Contra el cáncer eficacia de la terapia fotodinámica con nanopartículas orientada por cáncer de pulmón

Resumen

Photodynamic therapy (PDT) is an alternative choice for lung cancer treatment. To increase the therapeutic effect of PDT, lung cancer-targeted nanoparticles combined with chemotherapy were developed. Both in vitro and in vivo anticancer efficacies of PDT with prepared nanoparticles were evaluated.

Resumen

Photodynamic therapy (PDT) is a non-invasive and non-surgical method representing an attractive alternative choice for lung cancer treatment. Photosensitizers selectively accumulate in tumor tissue and lead to tumor cell death in the presence of oxygen and the proper wavelength of light.

To increase the therapeutic effect of PDT, we developed both photosensitizer- and anticancer agent-loaded lung cancer-targeted nanoparticles. Both enhanced permeability and retention (EPR) effect-based passive targeting and hyaluronic-acid-CD44 interaction-based active targeting were applied. CD44 is a well-known hyaluronic acid receptor that is often introduced as a biomarker of non-small cell lung cancer.

In addition, a combination of PDT and chemotherapy is adopted in the present study. This combination concept may increase anticancer therapeutic effects and reduce adverse reactions.

We chose hypocrellin B (HB) as a novel photosensitizer in this study. It has been reported that HB causes higher anticancer efficacy of PDT compared to hematoporphyrin derivatives¹. Paclitaxel was selected as the anticancer drug since it has proven to be a potential treatment for lung cancer².

The antitumor efficacies of photosensitizer (HB) solution, photosensitizer encapsulated hyaluronic acid-ceramide nanoparticles (HB-NPs), and both photosensitizer- and anticancer agent (paclitaxel)-encapsulated hyaluronic acid-ceramide nanoparticles (HB-P-NPs) after PDT were compared both in vitro and in vivo. The in vitro phototoxicity in A549 (human lung adenocarcinoma) cells and the in vivo antitumor efficacy in A549 tumor-bearing mice were evaluated.

The HB-P-NP treatment group showed the most effective anticancer effect after PDT. In conclusion, the HB-P-NPs prepared in the present study represent a potential and novel photosensitizer delivery system in treating lung cancer with PDT.

Introducción

Photodynamic therapy (PDT) is composed of three major factors: photosensitizers, light, and oxygen. PDT is reported as a promising treatment for various cancers³. When the photosensitizers are administered into the cancer patient, they selectively accumulate in the tumor tissues. When the proper wavelength of light is applied, the highly reactive singlet oxygen and other free radicals lead to tumor cell damage⁴.

Lung cancer was introduced as one of the first applications for PDT in the early 1980s⁵. PDT provides several advantages in treating lung cancer. Since PDT is a non-invasive and non-surgical treatment, it is an attractive alternative choice for the patients in whom surgical resection is inappropriate.

There have been many challenges to enhance the cancer-targeting efficacy of the photosensitizers. Increasing photosensitizer accumulation in cancer sites and decreasing accumulation in normal tissues are the identical goals for the cancer-targeting studies. A variety of targeted drug delivery systems, such as polymers, liposomes, and nanoparticles are adopted as photosensitizer carriers^6-8. In our previous studies, nanoparticles effectively increased the cancer-targeting abilities of the photosensitizers^9,10. Nanoparticles are ideal cancer-targeting carriers since they possess both passive and active targeting abilities. The leaky tumor vessels provide opportunity for nano-sized carriers to accumulate easily in tumors, which is well-known as the enhanced permeability and retention (EPR) effect^11,12. The interaction between the nanoparticles and the specific receptors on cancer cells enables active cancer targeting. In this study, we prepared hyaluronic acid-based nanoparticles to interact with CD44, the major hyaluronic acid receptor that is overexpressed on lung cancer cells¹³.

To maximize the anticancer efficacy, a combination of PDT and chemotherapy is adopted in the present study. This combination concept may permit an increased therapeutic effect. Furthermore, decreased doses of both the photosensitizer and the anticancer drug can diminish adverse effects. We selected hypocrellin B (HB) as a novel photosensitizer in the present study. HB is isolated from Chinese medicinal fungus Hypocrella bambuase. Shang et al. reported that HB-based PDT possesses a higher anticancer efficacy when compared to hematoporphyrin derivative-based PDT¹. Paclitaxel was selected as the anticancer drug since it has proven to be a potential treatment for various cancers, including lung cancer².

Herein, we compared the anticancer efficacies of photosensitizer (hypocrellin B, HB) solution, photosensitizer-encapsulated hyaluronic acid-ceramide nanoparticles (HB-NPs), and both photosensitizer- and anticancer agent (paclitaxel)-encapsulated hyaluronic acid-ceramide nanoparticles (HB-P-NPs) after PDT. The in vitro phototoxicity in A549 (human lung adenocarcinoma) cells and the in vivo antitumor efficacy in A549 tumor-bearing mice were evaluated.

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Protocolo

NOTA: Todos los protocolos de los estudios con animales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional del Hospital Bundang Universidad Nacional de Seúl (BA1308-134 / 072-01).

1. Síntesis de ácido hialurónico-ceramida (ECA)

1. Solubilizar 12,21 mmol de ácido hialurónico oligómero (HA) y 9,77 mmol de hidróxido de tetra- n -butilamonio (TBA) en 60 ml de agua doblemente destilada (DDW). Se agita durante 30 min.
2. Para sintetizar el enlazador DS-Y30, se disuelven 8,59 mmoles de ceramida DS-Y30 y 9.45 mmol de trietilamina en 25 ml de tetrahidrofurano (THF). Mezclar con 8,59 mmol de cloruro de 4-clorometilbenzoilo en THF. Se agita durante 6 horas a 60 ° C.
3. Se disuelve el 8,10 mmol sintetizado de HA-TBA y 0,41 mmol de enlazador DS-Y30 en una mezcla de THF y acetonitrilo (4: 1, v / v). Se agita durante 5 horas a 40 ° C.
4. Eliminar las impurezas mediante el filtrado con un agente de filtro, y eliminar el disolvente orgánico por evaporación a vacío. Se purifica el producto usando una membrana de diálisis (peso molecular de corte: 3,5 kDa) y se liofiliza.

2. Preparación de las nanopartículas

1. Disolver 1 mg de HB y 1 mg de paclitaxel en 0,5 ml de sulfóxido de dimetilo (DMSO) y se mezclan con 0,5 ml de DDW por vórtice de mezcla durante 5 min. Entonces, solubilizar HACE en la mezcla por vórtice mezcla durante otros 5 min.
2. Para eliminar el disolvente, el calor a 70 ° C durante 4 h bajo una corriente suave de gas nitrógeno.
3. Resuspender la película compuesta de ECA, HB, y paclitaxel con 1 ml de DDW. Filtrar con un filtro de jeringa (0,45 micras de tamaño de poro) para eliminar los medicamentos no encapsulados.

3. En Vitro fototoxicidad

1. La adopción de las nanopartículas en líneas celulares de cáncer de pulmón
   1. Preparar (v / v) de suero RPMI-1640 10% que contenía medio-bovino fetal y 1% (w / v) de penicilina-estreptomicina.
   2. Células A549 semillas en placas de cultivo celular de 24 pocillos a una densidad de 1 x 10 ⁵ células / pocillo (por triplicado para cadagrupo). Incubar durante 24 horas a 37 ° C en una atmósfera de aire _{de CO2} y 95% al 5% humidificado.
   3. Después de la unión celular, se elimina el medio y se lavan las células mediante la adición de 1 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS).
   4. Disolver las nanopartículas en PBS a una concentración final de 2 M / ml HB. A continuación, se incuban las células con 1 ml de PBS, NP vacías, HB-PN, o HB-P-NP en cada pocillo durante 4 horas en la oscuridad.
   5. Quitar toda la solución y se lavan las células mediante la adición de 1 ml de PBS frío. Repetir la etapa de lavado una vez más. Añadir medio de cultivo fresco.
2. ensayo de viabilidad celular
   1. Coloque la placa de cultivo celular debajo de la fibra TFD (con 1 cm de distancia de la fibra PDT para el bienestar). Use gafas de seguridad láser e iluminar las células con un láser PDT (630 nm, 400 mW / ^cm2) en la oscuridad durante varios períodos de tiempo: 0, 5, 10, 20, 30 y 40 segundos (0, 2, 4 , 8, 12, y 16 J / cm ^2). A continuación, se incuban las células durante 24 horas en la oscuridad.
   2. Aspirar el medio y lavar las células mediante la adición de 1 ml de PBS frío. Repetir la etapa de lavado una vez más.
   3. Añadir 10 l de solución de medición citotoxicidad a cada pocillo. Incubar en la oscuridad durante 2 hr.
   4. Medir la absorbancia a 450 nm usando un lector de microplacas.
3. El análisis microscópico
   1. Coloque la placa de cultivo celular debajo de la fibra TFD (con 1 cm de distancia de la fibra PDT para el bienestar). Use gafas de seguridad láser e iluminar las células con un láser PDT (630 nm, 400 mW / ^cm2) en la oscuridad durante 0, 20, o 40 segundos (0, 8, o 16 J / ^cm2). A continuación, se incuban las células durante 24 horas en la oscuridad.
   2. Aspirar el medio y lavar las células mediante la adición de 1 ml de PBS frío. Repetir la etapa de lavado una vez más.
   3. Añadir 50 l de anexina V-FITC y 50 l de 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, 1,5 mg / ml). Agitar suavemente la placa y se incuba durante 15 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.
      NOTA: Utilice la anexina V-FITC del kit microscopio de fluorescencia.
   4. Lavar las células mediante la adición de 1 ml de PBS frío. Repetir la etapa de lavado una vez más. Mantener las células en PBS fresco. Identificar las células apoptóticas utilizando un microscopio óptico a un aumento de 100X.
4. clasificación de células activadas por fluorescencia análisis (FACS)
   1. Coloque la placa de cultivo celular debajo de la fibra TFD (con 1 cm de distancia de la fibra PDT para el bienestar). Use gafas de seguridad láser e iluminar las células con un láser PDT (630 nm, 400 mW / ^cm2) durante 0, 20, o 40 segundos (0, 8, o 16 J / ^cm2). A continuación, se incuban las células durante 24 horas en la oscuridad.
   2. Aspirar el medio y lavar las células mediante la adición de 1 ml de PBS frío. Repetir la etapa de lavado una vez más.
   3. Resuspender las células en 1 ml de tampón de unión 1 x (diluir 1 parte del tampón de unión 10x; 0,1 M Hepes / NaOH (pH 7,4), 1,4 M NaCl, y 25 mM CaCl ₂ a 9 partes de agua destilada) y la transferencia de 100 l de la solución de muestra a una 5-mltubo de cultivo.
   4. Añadir 5 l de anexina V-FITC y 5 l de yoduro de propidio (PI). vórtice suavemente el tubo y se incuba durante 15 min a temperatura ambiente (RT) en la oscuridad. Añadir 400 l de tampón de unión 1 ×.
      NOTA: Utilice la anexina V-FITC y PI del kit microscopio de fluorescencia.
   5. Identificar las células apoptóticas mediante FACS ^14. Las líneas de láser de excitación de PI y la anexina V-FITC son 488 nm y 635 nm, respectivamente. Medir la emisión de fluorescencia del PI y la anexina V-FITC a 610 ± 20 nm y 660 ± 20 nm, respectivamente. Recoger las células adquiridas en el citómetro de flujo por cada 10.000 eventos.

4. Eficacia in vivo contra el cáncer en ratones portadores de tumores

1. modelo de ratón inducida por el cáncer de pulmón
   1. Preparar 1 × 10 ⁶ células A549 en 0,1 ml de medio RPMI-1640; mantenerlo en hielo.
   2. Anestesiar a los ratones con una inyección ip de un xilazina y una mezcla de tiletamina y zolazepam (1: 2, 1 ml /kg). Confirmar la anestesia adecuada pellizcando suavemente un pequeño pliegue de piel de ratón. Utilice ungüento veterinario en los ojos para evitar la sequedad, mientras que bajo anestesia.
      NOTA: Si no se observa movimiento, el animal es suficientemente anestesiado para comenzar los experimentos.
   3. Inyectar las células por vía subcutánea en los flancos izquierdo de / C macho ratones desnudos BALB (6 - 7 semanas de edad, 20 - 22 g).
   4. Mantener la observación de los ratones hasta que empiezan a moverse alrededor de la jaula.
      NOTA: No deje un animal sin vigilancia hasta que se haya recuperado el conocimiento suficiente para mantener decúbito esternal. No devuelva un animal que ha sido sometido a una cirugía para la compañía de otros animales hasta que se haya recuperado por completo. Mantener a los ratones bajo condiciones libres de patógenos específicos (SPF).
   5. Medir el tamaño del tumor con calibres cada día. Calcular el volumen del tumor (mm ³⁾ como (longitud x anchura ²⁾ / 2. Cuando el tamaño del tumor alcanza aproximadamente 200 mm ³ en volumen, iniciar el experimento.
2. estudio de eficacia contra el cáncer
   1. Aleatoriamente dividir los ratones en 4 grupos (n = 10 para cada grupo).
   2. Anestesiar a los ratones con una inyección ip de un xilazina y una mezcla de tiletamina y zolazepam (1: 2, 1 ml / kg). Confirmar la anestesia adecuada pellizcando suavemente un pequeño pliegue de piel de ratón. Utilice ungüento veterinario en los ojos para evitar la sequedad, mientras que bajo anestesia.
      NOTA: Si no se observa movimiento, el animal es suficientemente anestesiado para comenzar los experimentos.
   3. Disolver las nanopartículas en PBS a una concentración final de 2 mg / ml HB. Se inyecta PBS, libre de HB, HB-PN, o HB-P-NP a través de la vena de la cola (2 mg / kg como HB) dos veces en los días 0 y 7.
   4. Mantener la observación de los ratones hasta que empiezan a moverse alrededor de la jaula.
      NOTA: No deje un animal sin vigilancia hasta que se haya recuperado el conocimiento suficiente para mantener decúbito esternal. No devuelva un animal que ha sido sometido a una cirugía para la compañía de otros animales hasta su completarecuperado. Mantener las jaulas oscuridad y bajo condiciones SPF específicos.
   5. 24 horas después de cada inyección, anestesiar a los ratones con una inyección ip de un xilazina y una mezcla de tiletamina y zolazepam (1: 2, 1 ml / kg). Confirmar la anestesia adecuada pellizcando suavemente un pequeño pliegue de piel de ratón. Utilice ungüento veterinario en los ojos para evitar la sequedad, mientras que bajo anestesia.
      NOTA: Si no se observa movimiento, el animal es suficientemente anestesiado para comenzar los experimentos.
   6. Coloque el sitio del tumor bajo la fibra PDT (de 1 cm de distancia de la fibra PDT al tumor). Use gafas de seguridad láser, apague el interruptor, e iluminar el tumor con un láser PDT (630 nm, 400 mW / ^cm2) durante 500 seg (200 J / ^cm2) dos veces en los días 1 y 8.
   7. Mantener la observación de los ratones hasta que empiezan a moverse alrededor de la jaula. No deje un animal sin vigilancia hasta que se haya recuperado el conocimiento suficiente para mantener decúbito esternal. No devuelva un animal que tiene undergone cirugía para la compañía de otros animales hasta que esté completamente recuperado.
   8. Mantener las jaulas en condiciones SPF. Mantener las jaulas en la oscuridad durante 24 horas después de tratamiento con láser.
   9. supervisar visualmente el volumen del tumor y los cambios en el sitio del tumor cada día. Medir el tamaño del tumor con calibradores, y calcular el volumen como (longitud x anchura ²⁾ / 2 (mm ^3). Tome fotografías de los sitios tumorales todos los días para verificar si hay alteraciones de la superficie del tumor después de la TFD.
   10. En el día 16, sacrificar cinco ratones por grupo con anestesia terminales utilizando isoflurano.
   11. Con pinzas y tijeras, corte la piel exterior y exponer los tumores ^15. Cuidadosamente la cosecha. Fijarlos en formalina al 10%, incrustarlos en parafina, y teñirlos con hematoxilina y eosina (H & E) para el análisis histológico ^16.
   12. Después de 45 días de seguimiento, sacrificar los ratones restantes por la anestesia terminales utilizando isoflurano.

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Resultados

Preparamos tanto HB-PN y HB-P-NP con las técnicas mencionadas anteriormente. Los diámetros medios de HB-NPs y HB-P-NP fueron 220,9 ± 3,2 nm y 211,9 ± 1,6 nm, respectivamente.

La viabilidad celular de las células A549 después de 4 horas de incubación con PBS, NP vacías, HB-PN, y HB-P-NP seguido de irradiación de luz (de 0 a 16 J / ^cm2) se muestra en la Figura 1. Sin luz, la grupo de tratamie...

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Discusión

El paso más crítico en este estudio es la selección de las condiciones apropiadas láser: longitud de onda, potencia y tiempo de irradiación. La longitud de onda apropiada de luz adecuada para el fotosensibilizador específica es necesaria para la PDT. Se utilizó un láser de 630 nm que era apropiado para hipocrelina B. La potencia de salida era otro factor importante, que se fijó en 400 mW / ^cm2 sobre la base de muchos estudios piloto. Potencias de salida superior a 400 mW / ^cm2 dañadas las...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
oligo hyaluronic acid	Bioland Co., Ltd.	_
DS-Y30 (ceramide 3B; mainly N-oleoyl-phytosphingosine)	Doosan Biotech Co., Ltd.	_
adipic acid dihydrazide	Sigma Aldrich	A0638
N-(3-dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide	Sigma Aldrich	39391
4-(chloromethyl)benzoyl chloride	Sigma Aldrich	270784
Tween 80	Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.	T0546
syringe filter	Sartorius Stedim Biotech GmbH	17762	15 mm, RC, PP, 0.45 µm
triethylamine	Sigma Aldrich	T0886
Mini-GeBAflex tubes	Gene Bio-Application Ltd.	D070-12-100
Paclitaxel	Taihua Corporations	_
RPMI-1640	Gibco Life Technologies, Inc.	11875
Penicillin–streptomycin	Gibco Life Technologies, Inc.	15070
Fetal bovine serum	Gibco Life Technologies, Inc.	16140071
Celite (Filter agent)	Sigma Aldrich	6858	See step 1.4