Aislamiento simultáneo de cardiomiocitos de alta calidad, células endoteliales y fibroblastos de un corazón de rata adulto

Resumen

Se han desarrollado y descrito varios protocolos para el aislamiento de diferentes tipos de células cardíacas de un corazón de rata. Aquí se describe un protocolo optimizado que permite el aislamiento de los principales tipos de células cardíacas de alta calidad (cardiomiocitos, células endoteliales y fibroblastos) de una sola preparación, reduciendo los costos experimentales.

Resumen

La rata es un importante modelo animal utilizado en la investigación cardiovascular, y las células cardíacas de rata se utilizan rutinariamente para el análisis in vitro de los mecanismos moleculares de la progresión de la enfermedad cardiovascular, tales como hipertrofia cardíaca, fibrosis y aterosclerosis. Aunque se han hecho varios intentos con éxito variable para desarrollar líneas celulares inmortalizadas desde el sistema cardiovascular para comprender estos mecanismos celulares, las células primarias ofrecen un entorno más natural y cercano al in vivo para tales estudios. Por lo tanto, diferentes laboratorios que trabajan en un tipo particular de células han desarrollado protocolos para aislar tipos individuales de células cardíacas de rata de interés. Sin embargo, falta un protocolo que permita el aislamiento de más de un tipo de célula. Aquí se describe un protocolo optimizado que permite el aislamiento de los principales tipos de células cardíacas de alta calidad (cardiomiocitos, células endoteliales y fibroblastos) de una sola preparación y permiteR para análisis celulares. Esto permite el uso más eficiente de los recursos disponibles, lo que puede ahorrar tiempo y reducir los costos de investigación.

Introducción

Los modelos de roedores se han utilizado durante mucho tiempo como herramientas para ampliar nuestra comprensión de la fisiología cardiovascular en la salud y la enfermedad. ¹ Aunque estos modelos animales nos permiten comprender la fisiopatología de una enfermedad a nivel de órganos y analizar la farmacocinética y farmacodinámica de diversos agentes farmacológicos utilizados para el tratamiento de enfermedades cardiovasculares, la comprensión de los mecanismos moleculares del desarrollo de enfermedades cardiovasculares y la contribución de una enfermedad particular Tipo de célula requiere el uso de modelos de cultivo celular in vitro . Para este propósito se han desarrollado diferentes líneas celulares inmortalizadas del sistema cardiovascular; ^{2 , 3} sin embargo, las células primarias recién aisladas son fisiológica y funcionalmente más relevantes para los tejidos y organismos vivos.

El corazón es un órgano versátil que contiene todos los tipos principales de células del sistema cardiovascular.Y el corazón de la rata sigue siendo un modelo comúnmente utilizado para la comprensión de la fisiología cardiovascular. Durante las últimas décadas, se han descrito diferentes métodos para aislar tipos de células individuales del tejido cardíaco; ^{4 , 5 , 6 , 7} sin embargo, estos métodos se centran solamente en el aislamiento de un tipo celular específico que da como resultado la pérdida de otros tipos de células que ya no se pueden usar para el análisis celular. Aquí se describe un protocolo optimizado que permite el aislamiento simultáneo y de alta calidad de los principales tipos celulares de tejido cardíaco, es decir, cardiomiocitos, células endoteliales y fibroblastos. Todos estos tipos de células se pueden utilizar en diferentes configuraciones experimentales ^{8 , 9 , 10} y para el análisis de las interacciones célula-célula del mismo animal.

Protocolo

La investigación se ajusta a la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio publicado por los Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos (NIH Publication No. 85-23 1985) y fue aprobada por el comité local de ética de la Universidad de Giessen. En este estudio se usaron ratas Wistar macho adultas que pesaban 200 - 250 g.

1. Autoclave

1. Al menos un día antes de que se lleve a cabo el procedimiento, esterilice en autoclave todos los instrumentos quirúrgicos, las puntas de pipeta y las pipetas Pasteur que se utilizarán en el procedimiento de aislamiento a 121 ° C durante 30 min.

2. Preparación de medios y soluciones

NOTA: Las soluciones de los pasos 2.1-2.4 se pueden preparar hasta una semana antes del aislamiento y almacenarse a 4 ° C, pero preparar las soluciones en los pasos 2.5-2.8 el día del aislamiento. Las recetas completas de los tampones y los medios se dan en la Tabla 1 . Calentar todos los medios y soluciones a 37 ° C en unaBaño de agua antes de comenzar la preparación.

1. Preparar el medio Powell disolviendo los productos químicos enumerados en la Tabla 1 en 4,5 L de H ₂ O a temperatura ambiente (RT). Ajustar el pH a 7,4 con NaOH 2,0 N, y llevar el volumen a 5,0 L. Filtrar la solución estéril y almacenarla a 4 ° C.
2. Preparar el medio de creatina, L-carnitina y taurina (CCT) disolviendo el medio en polvo M199 en 4,5 L de H ₂ O. A~nadir polvo HEPES de acuerdo con Table al medio y mezclar durante 15 min. Añadir creatina, carnitina, taurina y Ara-C de acuerdo con la Tabla 1 . Mezclar bien, ajustar el pH con pH metro a 7,4 con NaOH 2,0 N, y llevar el volumen a 5,0 L. Filtro estéril y almacenar a 4 ° C.
3. Preparar el medio de cultivo celular para los fibroblastos mediante la adición de 10% de suero de ternera fetal (FCS) y 2% de penicilina / estreptomicina (Pen / Strep) al medio M199. El DMEM es igualmente adecuado como M199 y también puede usarse para el cultivo de células de fibroblastos.
4. Preparar la cultura celular MV2E para las células endoteliales mediante la adición de todos los contenidos de la mezcla de suplementos al medio basal MV2 de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Tomar una alícuota de 5 ml y calentarla a 37 ° C en un baño de agua.
5. Preparar el tampón de aislamiento de células endoteliales disolviendo 0,05 g de albúmina de suero bovino (BSA) en 50 ml de solución salina equilibrada de Hanks (HBSS) y añadiendo 0,5 ml de solución de ácido etilendiaminotetraacético 200 mM (EDTA). Filtre el filtro estéril y guárdelo a 4 ° C.
6. Preparar el tampón de lavado de células endoteliales mediante la adición de 0,1 ml de 200 mM a 9,9 ml de PBS y almacenar a 4 ° C.
7. Preparar solución de colagenasa mediante la disolución de 27 mg de colagenasa en 5 ml de medio Powell y la adición de 12,5 μ l de 100 mM CaCl ₂ solución a la misma. Calentar a 37 ° C en un baño de agua.
8. Prepare soluciones incrementales de restauración de Ca ^{2 +} 1, 2 y 3 para cardiomiocitos mediante la adición de 12,5 μL, 25 μL y 120 μL de solución de CaCl2 100 mMIon a 6 ml, 6 ml y 12 ml de medio Powell, respectivamente.
9. Pre-recubrir las placas de cultivo celular para cardiomiocitos un día antes del aislamiento mediante la adición de 1 ml de medio de pre-recubrimiento que contiene laminina a cada plato de cultivo celular de 35 mm. Incubarlos en el incubador de cultivo celular a 37ºC durante la noche.

3. Preparación de cuentas magnéticas

1. Coloque 0,5 ml del tampón de aislamiento de células endoteliales en un tubo de muestra de 1,5 ml en hielo.
2. Añadir 5 μl (2 x 10 ⁶ ) de perlas magnéticas de ratón de ratón y mezclar bien.
3. Coloque el tubo en el soporte magnético durante 1 min. Las perlas se adherirán a la pared del tubo hacia el imán. Retire cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta de 1 ml.
4. Repetir el lavado dos veces más y finalmente volver a suspender las perlas en 50 μ l de aislamiento celular de células endoteliales y almacenar a 4 ° C hasta su uso.

4. Preparación del sistema de perfusión de Langendorff

1. LimpioEl sistema de Langendorff por perfusión con 2 L de agua destilada.
2. Circule 50 ml de medio Powell a través del sistema durante 5 min y deseche el medio.
3. Añadir 80 ml de medio Powell fresco. Perfundir continuamente con "carbogen" burbujeando con una pipeta Pasteur de vidrio del cilindro de gas. Deje que el medio recircule a través del sistema. El sistema está ahora listo para perfundir el corazón ( Figura 1A ).

5. Disección de la Rata

1. Coloque la rata en un desecador de 5 l bajo una campana extractora de humos y añada 1,5 ml de isoflurano al 4-5% a través del respiradero y cierre la tapa.
   NOTA: Colocar el animal sobre una placa perforada elevada dentro del desecador para evitar el contacto directo del animal con el isoflurano líquido.
2. Espere hasta que la rata pierda su reflejo de la tapa (generalmente ~ 5 min), y entonces tome la rata del desecador. Eutanasia de la rata por dislocación cervical.
3. Corte la piel abdominal y el músculo subyacente horizontalAliado en el medio usando un par de tijeras afiladas. Después, corte el músculo verticalmente al esternón de la rata y abra el tórax. Retire el corazón junto con los pulmones e inmediatamente coloque los órganos en una solución de NaCl al 0,9% enfriada con hielo.
4. Retire los pulmones con la ayuda de un par de tijeras y deséchelos. Limpiar el corazón de cualquier tejido conectivo, y cortar la aorta caudalmente en la rama del tronco braquiocefálico.

6. Perfusión del corazón y digestión con colagenasa

1. Monte el corazón a través de la aorta en el sistema de perfusión de Langendorff (sección 4) usando dos pares de fórceps finos y curvos. Para asegurar que el miocardio se perfunde de manera retrógrada, coloque el extremo de la cánula del sistema de perfusión entre la primera rama aórtica y la válvula aórtica. Fijar la aorta con una abrazadera de cocodrilo.
2. Fijar el corazón con una sutura quirúrgica, y quitar la abrazadera de cocodrilo ( Figura 1B ).
3. Abra la válvula de la cánula para permitir que el medio de perfusión (35 ml) pase a través del corazón gota a gota (60 gotas / min, 5 ml / min) para lavar cualquier sangre residual. Deseche cualquier flujo a través de esta etapa.
   NOTA: Evite la formación de burbujas de aire en cualquier etapa de la perfusión ya que esto resultará en una digestión incompleta y un fallo en el procedimiento de aislamiento celular.
4. Coloque el corazón colgante en el embudo de recogida (cámara del corazón, Figura 1B ) e inicie la bomba peristáltica, que recirculará el medio de perfusión desde el embudo de recogida hasta el depósito ( Figura 1A ).
5. Añadir la solución de colagenasa (del paso 2.8) al medio de perfusión. Perfundir el corazón con la solución de colagenasa recirculante durante 30 min.
   NOTA: Este paso es muy crítico para optimizar el rendimiento celular. El tiempo de perfusión depende de la actividad de la colagenasa, que puede variar dependiendo del lote. Pruebe 3-4 lotes de colagenasa para encontrar el uno con optiMal actividad; Entonces se pueden comprar grandes cantidades del lote más adecuado que son suficientes por lo menos un año para obtener resultados reproducibles.
6. Al final del tiempo de digestión, detener la perfusión, quitar el corazón del sistema de Langendorff con un par de tijeras, y colocarlo en una placa de Petri de vidrio.
7. Cortar y descartar ambas aurículas, y eliminar los tejidos grasos sobrantes. Cuidadosamente pelar el pericardio con la ayuda de dos pares de fórceps para evitar la contaminación de las células epiteliales.
   NOTA: El pericardio puede ser digerido adicionalmente con colagenasa para obtener células epiteliales cardiacas puras si es necesario. No se da un protocolo detallado en el presente estudio ya que esto está más allá del alcance del presente protocolo.
8. Cortar el corazón por el centro con un par de tijeras y ponerlo en el helicóptero de tejido. Picar el corazón 2-3 veces y volver a suspender el tejido fino en 12 ml del tampón de la digestión de la perfusión de Langendorff.
   NOTA: No corte la hEart en exceso, ya que esto dará lugar a una mayor proporción de cardiomiocitos muertos.
9. Transferir el tejido picadito en 15 ml de medio de disociación que contiene colagenasa y dejar que digerir en un baño de agua durante 5-10 min con mezclas ocasionales por resuspensión utilizando una pipeta de plástico desechable de 5 ml.
10. Al final del período de digestión, filtrar la suspensión celular a través de un tamiz de 100 μm. Deseche los restos de tejido y el material no digerido.
11. Al final de la perfusión de Langendorff, enjuague inmediatamente el sistema de perfusión con un mínimo de 1 L de agua destilada. Perfundir el sistema mediante la recirculación de 100 mL de NaOH 0,1 N durante 30 min, y finalmente enjuagar el sistema con 2-3 l de agua destilada. Seque el sistema por lavado de aire y cubra la abertura con para-película.

7. Aislamiento celular de la rata

1. Aislamiento y cultivo de cardiomiocitos
   1. Centrifugar la suspensión celular a 25 xg durante 1 min (sin brAkes) para sedimentar los cardiomiocitos. También se puede permitir que los cardiomiocitos se sedimenten durante 10 minutos a RT sin centrifugación.
   2. Retire cuidadosamente el sobrenadante que contiene células endoteliales y fibroblastos con la ayuda de una pipeta de plástico desechable en un nuevo tubo de 50 ml.
   3. Resuspender el sedimento de cardiomiocitos en Ca ^{2 +} 6 ml de solución 1 (Etapa 2.9). Dejar 1 minuto para que las células se ajusten al bajo ambiente de concentración de Ca2 ⁺ , y centrifugar la suspensión celular de nuevo a 25 xg durante 1 minuto (sin frenos).
   4. Deseche el sobrenadante y resuspenda el sedimento celular en 6 ml de solución de Ca ²⁺ 2 (Etapa 2.9). Permitir que las células de 1 minuto para ajustar a la concentración intermedia de Ca ^{2 +} , y, finalmente, añadir 12 ml de Ca ^{2 +} solución 3 (Paso 2.9) a las células. Mezclar con la ayuda de una pipeta de plástico desechable.
   5. Centrifugar la suspensión celular a 25 xg durante 1 min.
   6. Desechar el sobrenadante y resuspender las células en 20 ml pre- medio CCT calentado. Añadir 1 ml de la suspensión celular a cada una de 20 placas de cultivo celular estériles de 35 mm previamente recubiertas con laminina (Etapa 2.9) y dejar que las células se unan durante 2 h en una incubadora de cultivo celular libre de CO ₂ .
      NOTA: Los cardiomiocitos también pueden ser cultivados bajo ambiente de CO ₂ ; Sin embargo, en este caso se deben usar medios con sistema tampón de bicarbonato.
   7. Después de 2 h, reemplace el medio con 2 mL nuevos de medio CCT para eliminar las células muertas.
      NOTA: Las células están listas para cualquier experimento planeado y se pueden cultivar hasta 3 días en una incubadora de cultivo de células típica (sin CO ₂ ) sin pérdida significativa de células vivas. Los cardiomiocitos sanos típicos en forma de varilla se muestran en la Figura 2A .
2. Aislamiento de células endoteliales y fibroblastos
   1. Centrifugar el sobrenadante que contiene células endoteliales y fibroblastos (del paso 7.1.2) a 250 xg durante 10 min.
   2. Descarta la supeRnatant y resuspender el sedimento celular en 1,5 mL de tampón de aislamiento de células endoteliales en un tubo de muestra de 2 mL.
   3. Añadir 3 μg (1: 500) de anticuerpo CD31 de ratón anti-rata a la suspensión celular e incubar a 4 ° C durante 30 min con rotación de extremo a extremo.
      NOTA: Se recomienda una titulación del anticuerpo para una dilución óptima. Esta etapa se debe realizar a 4 ° C como en RT una rápida internalización de anticuerpos por las células endoteliales resultará en un bajo rendimiento.
   4. Añadir las perlas de IgG anti-ratón de pan preparadas previamente (Sección 3) a la suspensión de células e incubar durante 20 minutos a 4ºC con rotación de extremo a extremo.
      NOTA: Alternativamente, el anticuerpo CD31 de ratón anti-rata puede ser pre-unido a las perlas magnéticas y luego añadido a la suspensión celular. Sin embargo, esto aumentará el tiempo de incubación de las perlas con la suspensión celular y puede dar como resultado un aumento de la unión no específica de células no endoteliales y, por lo tanto, una mayor contaminación de otros tipos de células.
   5. UNAl final del tiempo de incubación del anticuerpo, coloque el tubo que contiene la suspensión de células en un estante magnético y deje 2 minutos para asentar las perlas magnéticas unidas a las células endoteliales al lado del tubo.
   6. Se retira cuidadosamente el resto de la suspensión celular (que contiene principalmente los fibroblastos) usando una pipeta de 1 ml y se añade a un plato de cultivo celular de 10 cm que contiene 10 ml de medio de cultivo celular de fibroblastos (Etapa 2.3). Colóquelo en una incubadora de cultivo celular típica que contenga 5% de CO ₂ . El procedimiento continúa en el paso 7.3.
   7. Añadir 1 ml de tampón de lavado al tubo con perlas magnéticas que contienen las células endoteliales.
   8. Tape el tubo, retírelo de la rejilla magnética y cuidadosamente resuspenda las perlas agitando suavemente 4 y 5 veces. Coloque de nuevo el tubo en el estante magnético, permita que las perlas se depositen en la pared del tubo durante 1 minuto, y retire cuidadosamente el tampón de lavado.
   9. Repita los pasos de lavado 5 - 7 veces para deshacerse de cualquier contaminante nEn células endoteliales.
   10. Resuspender las células endoteliales unidas a las perlas en 1 mL de medio de cultivo de células endoteliales MV2, agregar a un solo pocillo de una placa de 12 pocillos e incubar en un incubador de cultivo de células de CO ₂ .
   11. Deje que las células se adhieran durante la noche y cambie el medio al día siguiente y luego cada 2-3 días hasta que las células se conviertan en semi-confluentes (normalmente de 5 a 7 días).
       NOTA: Las células endoteliales no confluentes típicas después de 3 - 4 días y las células endoteliales confluentes después de 7-10 días de aislamiento se muestran en las Figuras 3A y 3B , respectivamente. Las células pueden entonces ser tripsinizadas (sección 7.4) y sembradas en un matraz de cultivo celular T25.
3. Lavado y cultivo de fibroblastos (continúe desde el paso 7.2.6)
   1. Después de 1 h de incubación, se aspira el medio y se lavan los fibroblastos unidos al plato de cultivo celular añadiendo un volumen apropiado de PBS precalentado. Aspirar el PBS y repetir el sTep 2-3 veces y finalmente añadir medio de cultivo de células de fibroblastos precalentados.
   2. Lavar las células unidas de nuevo al día siguiente con PBS precalentado (como en el paso anterior) y agregar medio fresco precalentado. Cambie el medio cada 2-3 días. Un fenotipo típico de fibroblastos en el día 2 de aislamiento se muestra en la Figura 4A .
      NOTA: Los fibroblastos se vuelven semi-confluentes usualmente dentro de 5-7 días y luego están listos para ser tripsinizados (sección 7.4) y se usan para los experimentos planificados. Con este procedimiento, usualmente obtenemos 95-99% de fibroblastos puros. Un fenotipo típico de fibroblastos en el día 7 de aislamiento se muestra en la Figura 4B .
4. Tripsinización de células endoteliales y fibroblastos
   1. Aspirar el medio de la placa de cultivo celular y añadir suficiente precalentado PBS para cubrir las células.
   2. Aspirar PBS y añadir suficiente solución de tripsina-EDTA (0,05% y 0,02%, respectivamente) para cubrir las células y colocar enE incubadora a 37ºC durante 5 min.
   3. Resuspender las células pipeteando las células hacia arriba y hacia abajo con la ayuda de una pipeta de 1 ml y detener la acción de tripsina mediante la adición de FCS al 10%.
   4. Se pelete la suspensión de células por centrifugación a 250 xg durante 10 min a TA.
   5. Resuspender las células en un volumen apropiado de medio de cultivo celular precalentado.

8. Caracterización celular endotelial

NOTA: La pureza de las células endoteliales se determina por la absorción de Dil-Ac-LDL y la inmunotinción del factor de von Willebrand (vWF). Las células se visualizan por fluorescencia o microscopía confocal ( Figuras 3C-3E ).

1. Absorción de Dil-Ac-LDL por células endoteliales
   1. Se tripsinizan las células endoteliales (etapa 7.4) y se cultivan durante la noche sobre cubreobjetos de vidrio en una placa de 12 pocillos (aproximadamente 10 x 104 células / cm2).
   2. Aspirar el medio y enjuagar las células con 1 mL de pre-wHBSS armado.
   3. Aspirar el HBSS y agregar 1 mL de medio de cultivo de células endoteliales que contenga 10 μg / mL de Dil-Ac-LDL y dejar las células en el incubador a 37 ° C durante 4 h.
   4. Aspirar el medio y enjuagar las células con PBS precalentado tres veces y fijarlas con 1 mL de paraformaldehído al 4% (PFA, disuelto en PBS). Incubarlos con PFA a 37 ° C durante 20 min.
      NOTA: El PFA es corrosivo; Siempre use guantes resistentes a los ácidos mientras maneja la solución de PFA.
   5. Aspirar la PFA, enjuagar las células en cubreobjetos en placas de 12 pocillos con 1 mL de PBS tres veces e incubarlos con solución de tinción nuclear TO-PRO (10 μM) durante 1 h a RT.
      NOTA: Si el filtro apropiado está disponible para el microscopio, también se puede usar 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI; 1 μg / mL). En este caso, el tiempo de incubación debe reducirse a 10 min.
   6. Enjuague las células en cubreobjetos en placas de 12 pocillos con 1 mL de PBS, aspire el PBS y repita el paso tres veces.
   7. Toma el cOverslip fuera de la placa de 12 pozos y montar en una diapositiva de vidrio con una gota de medio de montaje. Las células están listas para ser visualizadas bajo un microscopio fluorescente / confocal. Utilizar un filtro de excitación de 530-560 nm para Dil-Ac-LDL, 640 nm para TO-PRO y 340-380 nm para DAPI.
2. Tinción de Von Willebrand (vWF)
   1. Cultivo de las células endoteliales como se describe en el paso 8.1.1.
   2. Aspirar el medio y enjuagar las células con 1 mL de HBSS precalentado; Después, fijar con PFA al 4% como se describe en el paso 8.1.4.
   3. Aspirar el PFA, enjuagar las células en cubreobjetos en placas de 12 pocillos con 1 mL de PBS dos veces, y permeabilizar las células con 1 mL de Triton X-100 al 0,1% (en PBS) durante 20 min a RT.
   4. Aspirar la solución permeabilizing e incubar las células con solución de bloqueo (5% BSA / 5% FCS en PBS) durante 1 h.
   5. Incubar las células con anticuerpo de conejo anti-vWF (1: 100) a 4 ° C durante la noche en una cámara humidificada. Añadir un cubreobjeto sinE anticuerpo primario como control negativo.
   6. Enjuague las células en la placa de 12 pocillos con 1 mL de PBS tres veces e incube las células con anticuerpo Alexa Fluor-488 (1: 500) y solución de tinción nuclear TO-PRO (10 μM) durante 1 h A la temperatura ambiente.
   7. Enjuague las células en el cubreobjetos en una placa de 12 pocillos con 1 mL de PBS, aspire el PBS y repita el paso tres veces.
   8. Tome el cubreobjetos de la placa de 12 pocillos y montarlo en un portaobjetos de vidrio con una gota de medio de montaje. Las células están listas para ser visualizadas bajo un microscopio fluorescente / confocal. Utilizar un filtro de excitación de 490 nm para vWF y 640 nm para tinción nuclear.

Resultados

El procedimiento de aislamiento da como resultado un rendimiento de 70 - 80% de cardiomiocitos estriados viables, en forma de varilla ( Figuras 2A y 2C ) que pueden usarse para experimentos planificados. En nuestro laboratorio los cardiomiocitos se usan rutinariamente para el análisis de la señalización de Ca ²⁺ . La Figura 5A muestra las oscilaciones intracelulares de calcio [Ca2 ⁺ ] _i ...

Discusión

En este artículo se describe un protocolo reproducible para el aislamiento y el cultivo de miocitos cardíacos, células endoteliales y fibroblastos. Este protocolo describe el aislamiento simultáneo y de alta calidad de los principales tipos celulares de tejido cardíaco, es decir , cardiomiocitos, células endoteliales y fibroblastos en oposición a un solo tipo celular. Un paso crítico en el procedimiento de aislamiento es la correcta digestión del tejido cardíaco. Si la digestión es incompleta, todav?...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
anti-vWF	Santa Cruz Biotech.	SC-14014
Calcium chloride	Merck	102378
Carnitin	Sigma-Aldrich	C0283
Collagenase type II	Worthington	LS004176
Creatin	Sigma-Aldrich	C0780
D-Glucose	Merck	108342
Dil-Ac-LDL	Thermo Scientific	L3484
EDTA Solution (0.2 M)	Biochrome AG	L2113
Embeding solution	Citiflour	AF1-25
Endothelial cell medium MV2	PromoCell	C-22022
Foetal calf serum (FCS)	Biochrome AG	S0615
Gentamicin	Serva Chemicals	47991
HEPES	Sigma-Aldrich	H0887
Isoflurane	Abbott	TU 061219
Laminin	Roche/Sigma	11243217001
M199 medium	Thermo Scientific	11150059
M199 medium (Powder)	Biochrome AG	T061
Magnesium sulphate	Sigma-Aldrich	63138
Mouse anti-rat CD31 antibody (TLD-3A12)	Thermo Scientific	MA1-81051
NaCl solution (0.9%), Sterile	B. Braun	30820080
Pan mouse IgG beads (Dynabeads)	Thermo Scientific	11041
Paraformaldehyde (PFA) 4% Solution	Santa Cruz Biotech.	sc-281692
Penicillin-Streptomycin	Thermo Scientific	15070-063
Phosphate buffer saline (PBS) 1x	PAN-Biotech	P04-36500
Plastic consumables	Greiner Bio-One
Potassium Chloride	Merck	4933
Potassium dihydrogen phosphate	Merck	7873
Sodium Chloride	Merck	6404
Sodium Hydroxide Solution (2 N)	Merck	109136
Sterile filtration system	Thermo Scientific	5660020
Taurine	Sigma-Aldrich	T8691
TO-PRO	Thermo Scientific	T3605
Trypsin-EDTA Solution (10x)	Sigma-Aldrich	T4174
Water, Sterile	B. Braun