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  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

This procedure will demonstrate how we synthesized and characterized the anti-NFκB and anti-cancer stem cell activity of an aspirin-fumarate prodrug.

Resumen

La inflamación es un sello distintivo del cáncer que subyace en la incidencia del cáncer y la promoción y progresión finalmente a la metástasis. Por lo tanto, la adición de un fármaco anti-inflamatorio a regimientos estándar contra el cáncer puede mejorar los resultados del paciente. Uno de estos fármacos, la aspirina (ácido acetilsalicílico, ASA), se ha explorado para la quimioprevención del cáncer y de la actividad anti-tumor. Además de inhibir el eje 2-prostaglandina ciclooxigenasa, actividades contra el cáncer de ASA también se han atribuido a la inhibición del factor nuclear ĸB (NFĸB). Dado que el uso prolongado puede causar ASA toxicidad gastrointestinal, una estrategia de profármaco se ha aplicado con éxito. En este profármaco diseñar el ácido carboxílico de ASA se enmascara y farmacóforos adicionales se incorporan.

Este protocolo describe cómo se sintetizó un profármaco de aspirina fumarato, GTCpFE, y caracterizado su inhibición de la vía NFĸB en células de cáncer de mama y el cáncer de atenuación de tallo-como adecuadacorbatas, un fenotipo NFĸB dependiente importante. GTCpFE inhibe eficazmente la vía NFĸB en líneas celulares de cáncer de mama, mientras que ASA carece de cualquier actividad inhibidora, indicando que la adición de fumarato a la estructura ASA contribuye significativamente a su actividad. Además, GTCpFE muestra una actividad significativa de células madre contra el cáncer mediante el bloqueo de la formación mammosphere y atenuando el CD44 asociado a las células madre del cáncer + CD24 - inmunofenotipo. Estos resultados establecen una estrategia viable para desarrollar mejores medicamentos anti-inflamatorios para la quimioprevención y tratamiento del cáncer.

Introducción

La inflamación es una característica que subyace en múltiples aspectos de la tumorigénesis, como la incidencia y la promoción y progresión finalmente a la metástasis 1. En el cáncer de mama, esto se ve apoyado por observaciones epidemiológicas que muestran que el uso regular de la aspirina fármaco no esteroide anti-inflamatorio clásica (ácido acetil salicílico, ASA) se asocia con una reducción tanto en la incidencia de cáncer de mama, y ​​el riesgo de metástasis y recurrencia 2,3. ASA actúa principalmente mediante la inhibición de la actividad de la ciclooxigenasa-2, que a menudo se regula positivamente en el cáncer de mama 4,5. Sin embargo, los efectos anticancerígenos de ASA también puede ser mediada por la supresión del factor nuclear kappa B aberrante (NFkB) de señalización 6-8. Esto es importante porque una vía de NFkB desregulado promueve la supervivencia de células tumorales, proliferación, migración, invasión, la angiogénesis, y la resistencia a la terapia 9-11. activación de la vía NFkB también es fundamental para el montajeuna respuesta inmune. Por lo tanto, para la terapia contra el cáncer en el que se requiere la inhibición prolongada NFkB, hay que considerar los efectos secundarios perjudiciales que implican la supresión inmune de larga duración. Por lo tanto, ASA puede servir como un buen punto de partida para la optimización terapéutica.

Una limitación para la aplicación de ASA en la terapia del cáncer es las dosis elevadas requeridas para la ciclooxigenasa 2 y la inhibición de NFkB, que están asociados con toxicidad gastrointestinal, tales como úlceras y sangrado estomacal 12,13. Sin embargo, la conversión de ASA en profármaco en forma de éster, pueden reducir la toxicidad gastrointestinal de ASA. Para mejorar aún más la potencia y / o añadir funcionalidad, los elementos estructurales adicionales o farmacóforos auxiliares también se pueden incorporar en el diseño del profármaco de éster. Uno de tales farmacóforo añade para mejorar ASA potencia contra la vía de NFkB es fumarato, que hemos demostrado previamente que es importante para la inhibición de la vía NFkB 14,15.

Hemos sintetizado un profármaco de aspirina fumarato 15, GTCpFE, y planteó la hipótesis de que dicha molécula híbrida sería seguro todavía potente contra la vía NFkB. Hemos probado su actividad anti-NFkB en las células de cáncer de mama y su capacidad para bloquear las células madre de cáncer de mama (CSC) 15, que dependen de NFkB señalización para la supervivencia y el crecimiento de 16-21. Nos encontramos con que la potencia de GTCpFE contra la vía NFkB se mejora significativamente en AAS 15. Además, la formación de bloques GTCpFE mammosphere y atenúa el CSC marcador de superficie CD44 + CD24 - fenotipo inmune, lo que indica que GTCpFE es capaz de erradicar los CAC 15. Estos resultados establecen que el profármaco aspirina-fumarato como un agente anti-inflamatorio eficaz que también pueden dirigirse a células madre cancerosas de mama. En cuanto a la terapia del cáncer de mama, GTCpFE puede tener el potencial para tratar la enfermedad agresiva y mortal.

Protocolo

1. Síntesis de la aspirina-fumarato del profármaco GTCpFE

  1. El uso de un émbolo de la jeringa de plástico, medir 0,81 ml (20 mmol) de metanol y se mezcla en agua (10 ml) en un matraz de fondo redondo. Se enfría la mezcla resultante a 0 ° C colocando el matraz en un baño de hielo-agua. Añadir alcohol 4-hidroxibencil (2,48 mg, 20 mmol) y se agita la mezcla de reacción hasta que la solución es clara.
  2. Preparar una solución de cloruro de O -acetylsalicyloyl (3,77 mg, 19 mmol) en tolueno anhidro (10 ml) pesando la cantidad deseada de cloruro de O -acetylsalicyloyl y disolviéndolo en el disolvente en un matraz separado. El uso de un émbolo de la jeringa de plástico, añadir esta solución a la mezcla preparada en la etapa 1.1, y dejar la reacción agitar a 0 ° C.
  3. Controlar la reacción mediante cromatografía en capa fina (TLC). Las placas de TLC deben tener sílice como fase estacionaria.
    1. Preparar una fase móvil compuesta de 20:80 acetato de etilo (AcOEt) / hexano. En una cámara de TLC(O recipiente pequeño) añadir 5 ml de fase móvil para cubrir el fondo de la cámara.
      NOTA: La cantidad de fase móvil depende de la cámara seleccionada. Siempre añadir una cantidad suficiente para cubrir el fondo, pero una vez que el TLC se coloca en el interior, la línea de disolvente no debe sobrepasar la altura donde se detectaron los compuestos.
    2. Tomar una muestra de la reacción con una jeringa (0,2 ml), colocarlo en un pequeño vial, y se diluye con acetato de etilo (2-3 gotas). Con un observador TLC, tomar cuidadosamente una muestra de la mezcla de reacción se diluyó y la mancha en el TLC.
      NOTA: Los puntos deben ser 1-2 mm y esto debe hacerse en la parte inferior de 1/4 pulgada de la placa de TLC.
    3. En el mismo TLC, colocar una gota de una solución de cloruro de O-acetilsaliciloílo (0,2 mg en 0,5 ml de acetato de etilo) como una comparación. Una vez que los puntos están secos, colocarla en la cámara y se deja correr hasta que el frente del solvente casi ha alcanzado la parte superior del TLC.
    4. Tome el TLC fuera, dejar secar y visualizarlo bajo una lámpara UV. la reacción se completa cuando el punto de cloruro de O -acetylsalicyloyl desaparece de la mezcla de reacción.
    5. Cuando se completa la reacción, se retira el baño de hielo-agua, y permitir que la reacción en agitación a temperatura ambiente durante 20 hr.
  4. Filtrar el precipitado usando un embudo Buchner con un disco fritado de porosidad media. Colocar el sólido en un vial de centelleo, y dejar el compuesto en vacío durante la noche en un desecador a temperatura ambiente. Utilice pentóxido de fósforo (P 2 O 5) como el desecante.
  5. Secar un matraz de fondo redondo, colocándolo en un horno a 80 ° C durante al menos dos días antes de la creación de esta reacción. Alternativamente, sellar el matraz con un septum y perforar con una aguja que está conectado a un sistema de bomba de vacío. Encienda la bomba de vacío y se seca el matraz con una pistola de calor. Dejar enfriar, y repetir este paso 2 veces más.
  6. Inflar un globo usando gas argón, y conectarlo a una jeringa de plástico (cuya h émbolocomo han eliminado) con una aguja. Apague la bomba de vacío y retire la aguja unida a ella que se insertó en el matraz de fondo redondo secado ahora. Insertar la aguja conectado al globo de argón a través de la sellar el matraz de fondo redondo septum.
    1. Añadir éster 4-hidroximetil fenol de 2-acetiloxibenzoico ácido (100 mg, 0,349 mmol), 4-dimetilaminopiridina (4 mg, 0,033 mmol) y trietilamina (53 mg, 0,523 mmol) a un matraz separado, y luego los disolvió en tetrahidrofurano anhidro (5 ml). Con una jeringa de plástico unida a una aguja, añadir esta solución al matraz de fondo redondo sellado. Se enfría la mezcla a 0 ° C colocando el matraz en un baño de agua helada.
  7. A la mezcla anterior, se añade una solución de cloruro de etilo fumaroyl (68 mg, 0,419 mmol) en tetrahidrofurano anhidro (5 ml), gota a gota durante un período de 10 min. Se agita la solución resultante a 0-5 ° C durante 2-4 horas.
  8. Se extrae la mezcla de reacción con acetato de etilo (100 ml) y salmuera (50 ml).
    NOTA: La salmuera es una solución saturada de cloruro de sodio (NaCl). Para prepararlo, colocar 200 ml de agua en un recipiente de vidrio limpio y luego empezar a añadir NaCl (mientras se agita) hasta que no se disuelva más.
    1. Después de la extracción, eliminar la fase acuosa y repetir el último paso dos veces más.
    2. Se seca la mezcla mediante la adición de sulfato de sodio a la fase orgánica, hasta que el sólido no se aglutinan cuando el material de vidrio se agita. El uso de otro embudo de Buchner con un disco fritado, se filtra la mezcla a un matraz de fondo redondo para retirar el sulfato de sodio, luego se evapora a sequedad usando un evaporador rotatorio con la temperatura ajustada a 40 ° C.
  9. El uso de un TLC, determinar una fase móvil adecuada para utilizar en cromatografía en columna.
    NOTA: Para este experimento se utilizó un gradiente de 20:80 AcOEt / hexano.
  10. Preparar una columna con gel de sílice y la fase de disolvente apropiado. Una vez que se ha añadido el compuesto, añadir una capa de sulfato de sodio (o arena) a PRotect se añade la columna como el disolvente.
    1. A medida que la columna se extiende, controlar el eluato por TLC. Detectar cualquier otro tubo de ensayo, ya que se recogen de la columna. Cuando el producto de interés se eluye, mezclar todas las muestras que contenían el producto puro en un gran matraz de fondo redondo, y secarlas usando un evaporador rotatorio con la temperatura del baño fijado en 40 ° C.
      NOTA: El producto debe aparecer como un sólido blanco.
  11. Para confirmar la estructura de GTCpFE, recoger protón y de carbono (1 H y 13 C, respectivamente) los espectros de resonancia magnética nuclear (NMR) según las instrucciones del fabricante.
    NOTA: En este estudio se utilizó un espectrómetro de 400 MHz FT NMR para recoger el 1 H y 13 C espectros. Ejecutar al menos 25 exploraciones a temperatura ambiente para obtener una resolución suficiente de datos. Los picos de RMN observados fueron los siguientes, 1 H RMN (CDCl3): δ 1,29 (t, 3 H, 3J = 7,0 Hz, CH 3); 2,31 (s, 3 H, CH 3); 4,26 (q, 2 H, 3J = 7,0 Hz, COOCH 2); 5,25 (s, 2 H, OCH 2); 6,89 (s, 2 H, HC = CH); 7,19 (m, 3 H, Ar); 7,42 (m, 3 H, Ar); 7,65 (m, 1 H, Ar); 8,22 (dd, 1 H, 3J = 7.8, 4J = 1,2 Hz, Ar). 13 C RMN (CDCl3): 169.70, 164.86, 164.75, 162.89, 151.28, 150.69, 134.76, 134.32, 133.26, 133.16, 132.25, 129.81, 126.26, 124.11, 122.47, 122.04, 66.40, 61.43, 21.05, 14.15.
  12. Además, recoger un espectro de masas de alta resolución utilizando la espectrometría de masa de cromatografía líquida en combinación con trampa de iones y el tiempo-de la tecnología de vuelo (LCMS-IT-TOF) para mediciones precisas de masa según las instrucciones del fabricante.
    NOTA: En este estudio (M + NH4 +) calculado: 430,1496; observado: 430.1477.

2. GTCPFE inhibe la actividad NFĸB en células de cáncer de mama

  1. Cultivo Celular Condiciones
    1. Mantener líneas celulares de cáncer de mama humano, MCF-7 y MDA-MB-231 como por cul celular estándartécnicas tura y propagarse en un incubador humidificado a 37 ° C con 5% de CO 2.
      1. Preparar MCF-7 medio de células de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 con rojo fenol suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), aminoácidos no esenciales al 1%, 2 mM L-glutamina, 1% de antibióticos de penicilina-estreptomicina y 6 ng / ml de insulina. Preparar medio de células MDA-MB-231 de la mejora de medio esencial mínimo (IMEM) suplementado con 5% de FBS, aminoácidos no esenciales al 1%, 2 mM L-glutamina y 1% antibióticos de penicilina-estreptomicina.
  2. Ensayo Reportero NFkB-RE Luciferase
    1. Trypsinize células MCF-7 de cáncer de mama utilizando tripsina al 0,25% durante 5 min a 37 ° C, el contador manualmente usando un hemocitómetro y semillas en placas de 24 pocillos a 90.000 células por densidad también.
    2. Las siguientes células día, co-transfectar con el plásmido de ADN de un elemento de respuesta NFkB (NFkB-RE) constructo de luciferasa, 1 mg / pocillo, along con el promotor de Renilla constructo de luciferasa, 0,2 mg / pocillo. Realizar transfecciones para cada grupo de tratamiento por triplicado.
      1. Lavar las células dos veces con PBS, e incubar con mezclas de ADN de plásmido y 1 l por pocillo de reactivo de transfección (por ejemplo, lipofectamina) en medio libre de suero. Después de 6 horas, cambiar el medio a 1 ml de medio normal (sin antibióticos penicilina y estreptomicina).
    3. Después de 16 horas, añadir 1 l de vehículo o diferentes soluciones madre de la GTCpFE o drogas ASA a cada pocillo. Disolver soluciones de fármacos de acciones (100, 50, 20, 10 y 1 mM) en sulfóxido de dimetilo a 1,000x concentración. Después de la adición de las drogas, las células se incuban durante 2 horas a 37 ° C.
    4. Para activar la vía de NFkB, añadir la citoquina pro-inflamatoria TNF (10 mg / ml solución madre) en cada pocillo para una concentración final de 10 ng / ml y se incuba durante 4 hr. Incluir un control solo TNFa. Aspirar el medio y almacenar la células a -80 ° C.
    5. Medir la luciferasa usando un sistema de ensayo indicador de luciferasa según las instrucciones del fabricante.
      NOTA: Cuando se utiliza el sistema de ensayo de luciferasa (por ejemplo, sistema de ensayo de luciferasa Dual), por primera vez, preparar una solución de reactivo de ensayo de luciferasa por la re-suspensión en 10 ml de tampón y su almacenamiento a -80 ° C en alícuotas de 1 ml.
      1. Preparar tampón de lisis 1x diluyendo 5x tampón madre con agua. lisar las células en cada pocillo con 100 l de tampón de lisis 1X. Se incuban las placas en un agitador orbital durante 15 min, a velocidad media.
      2. Etiquetar un tubo de 1,5 ml por muestra. Descongelar reactivo de ensayo de luciferasa a temperatura ambiente (se necesitarán 50 l por muestra) y mantener en papel de aluminio. Prepare reactivo de extinción 1x en un vial de vidrio, la dilución 01:49 en tampón y se vórtice (será necesario 50 l por muestra).
      3. Añadir 10 l de lisado celular a un tubo de microcentrífuga etiquetado. A continuación, añadir 50 l de reactivo de ensayo de luciferasa ysuavemente vórtice. Inmediatamente después, se coloca el tubo en un soporte y se mide la luminiscencia a través del programa de luciferasa dual en el luminómetro. Seleccione y pulse el siguiente: Ejecutar Protocolos Promega Dual → → Glo OK.
      4. Añadir 50 l de reactivo de temple al tubo de ensayo y suavemente vórtice. Medir la luminiscencia. Repita estos pasos para cada muestra.
      5. Analizar datos utilizando una hoja de cálculo mediante la normalización de NFkB-RE con el control interno de Renilla (NFkB-RE / Renilla). Comparar inhibidores de datos sólo para el Control TNF (TNF solamente se fija en el 100%).
  3. NFkB-Gen Objetivo Transcripción
    1. Semilla de células MCF-7 en placas de 6 pocillos a 250.000 células por pocillo en 2 ml de volumen medio preparado como se describe en la sección 2.1.
    2. El día siguiente, añadir 2 l de diferentes GTCpFE 1,000x existencias (100, 50, 20, 10 y 1 mM) durante 2 horas antes de la adición de TNFa 10 ng / ml durante 2 hr. Ejecutar cada tratamientopor triplicado. Incluir solo vehículo y controles de TNFa.
    3. Aislar el ARN utilizando el método de extracción de tiocianato de guanidinio-fenol-cloroformo de acuerdo con las instrucciones del fabricante 22. Determinar la concentración de ARN (en pirocarbonato de dietilo (DEPC) de agua tratada) y la pureza de ARN usando un espectrofotómetro. Mantener las muestras de ARN en el hielo o almacenar a -80 ° C. Utilice sólo consejos de barrera libre de RNasa al manipular el ARN.
    4. Transcripción inversa 0,5 g de ARN total usando un kit disponible comercialmente de Moloney virus de la leucemia murina (M-MLV) de la transcriptasa inversa.
      NOTA: El kit incluye 5x tampón y ditiotreitol (DTT), junto con la mezcla de dNTP, y la mezcla de hexámeros al azar.
      1. Añadir 0,5 g de ARN a 200 unidades de M-MLV, dNTPs 0,5 mM, 100 ng de hexámeros aleatorios, 10 mM de DTT, 1x tampón y agua DEPC a un volumen final de reacción de 10 l. Llevar a cabo la reacción de la transcriptasa inversa usando un ciclador de PCR durante 50 min a 37 ° C, y después 15 min a 70 y# 176; C para calentar-inactivar la enzima.
    5. Diluir el producto ADNc resultante a 100 l con agua bidestilada y el uso de 2 l para cada reacción posterior reacción en cadena de polimerasa cuantitativa (PCR).
      1. Mezclar cebadores directo e inverso para el gen de interés en 1,25 M de concentración cada uno. Preparar una mezcla maestra con 2 l de agua doblemente destilada, 1 l de 1,25 M mezcla de cebadores y 5 l de 2x del colorante para permitir la detección del ADN de doble cadena. Cargar los 2 l de cDNA y 8 l de mezcla maestra en placas de 96 pocillos de PCR.
    6. Llevar a cabo la PCR cuantitativa usando un sistema de PCR en tiempo real (40 ciclos, 95 a 60 ° C) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y analizar manualmente los datos.
      NOTA: Todos los cebadores de PCR utilizados han sido validados y se informó anteriormente 23.
    7. Calcular la expresión génica cambio veces usando una hoja de cálculo mediante el método ΔΔCt, con la proteína ribosomal 36B4 ARNm que actúa como control interno 23.

3. GTCpFE inhibe las células madre del cáncer de mama in vitro

  1. Ensayo de Formación mammosphere
    1. Preparar mammosphere (MS), completándolo de Eagle modificado por Dulbecco: mezcla de nutrientes F-12 (DMEM / F12) fenol medio libre de rojo con 1% de metilcelulosa. Dejar que se disuelva por agitación suave durante la noche a 4 ° C. Filtro de esterilizar el medio y suplementar con B27 1x, 1% de penicilina y estreptomicina, 5 mg / ml de insulina, 1 mg / ml de hidrocortisona, y factor de crecimiento epidérmico 20 ng / ml recombinante humano.
    2. Preparar las células individuales de la línea celular MDA-MB-231 por digestión con tripsina (tripsina al 0,25% durante 5 min a 37 ° C) de cultivos en monocapa y filtrar a través de tamices de malla. contar manualmente las células disociadas sola y la placa en placas de 96 pocillos ultra-bajas de fijación a una densidad de 400 células / pocillo. Al día siguiente, añadir diferentes concentraciones de GTCPFE (por ejemplo, concentraciones GTCpFE finales: 1, 10, 20, 50 m) para un volumen final es de 100 microlitros. Llevar a cabo todos los tratamientos por triplicado.
    3. Después de 7 días de cultivo en la incubadora, adquirir imágenes a través de un software de imágenes utilizando un microscopio invertido. contar manualmente el número EM> 75 micras de diámetro. Comparar el tratamiento farmacológico para el control del vehículo.
      NOTA: El diámetro de la EM> 75 micras se determina utilizando el software de imágenes.
  2. CD44 + CD24 - CSC inmunofenotipo
    1. Tripsinizar las células MDA-MB-231 con 0,25% de tripsina durante 5 min a 37 ° C. Contar usando un hemocitómetro y semillas en placas de 10 cm a los 3 millones de células por placa en 10 ml de medio como se describe en la sección 2.1. Añadir vehículo (10 l dimetilsulfóxido) o GTCpFE (10 l de 50 mM) a las células durante 72 horas.
    2. Para los grupos de tratamiento de vehículos o GTCpFE, trypsinize células (como en el paso 3.2.1) y distribuir 1 millón de células en 'Test & #39; o tubos de 5 ml de poliestireno "control" que contienen 2 ml de solución salina equilibrada de Hank 1x (HBSS) de tampón suplementado con FBS al 2%.
    3. Para la tinción de la superficie CD44 y CD24 marcadores, las células de girar y añadir 20 l de cada anticuerpo conjugado y HBSS + FBS al 2% a tubos de ensayo para un final de 100 l de volumen general (dilución 1: 5). Añadir 100 l de HBSS + 2% de FBS a control los tubos. Incluir CD44-APC y anticuerpo conjugado anticuerpo CD24-PE controles de manchas individuales o los controles immunoisotype IgG.
    4. Se incuban las células en la oscuridad a 4 ° C durante 30 min. Centrifugar las células durante 5 min a 400 xg y reconstituir en 200 l de tampón HBSS con FBS al 2%. Mantener las células en hielo en la oscuridad.
    5. Realizar la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) de células vivas utilizando un instrumento analizador FACS de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Recoge al menos 50.000 eventos para cada tubo. tratamientos por triplicado.
      NOTA: apertura de puerta se basa en controles de ninguna tinción (Control tubo), immunoisotypes IgG, y el CD44-APC y las manchas individuales CD24-PE.
    6. Analizar los datos utilizando un software de citometría de flujo disponible.
      NOTA: El porcentaje de células tratadas con GTCpFE con el CD44 + CD24 - inmunofenotipo se estima y se compara con el control del vehículo.

Resultados

En la Figura 1, la estructura química de la aspirina profármaco-fumarato, GTCpFE, y su actividad inhibidora de la citoquina inducida vía NFĸB en células de cáncer de mama se indican. GTCpFE inhibe ambos extremos NFĸB, NFĸB-RE actividad de luciferasa (Figura 1B) y la expresión de NFĸB genes diana, como la Molécula de Adhesión Intercelular 1 (ICAM1), quimiocina CC Motif ligando 2 (CCL2), y el factor de necrosis tumoral (TNF) (Figura 1C)...

Discusión

In this protocol, we demonstrated the synthesis of an ASA prodrug, GTCpFE, where the fumarate pharmacophore was incorporated to improve the anti-NFĸB activity in breast cancer cells. GTCpFE is an effective NFĸB inhibitor, whereas ASA itself is not, even at much higher concentrations. The fumarate moiety has anti-inflammatory properties as shown by its ability to inhibit NFĸB signaling in a variety of cell lines and tissues14,25-29. The prodrug strategy described herein, is amendable to other mal...

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Agradecimientos

This work was supported by grants provided by the National Institutes of Health (NIH), R01 CA200669 to JF and R01 CA121107 to GRJT, and by a postdoctoral fellowship grant from Susan G. Komen for the Cure to IK (PDF12229484).

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
RPMI 1640 Red MediumLife Technologies 11875-093Warm up to 37 °C before use
IMEMCorning10-024-CVWarm up to 37 °C before use
DMEM / F12 MediumThermoFisher21041-025Warm up to 37 °C before use
MEM NEAA 10 mM 100xLife Technologies 11140
Penicillin StreptomycinLife Technologies 15140-122
L-Glutamine 100xLife Technologies 25030-081
InsulinSigma-AldrichI-1882
Fetal Bovine Serum Atlanta BiologicalsS11150
Trypsin 2.5% 10xInvitrogen15090046
Methyl CelluloseSigma M0262
B27 Supplement 50xGibco17504-044
EGFGibcoPHG0311L
NFκB-RE Luciferase Construct Clontech pGL4.32
Renilla Luciferase Construct PromegapGL4.70
Lipofectamine 2000ThermoFisher11668-019
Dual-Luciferase Reporter Assay Promega120000032
NanoDrop SpectrophotometerThermoFisher
Eppendorf Mastercycler Eppendorf
StepOne Real Time PCR SystemThermo Scientific
Eclipse MicroscopeNikon
CyAn ADP Analyzer Beckman Coulter
QCapture SoftwareQImaging
Summit SoftwareBeckman Coulter
GraphPad SoftwarePrism
TRIzolThermoFisher15596-018
M-MLV Reverse TranscriptaseInvitrogen28025-013
100 mM dNTP SetInvitrogen10297-018
Random Hexamers Invitrogen48190-011
Fast SYBR Green Master MixThermoFisher4385612
Costar 96W, ultra low attachment Corning3474
HBSS, 1xThermoFisher14025134
CD44-APC conjugated antibody BD Pharmingen560990Store at 4 °C, protect from light
CD24-PE antibodyBD Pharmingen560991Store at 4 °C, protect from light
Recombinant Human TNFαFisher210TA100 
CCL2 Primer Forward SequenceAGAATCACCAGCAGCAAGTGTCC
CCL2 Primer Reverse SequenceTCCTGAACCCACTTCTGCTTGG
ICAM1 Primer Reverse SequenceTGACGAAGCCAGAGGTCTCAG
ICAM1 Primer Forward SequenceAGCGTCACCTTGGCTCTAGG
TNF Primer Forward SequenceAAGGGTGACCGACTCAGCG
TNF Primer Reverse SequenceATCCCAAAGTAGACCTGCCCA
36B4 Primer Forward SequenceGTGTTCGACAATGGCAGCAT
36B4 Primer Reverse SequenceGACACCCTCCAGGAAGCGA
Sodium HydroxideSigma-AldrichS5881-500G
4-Hydroxybenzyl AlcoholSigma-Aldrich20806-10G
O-Acetylsalicyloyl ChlorideSigma-Aldrich165190-5G
Phosphorous PentoxideSigma-Aldrich79610-100G
Ethyl Fumaroyl ChlorideSigma-Aldrich669695-1G
Sodium SulfateSigma-Aldrich246980-500G
4-DimethylaminopyridineSigma-Aldrich714844-100ML0.5 M in tetrahydrofuran
TriethylamineSigma-AldrichT0886-100ML
TolueneSigma-Aldrich244511-100ML
Ethyl AcetateSigma-Aldrich270989-100ML
TetrahydrofuranSigma-Aldrich401757-2L
400 MHz FT NMR spectrometer See Bruker’s Avance User’s Manual, version 000822 for details

Referencias

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  2. Cuzick, J., et al. Aspirin and non-steroidal anti-inflammatory drugs for cancer prevention: an international consensus statement. Lancet Oncol. 10, 501-507 (2009).
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