LERLIC-MS / MS para la caracterización en profundidad y cuantificación de glutamina y asparagina desamidación en escopeta Proteómica

Resumen

Aquí se presenta un protocolo paso a paso de la longitud larga electrostática método (LERLIC-MS / MS) repulsión-hidrófilo interacción cromatografía-espectrometría de masas tándem. Esta es una metodología novedosa que permite por primera cuantificación tiempo y caracterización de los glutamina y asparagina isoformas de desamidación por proteómica escopeta.

Resumen

Caracterización de la desamidación de proteínas es imprescindible para descifrar el papel (s) y las potencialidades de esta modificación postraduccional de proteínas (PTM) en la patología humana y otros contextos bioquímicos. Para llevar a cabo la caracterización de la desamidación de proteínas, hemos desarrollado recientemente una novela de longitud larga electrostática interacción cromatografía-espectrometría de masas tándem repulsión-hidrófilo (LERLIC-MS / MS) método que puede separar la glutamina (Gln) y asparagina isoforma (Asn) productos de desamidación de compuestos modelo a muestras biológicas muy compleja. LERLIC-MS / MS es, por lo tanto, la primera estrategia proteómica escopeta para la separación y cuantificación de las isoformas de desamidación de Gln. También demostramos, como novedad, que el protocolo de procesamiento de muestras descrito aquí estabiliza el intermedio de succinimida que permite su caracterización por LERLIC-MS / MS. Aplicación de LERLIC-MS / MS, como se muestra en este artículo de vídeo puede ayudar a dilucidar el momento desconocidaarrays n moleculares de desamidación de proteínas. Además, LERLIC-MS / MS proporciona una mayor comprensión de las reacciones enzimáticas que abarcan la desamidación en fondos biológicas distintas.

Introducción

La desamidación es una modificación postraduccional de proteínas (PTM) que introduce una carga negativa a la cadena principal de proteína a través de la modificación de la asparagina (Asn) y / o residuos de glutamina (Gln) ^1. Esta modificación mientras que afecta a los residuos de Asn genera el ácido isoaspártico productos isómeros (isoAsp) y N ácido aspártico (Asp) a una común relación 3: 1 ^2. No obstante, esta relación puede ser alterado por la intervención de la enzima de reparación metiltransferasa-L isoaspartilo (PIMT) ^{3, 4.} Del mismo modo, la desamidación de los residuos de Gln genera el ácido isomérica-gamma glutámico (γ-Glu) y las isoformas de ácido alfa-glutámico (α-Glu) a una esperada proporción de 1: ^{3, 5} 7, pero esta relación puede ser desplazado por la acción de la transglutaminasa omnipresente enzima 2 y otras transglutaminasas, incluyendo transglutaminasa 1, un correonzyme identificado recientemente como asociada con vesículas extracelulares en el cerebro ^6.

El origen de la desamidación puede ser ya sea espontánea o enzimática, el primero es especialmente común en los residuos de Gln en la que transglutaminasas y otras enzimas median reticulación / intra-molecular entre a través de transamidación (ver ³ para más detalles sobre Gln transamidación y sus implicaciones en varios crónica y enfermedades humanas mortales). Por lo tanto, la desamidación es una PTM que tiene una repercusión fundamental en la estructura y función de las moléculas afectadas ^{4, 7, 8} y requiere de una caracterización química en profundidad ³ a la luz de sus diversas consecuencias bioquímicas incluyendo su servicio de reloj como molecular del envejecimiento ⁹ .

Aunque la desamidación de residuos de Asn ha sido relativamente bien caracterizado por la proteómica escopeta de abajo hacia arriba ^{1, 10,} desamidación de residuos de Gln todavía no tiene un método de caracterización adecuada más allá del análisis desafiante de compuestos modelo por la fragmentación radical a base de electrones ^11. Recientemente hemos desarrollado un novedoso de una sola dimensión estrategia proteómica escopeta (LERLIC-MS / MS) ³ que permite la separación de Gln y Asn isoformas de desamidación partir de muestras biológicas complejas y compuestos modelo en un solo análisis. LERLIC-MS / MS se basa en la separación de trípticos digeridos péptidos usando una larga de longitud (50 cm) columna de intercambio iónico (LAX) que trabaja en el modo de cromatografía de interacción electrostática de repulsión-hidrófilo (ERLIC) y acoplada a espectrometría de masas tándem (LC- MS / MS). Esta nueva estrategia de análisis se ha utilizado para caracterizar y relativamente cuantificar la extensión de cada residuo desamidada en los tejidos cerebrales humanosf "> 3. Sin embargo, el protocolo descrito aquí proporcionará imágenes de vídeo de LERLIC-MS / MS dirigido a estudiar las peculiaridades de la desamidación de proteínas en el contexto bioquímico de interés.

DECLARACIÓN DE ÉTICA

Todos los procedimientos de este protocolo han sido aprobados por la junta de revisión institucional de la Universidad Tecnológica de Nanyang en Singapur y se han realizado de acuerdo con las directrices institucionales.

Protocolo

1. Embalaje El anión de intercambio de longitud larga columna (LAX) Capilar

(Nota: A pesar de la columna puede ser de LAX en el hogar lleno como se describe en este protocolo, columnas LAX también están disponibles comercialmente, véase la Tabla de Materiales y Reactivos para más detalles).

1. Suspender 50 mg de material de embalaje de intercambio aniónico débil en 3,5 ml de tampón de embalaje (Tabla 1) para preparar la suspensión.
2. Montar el extremo de la columna capilar (50 cm de longitud - 200 m de diámetro interno ID del tubo ()) usando una de hembra a hembra apropiado, una férula y una tuerca hembra. Coloque una pantalla de 1/16" OD de 1 micra de tamaño de poro dentro de la guarnición-hembra a hembra. (Nota: La pantalla que se utiliza aquí debe tener un tamaño de poro más pequeño que el tamaño de partícula del material de embalaje para evitar la fuga del material de la columna).
3. Empaque el capilar con la suspensión usando una bomba de presión operado a 4500 psi. (Nota: Pack de la column hasta que el material de embalaje es visible en la entrada de la columna).
4. Montar el otro extremo de la columna capilar como se describe en el punto 1.2.

Preparación 2. Muestra

Este protocolo describe la aplicación de LERLIC-MS / MS para analizar los tejidos cerebrales humanos como modelo proteoma. (Nota: En el caso de utilizar otros tejidos o muestras de proteómica, los procedimientos de preparación de muestras deben ser adaptados.)

1. Homogeneización de tejidos:
   a. tejidos cerebrales de lavado (50 a 100 mg) con solución tampón de fosfato 1x durante cinco minutos tres veces.
   segundo. Homogeneizar el tejido en 1: 1: (Tabla 2) 2.5 tejido / de los granos metálicos / tampón de homogeneización SDC (w / w / v) durante 5 min a 4 ° C en tubos de bloqueo de seguridad en intensidad máxima usando un homogeneizador de tejidos. (Nota: tampón de homogeneización SDC puede incluir inhibidores de la proteasa como se ha indicado anteriormente en ³⁾
   do. Centrifugar el homogeneizado de tejido, obtenido from el paso anterior, a 10.000 x g, 4 ° C durante 10 minutos y recoger el sobrenadante en un nuevo tubo de 1,5 ml.
   re. Repita los pasos bc para los gránulos restantes y combinar los sobrenadantes tantas veces como sea necesario hasta que no se observa ningún sedimento. (Nota: Si usted tiene que repetir los pasos bc más de dos veces, mover la muestra y las cuentas a un nuevo tubo de fallos de bloqueo para evitar la pérdida de muestra durante la etapa de centrifugación).
   mi. Cuantificar la concentración de proteína de los homogeneizados obtenidos por Acid ensayo bicinconínico (BCA) ^12.
2. Desoxicolato de sodio (SDC) -assisted en solución de digestión tríptica ¹³ de homogeneizados de cerebro.
   a. Añadir una concentración final de ditiotreitol 10 mM (DTT) (usando la solución madre se indica en la solución 5 de la Tabla 3) para el homogeneizado obtenido para iniciar la reducción de los enlaces disulfuro de la proteína.
   segundo. Incubar el homogeneizado durante 30 min en un bañopre-fijado en 60 ° C.
   do. Añadir al homogenado una concentración final de yodoacetamida 20 mM (IAA), utilizando la solución madre se indica en la Solución 7 de la Tabla 4.
   re. Incubar el homogeneizado que contiene IAA a temperatura ambiente en la oscuridad durante 45 min.
   mi. Diluir el homogeneizado de cerebro-dos pliegues utilizando tampón de dilución (solución 6 de la Tabla 3).
   F. Incubar la muestra durante una segunda etapa de reducción durante 30 min a 37 ° C.
   gramo. Añadir tripsina modificada de calidad para secuenciación disolvió en una solución 2 de la Tabla 2 en proteína-enzima 1:50 (w / w).
   marido. Digerir el homogeneizado con tripsina por incubación durante la noche a 30 ° C.
   yo. Se detiene la digestión enzimática en el día siguiente mediante la adición de 0,5% de concentración final de ácido fórmico (FA). (Nota: La adición de FA causará la precipitación de las sales de SDC en condiciones ácidas.)
   j. vórtice suavemente las muestras que contienen SDC precipistados.
   k. Se precipitan hacia abajo las sales SDC mediante la centrifugación de las muestras a 12.000 xg, 4 ° C durante 10 min.
   l. Recoger el sobrenadante y transferir el líquido a un nuevo tubo limpio. (Nota: Tenga cuidado durante el pipeteo de este paso para no volver a suspender y / o sales de recoger a partir del sedimento SDC).
   metro. Re-disolver el pellet SDC en re-disolución tampón SDC (Tabla 5) bajo agitación vigorosa durante 1 min.
   norte. Repetir los pasos JL dos veces para recuperar péptidos precipitados y se combinan los sobrenadantes. (Nota:. Ver Serra et al 2016 ¹³ para más detalles sobre la SDC-asistido en solución protocolo de digestión tríptica adaptado aquí.)
3. La desalación de tríptica digerido muestras.
   a. Realizar desalinización de muestras digeridas usando un cartucho de 1 g C-18. (Nota: El uso de un cartucho de volumen grande (5 ml), independientemente de la cantidad de proteína obtenida garantías limpieza adecuada de sales restantes SDC en las muestras antesa la inyección de LC-MS / MS).
   segundo. Realizar acondicionado del cartucho C-18 de 1 g con 5 ml de acetonitrilo (ACN).
   do. Pase 5 ml de tampón de limpieza (Tabla 6) por el cartucho 1 g C-18 acondicionado para eliminar cualquier disolvente orgánico restante.
   re. Cargar la muestra en el cartucho de 1 g C-18.
   mi. Realizar 3 - 5 pasos de limpieza a la muestra en la columna de la 1g C-18 usando 5 ml de tampón de limpieza de cada paso.
   F. Eluir los péptidos desaladas de la 1g C-18 cartucho utilizando 5 ml de tampón de elución (Tabla 7).
   gramo. Secar los péptidos eluidos en un concentrador de vacío.
   do. Reconstituir la muestra seca en un volumen final de 200! L de tampón de elución. (Nota:. Uso vigorosa y largo (> 10 min) vórtex seguido por sonicación posterior en un baño de sonicación durante 30 min a completamente re-suspender los péptidos secos en tampón de inyección)
   re. Ajustar el volumen de inyección de la muestra para LERLIC-MS / MS a analisar entre 1 a 3 g de proteína.

3. Una dimensión LERLIC-MS / MS Separación

1. condiciones de cromatografía de líquidos:
   Las fases móviles:
   A: FA 0,1% en agua (Tabla 8).
   B: 0,1% FA en ACN (Tabla 9)
   Velocidad de flujo: 0,4 l / min
   Columna: columna capilar LAX (longitud 50 cm - 200 micras ID)
   a. Usar el siguiente 1200 min-gradiente: 95% de B durante 40 min, 95 - 85% B para 434 min, el 85 - El 70% B para 522 min, el 70 - El 35% B durante 124 min, de 35 - 3% B durante 45 min , isocrática a 3% de B durante 5 min, 3 - 95% de B durante 7 min y se mantuvo isocrática a 95% de B durante 23 min.
   segundo. Realizar la separación de péptidos usando el capilar LAX como se indica en Serra & Gallart-Palau et al. ³ utilizando cromatografía líquida de ultra-alta presión.
2. configuración Espectrómetro de masas:
   a. Configurar los detalles del evento exploración para realizar las betwe adquisición de datos alternaen completo transformada de Fourier-espectrometría de masas (FT-MS) y espectrometría de masas Fourier transform-tándem (FT-MS / MS) con los siguientes parámetros:
   a.1. modo de adquisición de datos: positivo
   a.2 parámetros FT-MS:
   Rango de masas: 350 - 2000 m / z
   Resolución: 60000
   Microscans: 1 por espectro
   Control automático de ganancia: 1 × 10 ⁶
   a.3 parámetros FT-MS / MS:
   modo de fragmentación: de alta energía de disociación de colisión (HCD)
   Rango de masas a.4: 150 - 2000 m / z
   A.5 Resolución: 30000
   a.6 Top N iones: 10
   Microscans: 1 por espectro
   Estado de carga:> 2+
   anchura de aislamiento: 2 Da
   a.7 control de ganancia automático: 1 × 10 ⁶
   segundo. Realizar la detección de espectrometría de masas de péptidos como se indica en ³ usando un espectrómetro de masas orbitrap equipado con una fuente de iones de nanoelectropulverización de trabajo en 1,5 kV.

Análisis 4. Datos

1. realizar una proten la búsqueda de base de datos a la LERLIC-MS / MS obtenido datos utilizando los siguientes parámetros utilizando un software específico proteómico: (Nota: Ver ³ para más detalles).
   a. tolerancia Ion: 10 ppm
   segundo. tolerancia ion Fragmento: 0,05 Da
   do. Tasa de Falso Descubrimiento (FDR): 1%
   re. Base de datos: la base de datos UniProt Humano
   mi. modificaciones fijos: Carbamydomethylation en Cys
   F. modificaciones variables (si lo requiere el software): Oxidación (Met), desamidación (Asn y Gln).
2. caracterización confidentes y cuantificación de los productos deamidadas isoméricas en datos LERLIC-MS / MS:
   a. Resultados de búsqueda de base de datos de exportación de LERLIC-MS / MS a un software para el análisis spreedsheet.
   segundo. Encontrar y extraer toda la lista de péptidos desamidada y sus contrapartes no desamidada.
   do. Usando la lista de los péptidos obtenidos como referencia, extraer los cromatogramas de iones (XICS) de estos péptidos usando un software apropiado en 5 ppm de la tolerancia de masas. (Nota:Ver ³ para más detalles sobre el software utilizado para la extracción de XICS).
   re. Inspeccionar visualmente los Xics obtenidos para identificar la elución de doble pico separado de los productos isómeros, como se indica ^3. (Nota: Los productos isoméricas de dichos péptidos identificados a nivel de MS / MS se pueden encontrar fácilmente guiado por la presencia de dos tiempos de retención diferentes en el resultado de búsqueda de base de datos).
   mi. La cuantificación relativa de los productos isómeros de cada sitio / péptido desamidada tiene que ser realizada en base al área del pico de cada isómero identificados en los Xics obtenidos.

Resultados

La desamidación de residuos Gln y Asn se considera una modificación de proteínas degenerativa (DPM) implicado en varias enfermedades crónicas y fatales ^14. Se ha demostrado que este PTM puede predecir la vida media y degradativas estados de anticuerpos y otras moléculas en el cuerpo humano y fondos biológicas similares ^{1, 15.} La importancia de la desamidación de proteínas, de hecho, va más allá d...

Discusión

En este video-artículo se presenta un protocolo paso a paso de LERLIC-MS / MS ^3, un método para llevar a cabo la caracterización en profundidad y para determinar con precisión la extensión de la desamidación de proteínas y los procesos enzimáticos que participan en esta modificación de la proteína. LERLIC-MS / MS se basa en el uso de una de longitud larga (50 cm) LAX bajo el principio de cromatografía electrostática de repulsión-hidrófilo interacción (ERLIC) ^27.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
PolyCAT 3 µm 100-Å (bulk material)	PolyLC Inc.	Special order
Long-length ion exchange capillary column 50 cm - 200 µm ID	PolyLC Inc.	Special order
PEEKsil Tubing 1/16" OD x 200 µm ID x 50 cm length	SGE Analytical Science under Trajan Scientific Australia	620050
Female-to-female fitting for 1/16" OD tubbing	Upchurch Scientific	UPCHF-125
Female nut for microferule	Upchurch Scientific	UPCHP-416
Microferule	Upchurch Scientific	UPCHF-132
Pressure Bomb NanoBaume	Western Fluids Engineering	SP-400
Shimadzu Prominence UFLC system	Shimadzu	Prominence UFLC
Bullet Blender	Next Advance	BBX24
Safe-lock tubes	Eppendorf	T9661-1000EA
Stainless steel beads. 0.9 – 2.0 mm. 1 lb. Non-sterile.	Next Advance	SSB14B
Table-top centrifuge	Hettich Zentrifugen	Rotina 380 R
Standard Digital Heated Circulating Bath, 120VAC	PolyScience 8006 6L	8006A11B
Sep-pack c18 desalting cartridge 50 mg	Waters	WAT020805
Vacumm concentrator	Eppendorf	Concentrator Plus System
Dionex UltiMate 3000 UHPLC	Dionex	UltiMate 3000 UHPLC
Orbitrap Elite mass spectrometer	Thermo Fisher Scientific Inc.	ORBITRAP ELITE
Michrom Thermo CaptiveSpray	Michrom-Bruker Inc.	TCSI-SS2
Incubator INCUCELL	MMM Group	INCUCELL111
Sequencing-grade modified trypsin	Promega	V5111
Protease inhibitor cocktail tablets	Roche	11836170001 (ROCHE)
Phosphate buffer solution 10x (diluted to 1x)	Sigma-Aldrich	P5493
Ammonium acetate	Sigma-Aldrich	A1542
Sodium deoxycholate	Sigma-Aldrich	D6750
Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	D0632
Iodoacetamide	Sigma-Aldrich	i6125
Formic acid	Sigma-Aldrich	F0507 (HONEYWELL)
Ammonium hydroxide	Sigma-Aldrich	338818 (HONEYWELL)
Acetonitrile HPLC grade	Sigma-Aldrich	675415
Isopropanol HPLC grade	Sigma-Aldrich	675431
Water HPLC grade	Sigma-Aldrich	14263