Fraccionamiento de Membranas Cerebrales: Un<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Enfoque para evaluar la localización de proteínas subsinápticas

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo de fraccionamiento de membrana cerebral que representa un procedimiento robusto para aislar proteínas pertenecientes a diferentes compartimentos sinápticos.

Resumen

La evaluación de la composición y función de las proteínas sinápticas constituye un desafío importante en la neurociencia. Sin embargo, no es fácil evaluar la neurotransmisión que ocurre dentro de las sinapsis porque está altamente regulada por interacciones proteína-proteína dinámicas y eventos de fosforilación. Por consiguiente, cuando se utiliza cualquier método para estudiar la transmisión sináptica, un objetivo principal es preservar estas modificaciones fisiológicas transitorias. Aquí, presentamos un protocolo de fraccionamiento de membrana cerebral que representa un procedimiento robusto para aislar proteínas pertenecientes a diferentes compartimentos sinápticos. En otras palabras, el protocolo describe una metodología bioquímica para llevar a cabo el enriquecimiento de proteínas de los compartimentos presinápticos, postsinápticos y extrasinápticos. En primer lugar, los sinaptosomas, o terminales sinápticas, se obtienen a partir de neuronas que contienen todos los compartimentos sinápticos por medio de un gradiente discontinuo de sacarosa. De la nota, la calidad de esta preparación inicial de la membrana sináptica es cRitical Posteriormente, el aislamiento de los diferentes compartimentos subsinápticos se logra con solubilización ligera usando detergentes suaves a condiciones de pH diferenciales. Esto permite la separación por gradiente y centrifugaciones isopicnicas. Por último, el enriquecimiento de proteínas en los diferentes compartimentos subsinápticos ( es decir, las fracciones de membrana pre, post y extrasináptica) se valida mediante el análisis de inmunotransferencia utilizando marcadores de proteínas sinápticas bien caracterizados (SNAP-25, PSD-95 y sinaptofisina, Respectivamente), lo que permite una evaluación directa de la distribución sináptica de cualquier proteína neuronal en particular.

Introducción

La transmisión sináptica se basa en la integridad física de la sinapsis, concepto que fue concebido ya en 1897 por Foster y Sherrington ¹ . Por lo tanto, la comprensión de la distribución de componentes clave de neurotransmisión ( por ejemplo, canales iónicos, receptores, etc. ) es esencial para elucidar la función sináptica, tanto en condiciones normales como patológicas. La microscopía electrónica (EM) ha contribuido enormemente a la noción ultraestructural actual de las sinapsis prototípicas del sistema nervioso central (SNC). De esta manera, EM ha establecido finamente las diferencias entre densidades pre y postsinápticas, que están separadas por una hendidura de una distancia bastante uniforme (~ 25 nm) ² . Curiosamente, el aparato postsináptico exhibe un espesamiento denso de electrones relativamente continuo por debajo de su membrana plasmática, la denominada densidad postsináptica, o PSD2. Por el contrario, en el aparato presináptico,La red cytomatrix discontinua se dispone justo debajo de la membrana plasmática, que es esencial para la alineación y acoplamiento de las vesículas sinápticas a la zona activa ^{3 de la} membrana plasmática. Por lo tanto, EM constituye el método experimental dorado para examinar la distribución de proteínas dentro de las sinapsis estructuralmente preservadas del SNC. Sin embargo, la información proporcionada por las micrografías electrónicas es estática. De hecho, las evidencias acumuladas muestran que las sinapsis in vivo son extremadamente dinámicas, experimentando cambios estructurales dramáticos tras la transmisión sináptica sostenida. Además, la morfología y composición de las sinapsis puede cambiar a lo largo de diferentes regiones del SNC y al desarrollo, maduración, envejecimiento y el desarrollo de condiciones neuropatológicas. En general, un protocolo centrado en el aislamiento de proteínas pertenecientes a diferentes compartimentos sinápticos en condiciones fisiológicas representa una herramienta valiosa para un estudio más completo del funcionamiento sináptico.

et al . (2001) ⁴ , se basa en un cambio de pH que debilita las interacciones adhesivas que ocurren dentro del aparato pre y postsináptico. En primer lugar, utilizando detergentes suaves a pH 6,0, es posible discernir la unión adherente que sostiene el aparato pre y postsináptico y que se mantiene desde el dominio de la membrana extrasináptica, que se solubiliza y por lo tanto se puede extraer de los contactos sinápticos. Posteriormente, elevar el pH de 6,0 a 8,0 en presencia de detergentes suaves debilita la resistencia de la unión de adherentes que mantiene la zona presináptica activa estrechamente unida a la densidad postsináptica. Por lo tanto, el compartimiento presináptico es tanLubilizado y se puede separar de la densidad postsináptica, que se conserva en su mayor parte porque la concentración de detergente utilizado no favorece su solubilización ⁴ . Curiosamente, la eficiencia de fraccionamiento, eventualmente superior al 90%, puede ser confirmada por diferentes marcadores subsinápticos: i ) la proteína 25 asociada sinaptosomal (SNAP-25), de la zona activa presináptica; Ii ) sinaptofisina, de la fracción extrasináptica ( es decir, fuera de la zona activa e incluyendo microsomas); Y iii ) proteína de densidad postsináptica 95 (PSD-95), a partir de la densidad postsináptica. En particular, este método de fraccionamiento de membrana cerebral se ha utilizado con éxito. En consecuencia, se ha podido determinar con precisión la localización subsináptica de diferentes receptores, tales como los receptores 5 de ácido alfa-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolpropiónico (AMPA), el receptor A1 de adenosina (A ₁ R) ⁶ ,Receptor A _{2A de} adenosina (A _2A R) ⁷ , receptores P2 de trifosfato de adenosina (ATP) ⁸ , subunidades nicotínicas de receptor de acetilcolina ⁹ y receptor GPR37 asociado con la enfermedad de Parkinson ¹⁰ . Sin embargo, una serie de limitaciones pueden impedir la evaluación adecuada de la distribución sináptica de una proteína neuronal particular. Por lo tanto, en este procedimiento, no sólo describimos completamente el protocolo completo, sino que también destacamos algunos puntos críticos a considerar, como la cantidad bastante grande de tejido necesario, el bajo rendimiento proteínico y el requisito obligatorio para validar la eficiencia de Cada separación antes de realizar el experimento definido.

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Protocolo

Todos los procedimientos experimentales con animales fueron aprobados por el Comité de Uso y Cuidado de Animales (CEEA) de la Universidad de Barcelona, ​​de acuerdo con las directrices descritas en la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio ¹¹ y siguiendo la ley 86/609 / CCE, FELASA y ARRIVE. Por lo tanto, los ratones se alojan en jaulas estándar, con acceso ad libitum a alimentos y agua, y se mantienen en condiciones estándar controladas (12 horas de ciclo oscuro / ligero a partir de las 7:30 AM, 22ºC y 66% de humedad).

1. Obtención de sinaptosomas cerebrales de ratón utilizando un gradiente discontinuo de sacarosa

Nota: Este método se informó previamente ¹⁰ .

1. Preparar un nuevo tampón de aislamiento (IB), pH 7,4; Sacarosa 2 M; Sacarosa 1 M / CaCl _ { ₂ } 0,1 mM; Y CaCl _ { ₂ } 0,1 mM (véase la Tabla 1 ). Enfriar las soluciones sobre hielo.
2. SaCrifice cinco ratones por dislocación cervical. Decapitar y eliminar rápidamente el cerebro de cada animal. Diseccionar la región cerebral de interés (es decir, el hipocampo, 0,25-0,35 g de tejido fresco) y colocarlo en un tubo de vidrio Potter-Elvehjem de 5 mL sobre hielo con 1 mL de IB.
3. Homogeneizar el tejido usando un agitador homogeneizante (10 golpes a 700-900 rotaciones por minuto), preferentemente en un baño de hielo para evitar el calentamiento de la muestra.
4. Colocar el tejido homogeneizado (1 ml) en un tubo de 15 ml que contiene 6 ml de sacarosa 2 M y 2,5 ml de CaCl2 0,1 mM a 4 ° C. Mezcle lentamente invirtiendo el tubo.
   Nota: La adición de calcio es esencial para mantener las interacciones adhesivas entre los organelos y así preservar la estructura de las diferentes "densidades".
5. Colocar la solución en un tubo de centrífuga de 12 ml y añadir lentamente 2,5 ml de sacarosa 1 M / CaCl2 0,1 mM en la parte superior de cada tubo para formar el gradiente de sacarosa.
   Nota: etiquetar la posición oF la interfaz de gradiente en el tubo de centrífuga utilizando un marcador permanente.
6. Pesar y equilibrar los tubos de centrífuga con solución IB dentro de sus soportes de acero correspondientes y con sus tapas de cierre.
7. Centrifugar los tubos durante 3 h a 100.000 x gy 4 ° C usando una centrífuga de rotor de cubo oscilante. Llenar completamente el rotor con todos los soportes de acero (incluso vacío, si es necesario).
8. Deseche la capa superior que contiene mielina. Con una pipeta Pasteur, recoja el anillo blanco entre la interfase de sacarosa 1,25-M y 1-M correspondiente a la fracción de sinaptosomas.
9. Diluir los sinaptosomas con 9X su volumen utilizando IB en un tubo de centrífuga.
10. Pesar y equilibrar los tubos de centrífuga con solución IB dentro de sus soportes de acero correspondientes y con sus tapas de cierre.
11. Centrifugar los tubos durante 30 min a 15.000 x g y 4 ° C utilizando una centrífuga de rotor de cuchara oscilante.
12. Desechar el sobrenadante y resuspenderE pellet con 1,1 ml de solución IB. Recoger 100 μL de esta solución sinaptosomal y centrifugar durante 5 min a 11.000 x g y 4 ºC.
13. Resuspender el sedimento sinaptosomal en dodecil sulfato sódico al 5% (SDS) y almacenar esta muestra a -20 ºC.
    Nota: Esta muestra corresponderá a la fracción sinaptosómica total para un análisis de Western blot posterior. La fracción sinaptosomal restante (~ 1 ml) puede ser congelada a -20 ºC hasta su uso o procesada para el posterior fraccionamiento subsináptico. Los sinaptosomas o sinapsis purificadas representan entre 1 y 2% del volumen total del hipocampo ¹² .

2. Pre-, Post- y Extrasynaptic-aislamiento

1. Preparar 2x tampón de solubilización fresco, pH 6,0; 1x tampón de solubilización, pH 6,0; Tampón de solubilización, pH 8,0; Y CaCl _ { ₂ } 0,1 mM (véase la Tabla 1 ). Enfriar las soluciones sobre hielo.
   Nota: El pH de estas soluciones debe ser accuratelY ajustado para lograr un buen fraccionamiento subsináptico.
2. Se diluye lentamente la fracción sinaptosomática resuspendida de 1 ml (véase el paso 1.12) con 5 ml de CaCl2 0,1 mM.
3. Añadir el mismo volumen (5 ml) de tampón de solubilización 2x ​​enfriado con hielo, pH 6,0, e incubar durante 50 min en hielo bajo alta agitación en un vaso de precipitados sobre hielo.
   Nota: Mientras que el 1% de Triton X-100 a pH 6.0 solubiliza todas las proteínas de la membrana plasmática, preserva las proteínas dentro de los contactos sinápticos o uniones ( es decir, estructuras pre y postsinápticas) ⁴ .
4. Coloque la solución en un tubo de centrifugación. Pesar y equilibrar los tubos con volúmenes equivalentes de CaCl2 0,1 mM y solución tampón de solubilización 2x, pH 6,0, dentro de sus correspondientes soportes de acero y con sus tapas de cierre.
5. Centrifugar los tubos durante 30 min a 40.000 x g y 4 ° C utilizando una centrífuga de rotor de cuchara oscilante. El sobrenadante resultante representa la fracción extrasináptica,Y el gránulo corresponde a las uniones sinápticas ( es decir, fracciones pre y postsinápticas).
6. Se concentra el sobrenadante que contiene la fracción extrasináptica hasta un volumen final de 200 μL utilizando un tubo de filtro de 15 ml de 10 K centrifugado a 4.000 xg y 4 ºC.
7. Se precipita la fracción extrasináptica concentrada resultante (200 μl) con 5 volúmenes (1 ml) de acetona pre-enfriada (-20 ° C) durante la noche a -20 ° C.
8. Al día siguiente, centrifugar la fracción extrasináptica durante 30 min a 18.000 x gy -15 ° C. Después de la centrifugación, desechar el sobrenadante de acetona y secar el gránulo para eliminar cualquier traza de acetona.
9. Finalmente, resuspenda el sedimento que contiene las proteínas extrasinápticas con 200 μl de SDS al 5%. Sonicate el pellet, si es necesario.
10. Sin interrumpirla, lavar cuidadosamente el gránulo que contiene las fracciones pre y postsinápticas con 2 mL de tampón de solubilización 1x, pH 6,0. Deseche el búfer.
11. ResuspenderEl gránulo con 10 ml de tampón de solubilización 1x, pH 8,0, usando una pipeta Pasteur de vidrio.
    Nota: Mientras que el 1% de Triton X-100 a pH 8.0 solubiliza la especialización presináptica, preserva la densidad postsináptica insoluble ⁴ .
12. Incubar la suspensión durante 50 minutos sobre hielo bajo alta agitación en un vaso de precipitados sobre hielo.
13. Coloque la solución en un tubo de centrifugación. Pesar y equilibrar los tubos con 1x solución tampón de solubilización, pH 8,0, dentro de sus correspondientes soportes de acero y con sus tapas de cierre.
14. Centrifugar los tubos durante 30 min a 40.000 x g y 4 ° C utilizando una centrífuga de rotor de cuchara oscilante; El sobrenadante resultante corresponde a la fracción presináptica y el precipitado a la fracción postsináptica.
15. Procesar el sobrenadante que contiene la fracción presináptica, como se describe en los pasos 2.6-2.9.
16. Resuspender el sedimento que contiene la fracción postsináptica con 200 μl de SDS al 5%. Sonicate el pellet, iF necesario.

3. Analizar las muestras por inmunoblot para validar el fraccionamiento de membrana

1. Determine la cantidad de proteína en cada fracción ( es decir, las fracciones total, extra, pre y post-sináptica) usando el ensayo de proteína de ácido bicinconínico.
2. Tomar 20 μg de proteína de cada fracción y diluirla hasta un volumen final de 50 μL en tampón de muestra de electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE). Hervir durante 5 min a 100 ºC.
3. Separar las proteínas mediante electroforesis SDS-PAGE al 10%, con un gel concentrador al 4% en condiciones reductoras. Electrofóresis a voltaje constante de 80 V hasta que el colorante entre en el gel inferior y luego aumente el voltaje a 120 V.
4. Transferir las proteínas a una membrana de PVDF y bloquear con solución de bloqueo IB durante 45 min a temperatura ambiente bajo agitación continua.
5. Incubar la membrana durante la noche a 4 ºC con el anticuerpo primario indicado ( es decir, anti-SNAP-25,Anti-PSD-95, anti-sinaptofisina, o anti-GPR37) diluida en solución de bloqueo IB bajo agitación continua.
6. Lavar la membrana tres veces (10 min cada una) con solución de lavado IB para eliminar el anticuerpo primario no unido.
7. Incubar con el anticuerpo secundario indicado durante 90 minutos en condiciones de oscuridad a temperatura ambiente bajo agitación continua.
8. Lavar la membrana tres veces (10 min cada una) con solución de lavado IB para eliminar el anticuerpo secundario no unido.
9. Incubar la membrana con sustrato quimioluminiscente (preparar la mezcla en condiciones oscuras y siguiendo la proporción 1: 1 de la solución A y B proporcionada por el fabricante).
10. Analizar la membrana en un dispositivo de detección quimioluminiscente.

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Resultados

La metodología descrita ha sido ampliamente utilizada para el análisis subsináptico de las proteínas neuronales en general y para el aislamiento y caracterización bioquímica de los receptores sinápticos ^{5 , 6 , 7 , 8 , 9} en particular. Curiosamente, el resultado representativo mostrado aquí demuestran la utilidad de es...

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Discusión

The protocol presented here constitutes a powerful biochemical tool for the study of the subsynaptic distribution of specific proteins within any brain region. However, there are some drawbacks inherent to the technique that deserve to be highlighted here. For instance, one of the main limitations is the relatively large amount of tissue needed to purify a reasonable amount of protein in order to perform the immunoblot analysis of all subsynaptic fractions. This issue might be related to the fact that synapses (i.e.,...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sucrose	Pancreac Química SL, Barcelona, Spain	1,316,211,211
CaCl2	Pancreac Química SL, Barcelona, Spain	2,112,211,210
MgCl2·6H2O	Pancreac Química SL, Barcelona, Spain	1,313,961,210
Protease inhibitor cocktail Set III	Millipore, Darmstadt, Germany	535140
Trizma Base	Sigma, St. Louis, MO, USA	T1503
Tris-HCl	Pancreac Química SL, Barcelona, Spain	1,236,541,209
Triton X-100	Sigma, St. Louis, MO, USA	X100
SDS	Sigma, St. Louis, MO, USA	L3771
Glycerol	Sigma, St. Louis, MO, USA	G5516
Bromophenol Blue	Pancreac Química SL, Barcelona, Spain	1,311,651,604
Dithiothreitol	Sigma, St. Louis, MO, USA	D0632
Tween 20	Sigma, St. Louis, MO, USA	P2287
Non fat dry milk
NaCl	Pancreac Química SL, Barcelona, Spain	1,216,591,211
KCl	Pancreac Química SL, Barcelona, Spain	1,314,941,210
KH2PO4	Merck	4873
Na2HPO4	Pancreac Química SL, Barcelona, Spain	1,316,781,211
Basic 20 pH	Crison, Alella, Spain
Polytron VDI 12 Adaptable Homogenizer	VWR, Radnor, PA, USA.
Ultra-Clear Tubes (14x89mm)	Beckman Coulter, Hospitalet de Llobregat, Barcelona	344059	Tubes should be filled almost completely when used to prevent collapsing due to ultracentrifugation.
Amicon Ultra-15 Centrifugal filters Ultracel -10K	Merck Millipore, Darmstadt, Germany	UFC901008
Centrifuge 5430R	Eppendorf, Hamburgo, Germany
Optima L-90K Ultracentrifuge	Beckman Coulter, Hospitalet de Llobregat, Barcelona
Sonifier 250	Branson, Danbury, Connecticut
Amersham Imager 600	GE Healthcare Europe GmbH, Barcelona, Spain
Disposable Glass Pasteur Pippetes 230 mm	VWR, Radnor, PA, USA	612-1702
Compact Balance EK-610	A&D, Tokyo, Japan
Pierce™ BCA Protein Assay Kit	Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA
SuperSignal west pico chemiluminescent substrate	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA
GR 200 Precision Balance	A&D, Tokyo, Japan
Anti-GPR37	Homemade antibody anti-GPR37 produced and validated in Francisco Ciruela Laboratory.		Primary antibodies used at a final concentration of 0.250 μg/mL
Anti-SNAP-25, anti-PSD-95, anti-synaptophysin	Abcam, Cambridge, United Kingdom		Primary antibodies diluted 1:10,000
HRP-conjugated goat anti-mouse IgG	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA.		Secondary antibody diluted 1:10,000
HRP-conjugated goat anti-rabbit IgG	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA.		Secondary antibody diluted 1:30,000