combinación con imágenes basado en láser (incluyendo microscopía de hoja de luz) y objetivos de inmersión.

Algunas dificultades con la preparación del bocadillo de papel de filtro sumergido se abordarán en los siguientes párrafos. A pesar de que requiere sólo una cantidad moderada de la formación para transferir un embrión de la yema en el sándwich de papel de filtro, varios pasos todavía pueden influir significativamente en la calidad del embrión en el cultivo. Antes de que el portador de papel de filtro escolocado en la yema de huevo, la membrana vitelina en todo el embrión debe ser liberado de cualquier albúmina de espesor. Sólo entonces la conexión entre el papel de filtro y la membrana vitelina ser lo suficientemente fuerte para soportar el lavado en PC-solución salina. El papel de filtro que lleva el embrión debe cruzar la interfaz líquido / aire lo menos posible para reducir al mínimo la tensión en las membranas. Una vez introducidos en el PC-solución salina para lavar, todo el portador de papel de filtro debe estar completamente sumergido en todo momento. El tiempo en el baño de PC-solución salina debe limitarse a aproximadamente 30 - 60 seg, como la membrana vitelina se iniciará la liberación del papel de filtro. Aún así, la limpieza del embrión debe ser ejecutado muy a fondo, como restos de yema posteriormente ocultar la vista del embrión. Durante el lavado, nunca apunte la corriente de la pipeta de transferencia directamente sobre el embrión, pero siempre radialmente fuera de ella. Después de la eliminación del embrión desde el PC-solución salina, asegúrese de mantener el papel de filtro en posición horizontal para reducir al mínimola tensión en las membranas embrionarias. Entonces, estabilizar el embrión con el segundo soporte de papel de filtro. Una vez que se coloca el segundo portador de papel de filtro, evitar la creación de cualquier tensión lateral, lo que podría cambiar los soportes de papel de filtro con relación a otra y desgarrar las membranas embrionarias. Cuando el sándwich de papel de filtro se pone en el medio de cultivo, sino que también debe cruzar la interfaz aire / líquido sólo una vez para minimizar la tensión en las membranas. El segundo par de anillos de acero inoxidable utilizados para estabilizar el sándwich de papel de filtro de la parte superior debe ser colocado muy lentamente y sin ningún tipo de presión para reducir al mínimo la compresión de las membranas embrionarias. Pequeñas rupturas de la zona opaca del embrión normalmente se curan durante la primera hora de la cultura, sino un embrión dañado pueden y deben siempre ser reemplazados por una nueva muestra antes de la capa de aceite se pipeta en la parte superior del medio de cultivo.

A la imagen de un embrión completo o varias muestras para alta resolución películas a intervalos, el micrófonoROSCOPE debe estar equipado con un xy platina motorizada, controlado por el software microscopio. Es de crucial importancia para que el movimiento xy escenario con una velocidad mínima para evitar daños a los embriones y turbulencias en el medio de cultivo y el aceite, lo cual disminuirá la calidad de la imagen. Para la adquisición de las películas a intervalos presentados aquí, xy platina motorizada movía con una velocidad aproximada de 1,75 mm / seg. En el futuro, la imagen podría mejorarse aún moviendo primero la etapa en la posición deseada y la adquisición de la imagen después de un breve período de descanso para permitir que las vibraciones y las turbulencias se desvanecen.

Como limitación, los usuarios potenciales deben ser conscientes de la distancia de trabajo relativamente largo (aproximadamente 1 cm) necesaria para este método de cultivo si se utiliza un microscopio vertical y sin objetivos de inmersión. Esta distancia de trabajo los resultados de la capa de medio y de aceite mineral en la parte superior del embrión. En la placa de 6 cm de Petri, la capa de aceite tiene un thickness de aproximadamente 1 a 1,5 mm, y el embrión se sumerge aproximadamente 4 mm de profundidad en el medio de cultivo. Dependiendo del diámetro del objetivo, el borde superior de la placa de 6 cm Petri también podría limitar el acceso al embrión. Esto podría evitarse mediante el uso de un plato más grande.

La distancia de trabajo de la parte superior puede ser ligeramente reducido al minimizar los espesores de las capas líquidas. Además, la distancia de trabajo desde abajo podría reducirse al mínimo por lo que el embrión más abajo a la parte inferior de la placa de Petri y la reducción del espesor de la ventana de cristal del vaso de precipitados se calienta. Mientras que el protocolo se ha optimizado para trabajar con un microscopio distancia zoom largo de trabajo en posición vertical, que podría ser instalado en un microscopio invertido así. Los futuros usuarios deben tener en cuenta que sumergir el embrión demasiado profundamente en el medio de cultivo podría dar lugar a O ₂ -diffusion problemas, aunque los experimentos preliminares sugieren que la difusión limitada no parece ser un problem, siempre y cuando el embrión está rodeado por una suficientemente a gran reservorio de medio de cultivo y el papel de filtro intercalada no se presiona a la parte inferior de la placa de Petri.

Otra limitación es la de control de temperatura. Mediante el ajuste de la temperatura del controlador para el vaso de precipitados se calentó a 40 ° C, la temperatura en el medio se equilibra a 37,5 ° C alrededor de los embriones cuando el medio está cubierto con aceite mineral. Esto muestra que algo de energía se pierde entre la parte inferior del vaso de precipitados, donde se encuentran los elementos de calefacción y el sensor de temperatura, y la ubicación de los embriones. El control de temperatura puede ser optimizado mediante la reubicación del sensor y la redistribución de los elementos de calentamiento.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Milli-Q Reference Water Purification System	Millipore	Z00QSV0WW
Duran laboratory bottles, with caps, 1 L	Sigma-Aldrich/Duran	Z305200-10EA
Name	Company	Catalog Number	Comments
Solution A
NaCl	Merck Millipore	1064041000
KCl	Merck Millipore	1049361000
CaCl2·H2O	Merck Millipore	1023821000
MgCl2·6H2O	Merck/Sigma-Aldrich	13152-1KG-D
Name	Company	Catalog Number	Comments
Solution B
Na2HPO4·2H2O	Merck	1065801000
NaH2PO4·2H2O	Merck	1063420250
Name	Company	Catalog Number	Comments
Whatman qualitative filter paper, Grade 595	Sigma-Aldrich	10311611
Laser cutting machine MLS-90120-C130, CO2-laser, 130 W, wavelength 10.6 µm	Micro Lasersystems
Tork Extra Soft Facial Tissues	Tork	140280
Latex gloves	Sigma-Aldrich	Z645613
	EMDAMED	EMDA 300.131
Transfer pipettes	Sigma-Aldrich	Z350613
	VWR	WITG5.480.003
Accu-jet pro Pipette Controller	BrandTech Scientific	26332
Serological plastic pipettes, 25 ml	Sigma-Aldrich	CLS4251
Plastic document sleeves
Egg incubator - Incubator mod. Cip Cip 40	Fiem
Fertilized chicken eggs (Gallus gallus)	Drost BV (Loosdrecht, NL)
10 cm Tissue culture dishes	Sigma-Aldrich	P5731
	Greiner Bio-one	664160
6 cm Petri dishes	Sigma-Aldrich	P5481
50 ml Centrifuge tubes, Greiner centrifuge tubes or Cellstar tubes	Sigma-Aldrich	T2318
	greiner bio-one	227261
Name	Company	Catalog Number	Comments
Stainless steel rings, custom-made
Large rings, 30 mm outer diameter, 4 mm in height, 1.5 mm wall thickness
Small rings, 20 mm outer diameter, 4 mm in height, 1.5 mm wall thickness, 6.5 mm gap in the ring
Nail scissors
Forceps, Dumont #5, Inox	Fine Science Tools , F.S.T.	11251-20
Fine, really sharp scissors for cutting filter paper	VWR	21-102
M3516 Sigma-Aldrich Mineral Oil	Sigma-Aldrich	CAS Number 8042-47-5
Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar bottoms for EC culture
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539 SIGMA
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653 SIGMA-ALDRICH
Name	Company	Catalog Number	Comments
Microbead implantation
Polybead Sampler Kit III (45 µm beads were used)	Polysciences, Inc.	16905-1
Accupuncture needles: type J, No.02, 0.12x30 mm	SEIRIN	type J, No.02, 0.12x30mm
PBS, pH 7.4	Thermo Fisher Scientific	10010023
Name	Company	Catalog Number	Comments
Temperature controlled beaker
RTD Temperature Sensor with M4 Threaded Housing RTD-850M	Omega	RTD-850M
Hermetically Sealed RTD Sensors HSRTD-3-100-A-3M	Omega	HSRTD-3-100-A-1M
Thermistor and RTD Extension Wire EXTT-3CU-26S-50	Omega	EXTT-3CU-26S-50
3-Pin Mini Connectors for Thermocouples, 3-Wire RTD's and Thermistors MTP-U-M	Omega	MTP-U-M
Kapton (Polyimide Film) Insulated Flexible Heaters KHLV-103/(10)-P	Omega	KHLV-103/(10)-P
Temperature/Process Controller CNi16D24-C4EIT-DC	Omega	CNi16D24-C4EIT-DC
Custom-made aluminium beaker, isolated with polyacetal (drawings see sheet 2)
Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscope setup
Axio Zoom.V16 with ApoTome.2 ZEN	Carl Zeiss AG	495010-0009-000
Objective PlanNeoFluar Z 1.0X/0.25 FWD 56 mm	Carl Zeiss AG	435281-9100-000
Manual Rotary Control MARC	Carl Zeiss AG	435604-0000-000
Transillumination top 450 mot	Carl Zeiss AG	435500-9000-000
Motorized measuring stage S 150x100 mot; CAN (D)	Carl Zeiss AG	435465-9020-000
Insert plate S, glass 237x157x3 mm (D)	Carl Zeiss AG	435465-9053-000
Controller EMS 3	Carl Zeiss AG	435610-9010-000
System Control Panel SYCOP 3	Carl Zeiss AG	435611-9010-000
Hamamatsu ORCA Flash 4.0 camera	Hamamatsu	C11440-22CU
Microscopy High-End Workstation Xeon Quad-Core mulitlingual	Carl Zeiss AG	490004-0025-000
Language Package Windows 7 x64 Ultimate English US	Carl Zeiss AG	410373-0200-000
LCD TFT Monitor HP ZR2440w 24"	Carl Zeiss AG	410350-2403-000	not available anymore
ZEN pro 2012 Hardware License key	Carl Zeiss AG	410135-1002-120	not available anymore
ZEN Software Driver Hamamatsu Cameras Hardware License Key	Carl Zeiss AG	410136-1045-110
ZEN module Z Stack	Carl Zeiss AG	410136-0030-110
ZEN Module Tiles/ Positions	Carl Zeiss AG	410136-1025-110
ZEN Module Time Lapse	Carl Zeiss AG	410136-1031-110
ZEN Module Experiment Designer	Carl Zeiss AG	410136-1022-110
ZEN Desk 2012 Hardware License Key	Carl Zeiss AG	410135-1004-120	not available anymore