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  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Aquí mostramos cómo cuantificar el número y la distribución espacial de las zonas activas sinápticas en los fotorreceptores de Drosophila melanogaster, resaltada con un marcador molecular codificada genéticamente, y su modulación después de la exposición prolongada a la luz.

Resumen

El sistema nervioso tiene la notable capacidad de adaptación y respuesta a diversos estímulos. Este ajuste neuronal se logra en gran medida a través de la plasticidad sináptica en el plano. La zona activa (AZ) es la región en la membrana presináptica que media la liberación de neurotransmisores y está compuesto de una densa colección de proteínas de andamiaje. AZS de Drosophila melanogaster (Drosophila) fotorreceptores se someten a la remodelación molecular después de la exposición prolongada a la luz del ambiente natural. Así, el nivel de actividad neuronal puede reorganizar la composición molecular de la AZ y contribuir a la regulación de la salida funcional.

A partir de la exposición a la luz preparado mencionado arriba a la inmunohistoquímica, detalles de este protocolo la forma de cuantificar el número, la distribución espacial y el nivel de deslocalización de las moléculas sinápticas en AZS en fotorreceptores de Drosophila. El uso de análisis de imágenes software, se identificaron grupos de la componente de GFP fusionado AZ Bruchpilot para cada fotorreceptor R8 (R8) terminal del axón. Bruchpilot manchas detectadas fueron asignados automáticamente a los axones individuales R8. Para el cálculo de la distribución de frecuencia puntual a lo largo del axón, se implementó un software personalizado plugin. punto de inicio de cada axón y punto final se definieron de forma manual y la posición de cada punto Bruchpilot se proyectan en la línea de unión entre el inicio y el punto final. Además del número de grupos Bruchpilot, también cuantificó el nivel de deslocalización de Bruchpilot-GFP dentro de los grupos. Estas mediciones reflejan en detalle la dinámica sinápticas espacialmente resueltas en una sola neurona en condiciones ambientales diferentes a los estímulos.

Introducción

La modulación de la función sináptica contribuye a la notable capacidad del sistema nervioso para responder con precisión o adaptarse al cambio de los estímulos ambientales. Ajuste de la probabilidad de liberación de la vesícula presináptica es una forma de controlar la fuerza sináptica 1. La liberación de vesículas sinápticas se lleva a cabo en la Zona Activa (AZ), una región especializada de la membrana presináptica 2. El AZ se caracteriza por un casete de proteínas específicas 3, 4. La mayoría de las proteínas que contribuyen a la asamblea AZ están muy conservadas en los nematodos, insectos y mamíferos 5. Estudios recientes sugieren que el nivel de actividad neuronal regula la composición molecular de la AZ, que a su vez contribuye a la regulación de la salida funcional tanto in vitro como in vivo 6, 7,> 8. Hemos determinado anteriormente que AZS fotorreceptoras se someten a la remodelación molecular en Drosophila después de la exposición prolongada a la luz del ambiente natural de 9. En esta condición, se observó que el número de Bruchpilot (BRP) -positivo AZS se redujo en el axones fotorreceptoras.

Las proteínas Brp / REPARTO familia / ELKS son bloques de construcción fundamentales de AZS en vertebrados e invertebrados sinapsis 10. En los mutantes de Drosophila BRP, evocó la liberación de vesículas se suprime 11, 12. Los 17 residuos de aminoácidos C-terminales de Brp son esenciales para la agrupación de vesículas sinápticas en la Drosophila unión neuromuscular (NMJ) 13, 14. Estos estudios demostraron el papel central de esta molécula en la organización y la función AZ. Con una herramienta genética desarrollada recientemente, Synaptic etiquetado con recombinación (estrella), Brppuede observarse in vivo en tipos celulares específicos, en los niveles de expresión endógenos y en una sola resolución sinapsis 15. Esta herramienta hace que sea factible para evaluar la dinámica endógenos de sinapsis cuantitativamente en el sistema nervioso central complejo.

Se han realizado varios estudios que incluyen cuantificaciones sinápticas en base a los datos obtenidos de la microscopía confocal. alteraciones sinápticas se han evaluado mediante la medición de la longitud, el área, el volumen, la densidad y contando el número en base a aplicaciones de software sofisticados. Por ejemplo, el software gratuito ImageJ proporciona un método de cuantificación para el área sináptica total y medidas de densidad sináptica en la Drosophila NMJ 16. El número de sitios de colocalización de los marcadores pre y post-sinápticas se han cuantificado usando el plugin "puntos lagrimales Analizador" disponible en la plataforma de software ImageJ 17. Alternativamente, un multi-parprograma basado adigm entorno de computación numérica, Synapse Detector (SYND), puede rastrear automáticamente dendritas de las neuronas marcadas con un marcador fluorescente, y después cuantifica los niveles de proteína sináptica como una función de la distancia desde el cuerpo celular 18. El software de análisis de Synaptic puntos lagrimales (SynPAnal), ha sido diseñado para el análisis rápido de imágenes en 2D de las neuronas adquiridas de microscopía confocal o fluorescente. La función principal de este software es la cuantificación automática y rápida de la densidad y la intensidad de puntos lagrimales proteína 19. Recientemente, un algoritmo de detección automática de sinapsis basado en el aprendizaje ha sido generada para la cuantificación del número de sináptica en 3D 20, aprovechando el software asistida por visualización 3D Análisis (Vaa3D) 21.

software de análisis de imagen comercial también son herramientas poderosas para cuantificaciones sinápticas. Por ejemplo, la fluorescenciareceptores de neurotransmisores marcado o un componente AZ presináptica se han cuantificado en tres dimensiones con la resolución de una sola sinapsis en C. elegans 22 o el sistema de Drosophila olfativo 23, 24, lo que permite cientos de sinapsis que se caracteriza rápidamente dentro de una sola muestra.

A continuación, presentamos un método por un software de análisis de imagen personalizada de plug-in implementado en un entorno de computación numérica multi-paradigma que permite analizar de forma semiautomática múltiples aspectos de AZS, incluyendo su número, la distribución y el nivel de enriquecimiento de los componentes moleculares de el AZ. Por lo tanto, este análisis complejo nos permitió evaluar la dinámica de los componentes sinápticos en terminales de los axones en diferentes condiciones ambientales. Se investigó el efecto de la exposición a la luz en las sinapsis de salida de los fotorreceptores de moscas adultas. El procedimiento se realiza en tres pasos: 1)preparación para la exposición a la luz, 2) la disección, inmunohistoquímica y microscopía confocal, y 3) el análisis de imágenes.

Protocolo

Los procedimientos experimentales descritos en el presente Protocolo se refieran exclusivamente trabajan con Drosophila y no están sometidos a las leyes de bienestar animal en Alemania y Japón.

1. Condiciones de exposición a la luz

  1. Preparar las moscas que llevan sensless-flipasa (sens-flp) y Bruchpilot-FRT-STOP-FRT-GFP (BRP-FSF-GFP) 15 para la visualización de BRP-GFP en las neuronas fotorreceptoras (R8) r8s. El locus genómico que codifica BRP dentro de un cromosoma artificial bacteriano (BAC) se modificó para generar esta construcción BRP-FSF-GFP. En las moscas que llevan este BAC modificado la expresión de Brp-GFP está bajo el control de las secuencias reguladoras endógenas, pero limitado a los fotorreceptores R8 después sensless-flipasa eliminación mediada de la casete FRT-STOP-FRT 15. Tenga en cuenta que sens-flp rara vez se expresa en flipasa R7s.
  2. Mantener las moscas en un 12 h lilucha / 12 h oscuridad ciclo (LD) a 25 ° C desde la etapa de larva hasta la eclosión (Figura 1A).
  3. Recoger las moscas 0 - 6 h después de la eclosión y colocarlos en un nuevo vial que contiene alimentos mosca.
  4. Establecer los viales en un bastidor transparente hecha de resina acrílica con tres pasos (una altura de 41 cm, una base de 21 cm, un espesor de 4 cm y una altura de 13 cm para cada paso) (Figura 1B).
  5. Ajustar la distancia entre la cremallera y un panel LED para proporcionar la iluminación con una intensidad media de 1.000 lux usando un medidor de luz digital (Figura 1C).
  6. Mantener las moscas por 1 - 3 d bajo una de las siguientes condiciones: oscuridad constante (DD), 12 h luz / 12 h oscuridad ciclo (LD), o la luz constante (LL) a 25 ° C en un incubador pequeño (Figuras 1A y 1C).

2. Disección, inmunohistoquímica e Imagen

  1. Diseccionar el cerebro de moscas con una pinza, fijarlas con el 4% formaldehyde y inmunotinción con el anticuerpo primario contra Chaoptin (01:50) y un segundo anticuerpo para la visualización de los fotorreceptores en base a los procedimientos experimentales anteriores 25. Brevemente:
    1. Preparar 0,1% de Triton X-100 en PBS (0,1% PBT). Esta solución se utiliza para mejorar la penetración del tejido de anticuerpos.
    2. Anestesiar las moscas en un cojín de CO 2, resolver el genotipo correcto y transferirlos a una placa de Petri llena con 0,1% de PBT.
    3. Se adhieren las pinzas debajo de la trompa y salga de los ojos derecho e izquierdo, respectivamente, con los otros fórceps.
    4. Retire la trompa y la tráquea adherida al cerebro.
    5. Transferir el cerebro con las pinzas en un tubo de 1,5 ml que contenía 150 l de 0,1% PBT a TA.
    6. Dentro de 10 minutos de repetición de 2.1.3 - 2.1.5 para obtener la mayor cantidad posible de cerebros.
    7. Añadir 50 l de 16% de formaldehído en el tubo y mezclar mediante pipeteo.
    8. Incubar el cerebro en fijador en la salatemperatura durante 50 min.
    9. Lavar tres veces con 200 l de 0,1% PBT con una micropipeta, prestando atención a dejar el cerebro en el tubo.
    10. Después del último lavado, retire el PBT 0,1% y añadir la solución de anticuerpo primario, preparado de la siguiente manera: añadir a 196 l de 0,3% PBT (0,3% de Triton X-100 en PBS) 4 l de anti-Chaoptin anticuerpo (dilución final 1 : 50) para la visualización de los fotorreceptores.
    11. Incubar los cerebros en la solución de anticuerpos primarios a 4 ° CO / N.
    12. Lavar 3 veces con 200 l de 0,1% PBT con una micropipeta.
    13. Después del último lavado, eliminar el PBT 0,1% y añadir 200 l de las PBT 0,3% que contiene un anticuerpo secundario.
    14. Incubar en la oscuridad a 4 ° CO / N.
    15. Lavar tres veces con 200 l de 0,1% PBT con una micropipeta.
  2. Para el montaje, poner dos pequeñas gotas (2 l cada una) de un medio de montaje con una micropipeta en el centro de un portaobjetos de microscopio en aproximadamente 2 cm distana vez que el uno del otro.
  3. Coloque dos cubreobjetos, uno en cada gota y dejar un hueco estrecho entre los cubreobjetos de aproximadamente 0,2 mm.
  4. Colocar 15 l de un medio de montaje en la parte superior del cubreobjetos y añadir los cerebros con una micropipeta en el medio de montaje.
  5. Bajo un microscopio de disección, coloque el cerebro con el lado ventral hacia arriba en el espacio estrecho entre los dos cubreobjetos (Figura 2).
  6. Colocar un cubreobjetos en la parte superior y sellar los bordes del cubreobjetos usando esmalte de uñas transparente para fijar la muestra (Figura 2).
  7. Obtener imágenes de los cerebros con un microscopio confocal. Utilice un objetivo de inmersión en aceite 63X objetivo (1,4 NA) y un zoom digital de 2.6X. Generar más de 20 secciones ópticas de la segunda médula del ganglio óptica con un tamaño de paso de 0,5 micras.

3. Generación de los lugares, objetos de superficie, puesta en puntos y Puntos terminales

  1. Para cuantificar el número, distribution y el nivel de deslocalización de BRP-GFP puntos lagrimales, abren la pila obtenida por microscopía confocal en el software de análisis de imágenes y reconstituir las imágenes en 3D (Figura 3A). Tenga en cuenta que el paso en este estudio se realizó con Imaris.
  2. Identificar los puntos lagrimales BRP-GFP por el módulo de detección de puntos para cada terminal del axón R8.
    1. Seleccione "Añadir nuevos puntos".
    2. Seleccione "Segmento solamente una zona de interés" en la configuración del algoritmo. Seleccionar un terminal del axón R8 en la médula manualmente.
    3. Seleccione el canal de la fuente de la señal de BRP-GFP.
      NOTA: Los axones fotorreceptoras R7 y R8 se immunolabeled con anti-Chaoptin (Figura 3A). Sólo R8, sin embargo, contiene Brp-GFP puntos lagrimales y por lo tanto se puede distinguir fácilmente (Figura 3A). Además, el punto final de R8 puede ser identificado por el adelgazamiento de los axones anti-Chaoptin-positivos en el punto de entrada en la capa de médula M3.
    4. Ajuste el diámetro XY t estimadoo 0,35 micras y marque "sustracción de fondo" en la detección de puntos.
    5. Seleccione "Calidad" en el tipo de filtro y el filtro de forma automática. A continuación, haga clic en Finalizar.
    6. Repita desde el 3.2.1 t- 3.2.5 para otros axones R (Figura 3B).
  3. Para medir el nivel de deslocalización de BRP-GFP en los axones R8, generar objetos de superficie con la función de "Surface" para cada axón (Figura 3C).
    1. Seleccione "Añadir nuevas superficies".
    2. Seleccione "Segmento solamente una zona de interés" en la configuración del algoritmo. A continuación, seleccione una terminales de los axones en la médula R8 manualmente.
    3. Seleccione el canal de origen de los fotorreceptores.
    4. Marque "Smooth".
    5. Seleccione "intensidad absoluta" en el umbral.
    6. Marque "Activar". "Semilla Puntos" de diámetro es de 0,5 micras.
    7. Elija un filtro de tipo "Calidad" y "Número de voxels" y, a continuación, filtrar automáticamente.
    8. Ir a "Editar" y eliminar las piezas de las superficies generadas en otros axones no interesantes.
    9. Repita desde el 3.3.1 - 3.3.8 para otros axones R (Figura 3C). Nota Algunos objetos de superficie fueron interrumpidos debido a la delgadez y la señal débil en los fotorreceptores en la capa M2, pero seguían siendo considerados como un único objeto de principio a puntos finales.
  4. Para identificar la distribución de los puntos lagrimales Brp-GFP a lo largo de cada neurona en el neuropilo médula, definir el punto de inicio y punto final con la función de punto de medición (Figura 3D).
    1. Seleccione "Añadir nuevos puntos de medición". A continuación, seleccione "Editar" y seleccione "Superficie de objeto" para intersectar con la parte superior de los objetos de superficie.
    2. Ponga puntos de medición en la parte superior de los objetos de la superficie de los axones R de capa M1 en orden. Estos se definen ahora como puesta en puntos (Figura 3D).
    3. Seleccione "Añadir nuevos puntos de medición".A continuación, seleccione "Editar" y seleccione "Superficie de objeto" para intersectar con la parte inferior de los objetos de superficie.
    4. Ponga puntos de medición en la parte inferior de los objetos de superficie de axones R en capa M3 en orden. Estos se definen ahora como puntos finales (Figura 3D).
  5. Para restar la señal de fondo del canal de GFP, generar objetos superficiales, manchas, comienzo de puntos y los puntos finales de dos axones R en la capa de M6 (Figura 3E).
    1. Seleccione "Añadir nuevas superficies".
    2. Seleccione "Segmento solamente una zona de interés" en la configuración del algoritmo. A continuación, seleccione un terminal del axón R7 entre M5 y M6 capa manualmente.
    3. Seleccione el canal de origen del fotorreceptor.
    4. Marque "Smooth".
    5. Seleccione "intensidad absoluta" en el umbral.
    6. Seleccionar el tipo de filtro "Calidad" y "Número de voxels", luego filtrar de forma automática.
    7. Seleccione "Añadir nuevos puntos";.
    8. Seleccione "Omitir la creación automática, editar manualmente".
    9. Seleccione "Centro de objeto" y añadir un punto en la zona interna del objeto superficie generada a partir de 3.5.1 - 3.5.6.
    10. Repita desde el 3.5.1 - 3.5.9 para otro terminal del axón R7.
    11. Seleccione "Añadir nuevos puntos de medición". A continuación, seleccione "Editar" y poner puntos de medición en la parte superior de los dos objetos en la superficie de la punta de la terminal del axón R7 en la capa M6. Estos se definen ahora como puesta en puntos.
    12. Seleccione "Añadir nuevos puntos de medición". A continuación, seleccione "Editar" y poner puntos de medición en la parte inferior de los dos objetos en la superficie de la punta de la terminal del axón R7 en la capa M6. Estos se definen ahora como puntos finales (Figura 3E).

4. Cálculo del número de manchas, Distribución de la frecuencia puntual y nivel de enriquecimiento de BRP-GFP con una imagen personalizada de software de análisis de datos

  1. Copiar el archivo"XtquantifySynapseSNR.m" y la carpeta "funciones" en la carpeta de MATLAB Imaris XT. Tenga en cuenta que el cálculo en este estudio se realizó con un plugin personalizado implementado en Matlab. Descargar el plugin desde la página web ( https://github.com/cmohl2013/synapse_trafo ).
  2. Abrir un conjunto de datos con n puntos, n superficies y objetos de punto de medición 2, cada uno con puntos de medición (n preparados a partir de 3.1 - 3.4). El primer objeto punto de medición define las posiciones de inicio para todos los axones. El segundo objeto de punto de medición define la posición final de todos los axones. Ambos objetos de puntos de medición deben tener el mismo número de puntos de medición (es decir el número de axones).
  3. Ejecutar el procesamiento de imágenes >> CUSTOM> atsushis detección de sinapsis Vs 6.
  4. Compruebe metadatos y cambiar el tamaño de píxel en el software de análisis de imágenes en caso de que no es correcto.
  5. Elija un canal para la perforaciónormance del análisis intensidad de las manchas y las regiones citoplásmicas (el canal con BRP-GFP).
  6. Definir el nombre del archivo para exportar los resultados.
  7. Definir el número de contenedores y la longitud del axón en por ciento. Introduce el número de contenedores como "10" y la gama de contenedores como "100%" (Figuras 4A y 4B).
  8. Definir las regiones de las manchas y las otras regiones citoplásmicas para el análisis deslocalización Brp-GFP. Introduce los puntos RADIUS como "0,35 m" y el ancho del área como "50 micras" circundante. El radio de los puntos define la región para la señal de puntos lagrimales GFP (0,35 m de diámetro, centrado en un punto lagrimal). La anchura de la zona circundante define la región de la señal de GFP en la zona citoplasmática (50 m de diámetro, centrado en el punto lagrimal, pero incluyendo sólo R8 y excluyendo todas las áreas de punto en el citoplasma) (Figuras 4A y 4C).
  9. Espere hasta que todas las máscaras de neuronas se procesany exportados como archivos PDF (Figuras 4B y 4C) y una tabla CSV para su posterior análisis en una hoja de cálculo. La tabla csv incluye el número de las manchas, la intensidad media de la señal en el "área citoplasmática" y la intensidad máxima de la señal en el "punto" en cada bin para todos los axones R8.
  10. Abrir un conjunto de datos preparado en 3.5 para la sustracción de la señal de fondo.
  11. Realizar el procesamiento de imágenes como descrito desde el 4.3 - 4.9.
  12. Calcular el promedio del número total y la distribución de los puntos lagrimales Brp-GFP en una hoja de cálculo (Figuras 4D y 4E).
  13. Calcular el promedio de la deslocalización de señal Brp-GFP en una hoja de cálculo por la relación de la intensidad media en la "zona citoplasmática" dividido por la intensidad máxima en el "punto" restado por la intensidad media de la señal de fondo (Figura 4F) .

Resultados

El ojo compuesto de Drosophila comprende ~ 780 ommatidia, conteniendo cada uno de los ocho tipos de fotorreceptores (R1-8). R7 y R8 proyecto sus axones a la segunda ganglio óptico, la médula, donde forman sinapsis en capas M6 y M3, respectivamente 26. Para investigar el efecto de la exposición prolongada a la luz sobre la composición molecular de los fotorreceptores R8 zonas activas, tomamos ventaja del método STaR 15. Los niv...

Discusión

En este estudio, mostramos cómo preparar las condiciones de luz para exponer las moscas a una intensidad de luz igual. Hemos cuantificado no sólo el número de puntos lagrimales sináptica marcador, pero también podríamos resolver espacialmente la densidad de las sinapsis a lo largo de los axones y medir el nivel de deslocalización de la proteína marcadora en zonas citoplasmáticos. Estos tres evaluaciones nos permiten evaluar los detalles de la dinámica sináptica de las neuronas a nivel individual en diferentes...

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Agradecimientos

Estamos muy agradecidos a T. Sturner para correcciones votos, discusiones y comentarios sobre el manuscrito; SL Zipursky para proporcionar poblaciones de moscas; M Schölling para tareas de procesamiento. Parte del análisis de imágenes se realizó en el laboratorio de A. Kakita. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Alexander von Humboldt y JSP Becas para la Investigación en el Extranjero (AS), JSP Fellows (SH-S.), Grant-In-Ayuda para la puesta en marcha (24800024), en áreas innovadoras (25110713), Mochida, Takeda, Inamori, Daiichi Sankyo-, Fundamentos Toray (TS), la financiación básica DZNE (GT) y el Fondo para DZNE Microscopía de Luz (CM).

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
VialHightech, JapanMKC-20
PlugThermo Fisher Sciehtific, USAAS-275
Customized transparent rack made of acrylic resin Shin-Shin Corporation, Japana height of 41 cm, a base of 21 cm, a thickness of 4 cm and a height of 13 cm for each step
Cool incubatorMITSUBISHI ELECTRIC, JapanCN-40A
LED panelMISUMI, JapanLEDXC170-W
Digital light meterCEMDT-1301
Fly padTokken, JapanTK-HA03-S
Petri dish (35 x 10 mm)Greiner Bio-One International, Germany627102
PBS tabletTakara, JapanT900
Triton X-100Wako, Japan160-24751
Dumont #5 ForcepsFine Science Tools11251-20
1.5 ml tubeSarstedt, GermanyA. 152X
Formaldehyde 16%NEM, Japan3152
Pipetman P-200GilsonF123601 
Pipetman P-20GilsonF123600
Pipetman P-2GilsonF144801
anti-chaoptin antibodyDSHB24B10
Alexa568-conjugated anti-mouse antibodyLife TechnologiesA-11031
VECTASHIELD Mounting MediumVector Laboratories, Inc.H-1000
Microscope slide (76 x 26 mm)Thermo Fisher Scientific Gerhard Menzel B.V. & Co. KG, Germany
Coverslip (18 x 18 mm, 0.17 mm)Zeiss, Germany474030-9000-000
Industrial MicroscopesOlympus, JapanSZ61-C-SET
Stereo Microscope LightingOlympus, JapanKL 1600 LED
confocal microscopyZeiss, GermanyLSM780
ImarisBitplane, SwitzerlandVersion 7.6.4 or above
MatlabThe MathWorks, Inc., USA
Excel for Mac Microsoft

Referencias

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