Expansión y Adipogénesis Inducción de Progenitores Adipocíticos de Tejido Adiposo Perivascular Aislado por Clasificación de Células Magnéticas Activadas

Resumen

Aquí se informa un método para el aislamiento de las poblaciones de células progenitoras de adipocitos (APC) de tejido adiposo perivascular (PVAT) utilizando clasificación de células activadas magnéticamente (MCS). Este método permite un mayor aislamiento de APC por gramo de tejido adiposo cuando se compara con la Clasificación de Células Activadas por Fluorescencia (FACS).

Resumen

La expansión del tejido adiposo perivascular (PVAT), un regulador principal de la función vascular a través de la señalización paracrina, está directamente relacionada con el desarrollo de la hipertensión durante la obesidad. El grado de hipertrofia e hiperplasia depende de la localización del depósito, el sexo y el tipo de fenotipos de la célula progenitora de los adipocitos (APC) presentes. Las técnicas utilizadas para el aislamiento de APC y preadipocitos en los últimos 10 años han mejorado drásticamente la precisión con la que se pueden identificar células individuales basadas en marcadores de superficie celular específicos. Sin embargo, el aislamiento de APC y adipocitos puede ser un desafío debido a la fragilidad de la célula, especialmente si la célula intacta debe ser retenida para aplicaciones de cultivo celular.

Clasificación de células activadas magnéticamente ( MCS) proporciona un método para aislar mayor número de APC viables por unidad de peso de tejido adiposo. APC cosechado por MCS se puede utilizar para protocolos in vitro para expandir preaDipocitos y los diferencian en adipocitos mediante el uso de cócteles de factores de crecimiento que permiten el análisis del potencial prolífico y adipogénico retenido por las células. Este experimento se centró en los depósitos aórticos y mesentéricos PVAT, que desempeñan un papel clave en el desarrollo de enfermedades cardiovasculares durante la expansión. Estos protocolos describen métodos para aislar, expandir y diferenciar una población definida de APC. Este protocolo MCS permite que el aislamiento se utilice en cualquier experimento donde la clasificación de células es necesaria con un mínimo de equipo o entrenamiento. Estas técnicas pueden ayudar a experimentos adicionales para determinar la funcionalidad de poblaciones celulares específicas basadas en la presencia de marcadores de superficie celular.

Introducción

El tejido adiposo perivascular (PVAT), debido a su proximidad a los vasos sanguíneos, es un componente principal de señalización parácrina en la función vascular ¹ . La expansión de este tejido adiposo depende del fenotipo de las células progenitoras de adipocitos (APC) presente ^{2 , 3} . El aislamiento de las células de los tejidos adiposos es difícil ya que los adipocitos primarios son frágiles, flotantes y de tamaño. Ciertas técnicas de aislamiento también pueden alterar el fenotipo celular y la morfología mediante el aumento de la síntesis de proteínas inflamatorias y la reducción de la expresión génica adipogénica ⁴ , haciendo hincapié en la importancia de un protocolo que mantiene la integridad de las células.

El cultivo de células primarias y subpoblaciones de preadipocitos específicos da un enfoque reduccionista al crecimiento in vivo y mantiene el equivalente genético celular ⁵ , aunque el trabajo tiMe con estas células se limita debido al deterioro con el envejecimiento, o la senescencia [ ^6] . Los preadipocitos de varios depósitos adiposos, incluyendo los depósitos subcutáneos y omentales, también demuestran diferencias en la proliferación ⁷ , lo que enfatiza la importancia de recoger células de sitios anatómicos específicos. Las células precursoras de depósitos adiposos blancos no PVAT se han caracterizado en estudios previos ^{7 , 8 , 9} , pero se conoce menos sobre los fenotipos APAT de PVAT.

Las técnicas descritas aquí permiten el análisis de poblaciones de APC específicas y definidas con un impacto mínimo en su morfología, viabilidad y potencial de proliferación y diferenciación. Clasificación de células activadas magnéticamente (MCS) es susceptible a aplicaciones de aguas abajo, tales como cultivo, ya que las perlas se disuelven sin alterar la célula. MCS también es económico, y una vez que el anticuerpo conCentraciones han sido estandarizadas, la necesidad de análisis de citometría de flujo es mínima. Los estudios in vitro con precursores de PVAT también pueden dar una idea del potencial que estas células primarias pueden tener.

Protocolo

Todos los procedimientos descritos en este documento siguen las directrices establecidas por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad Estatal de Michigan. Todos los amortiguadores y medias deben protegerse de la luz.

1. Preparación de amortiguadores, medios e instrumentos

1. Preparar solución de Krebs Ringer bicarbonato-tampón (KRBB): cloruro de sodio 135 mM, cloruro de potasio 5 mM, sulfato de magnesio 1 mM, fosfato de potasio dibásico 0,4 mM, glucosa 5,5 mM, antibiótico / antimicótico al 1% (10.000 unidades / ml de penicilina, 10.000 μg / Ml de estreptomicina, 25 mu g / ml de anfotericina B) y HEPES 10 mM (pH = 7,4). Esta solución es estable durante 3 semanas cuando se mantiene estéril ya 4 ° C.
2. Preparar la solución de colagenasa tipo 1: 1 mg / ml en KRBB con 4% de albúmina de suero bovino (BSA). Esta solución debe mantenerse a 37 ° C y es estable durante 4 h.
3. Preparar solución tampón de lisis de eritrocitos Solución: cloruro de amonio 154 mM, bicarbonato de potasio 10 mM, Y EDTA 0,1 mM. Mantener a 4 ° C hasta un mes.
4. Preparar el tampón de bloqueo MCS: base de medio DMEM / F12, suero bovino fetal al 10% (FBS), suero de burro normal al 5%, 40 μL / mL F (ab) Fragmento Burro IgG anti-rata. Mantener a 4 ° C hasta un mes.
5. Preparar solución tampón MCS: solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH = 7,5), BSA al 0,5% y EDTA 2 mM. Mantener a 4 ° C hasta un mes. Disolver la solución de gas calentando a 37 ° C en un recipiente de vidrio y luego aplicar un vacío durante 15 s. Dejar sellado sellado sin usar.
6. Preparación de los medios basales de la fracción vascular estromal (SVF): Medio de Eagles modificado por Dulbecco (DMEM): F12, 15% de suero de ternera fetal (FCS), 1% de antibiótico / antimicótico (10.000 unidades / mL de penicilina, 10.000 μg / mL de estreptomicina, 25 μg / Ml de anfotericina B), bicarbonato de sodio 44,05 mM, ácido ascórbico 100 mu M, biotina 33 mu M, pantotenato 17 mu M, L - glutamina 2 mM y HEPES 20 mM. Manténgase estéril ya 4 ° C durante un máximo de 2 semanas.
7. Preparar APC &(10 ng / ml), factor de crecimiento derivado de plaquetas BB (10 ng / ml) y factor básico de crecimiento de fibroblastos (factor de crecimiento epidérmico 10 ng / ml) 5 ng / ml). Manténgase estéril ya 4 ° C durante un máximo de 2 semanas.
8. Preparar los medios de inducción de APC: Medios APC con 10% de FBS, 2,5 μg / ml de insulina, 2 mM-isobutil-1-metilaxantina 0,5 mM (IBMX), 1 μM de dexametasona y 200 μM de T3 (triyodotironina hormona tiroidea). Manténgase estéril ya 4 ° C durante un máximo de 2 semanas.

2. Aislamiento de los progenitores de los adipocitos

1. Anestesiar la rata según las pautas institucionales. Coloque la rata en decúbito dorsal. Confirme la profundidad de la anestesia a través de un pinchazo y la pérdida de la respuesta refleja a este estímulo doloroso.
   NOTA: Este protocolo utiliza ratas Sprague Dawley de 10 semanas de edad y 70 mg / kg de pentobarbital administrado mediante una inyección intraperitoneal.
2. Hacer una incisión vertical mediana wCon las tijeras a lo largo del esternón en la zona torácica y al área perineal. Acceder a la cavidad abdominal y exponer la arteria mesentérica superior, los pequeños vasos mesentéricos de resistencia (mPVAT) y la aorta torácica (aPVAT).
   1. Separar todas las conexiones con el mesenterio y la aorta y retirar los vasos de los animales. Aislar PVAT utilizando un microscopio de disección y placa de Petri llena de KRBB para ver los vasos y aislar PVAT.
   2. En este experimento, recoger gonadales (GON) adiposo para representar un depósito adiposo no-PVAT. Colocar almohadillas de grasa aisladas en hielo en KRBB con HEPES 10 mM (pH = 7,4).
   3. En una campana de bioseguridad, transfiera alrededor de 50 mg de tejido a un tubo de 1,7 ml con 1 ml de solución de colagenasa tipo I y picar con tijeras de tejido (trozos de 1 a 3 mm).
3. Digerir las muestras incubando a 37 ° C en una incubadora de asador (o incubadora con un agitador orbital) durante 1 h. En una campana de bioseguridad, filtrar secuencialmente el material digerido a través de 100 y 40 Μm en un tubo de 50 ml. Centrifugar el filtrado resultante a 4 ° C durante 10 min a 300 × g.
   NOTA: Todos los pasos en el protocolo desde aquí hacia adelante deben realizarse en una campana de bioseguridad para mantener las células estériles.
4. Se vierte el sobrenadante y se resuspenden los sedimentos que contienen las células SVF en 1 ml de solución tampón de lisis de eritrocitos 1X y se transfieren a un tubo de microcentrífuga de 1,7 ml. Incubar las células durante 5 min a RT protegidas de la luz y centrifugar a 4 ° C durante 5 min a 300 x g.
5. Se vierte el sobrenadante y se resuspende el sedimento celular restante en SVF Basal Media. Recoger una sub-muestra de 20 μL para contar las células vivas con Trypan Blue Solution.
   NOTA: El número de células SVF que se pueden aislar variará según el sitio. El número medio de SVF cosechado por mg de tejido es: aPVAT = 5,0 ± 2,0x103, mPVAT = 1,04 ± 0,62x104, GON = 2,4 ± 1,2x105.

3. Clasificación de células activadas magnéticamente

_content "> NOTA: Aislar APC de SVF basado en marcadores de superficie celular CD34 y PDGFRα realizando todos los pasos a 4 ° C.

1. Girar las células durante 5 min a 300 x g. Se vierte el sobrenadante y se resuspende el sedimento celular en tampón de bloqueo MCS a 1 x ¹⁰⁶ células / ml e incuba durante 20 minutos.
   NOTA: Las suspensiones celulares de 1 x 10 ⁶ - 2 x 10 ⁸ células / ml pueden separarse eficazmente.
2. Incubar las células con 5 μL de ratón anti-CD34 conjugado con FITC (1 μg / 1 x 10 ⁶ células) durante 30 minutos a 4 ° C. Girar las células durante 5 min a 300 xg y 4 ° C.
   1. Incubar con 4 μl de microbolas anti-FITC y 96 μL de tampón MCS (volumen total de 100 μl) durante 5 minutos a 4 ° C en la oscuridad para separar las células CD34 ⁺ y CD34.
3. Coloque el separador magnético en el soporte y coloque la columna MultiSort (MS), con las alas de la columna en la parte delantera, en el separador. Coloque un 5 mLDebajo de la columna MS en el soporte superior del tubo.
4. Prepare la columna de MS enjuagando con solución de tampón MCS. Aplicar 500 μl de tampón MCS en la parte superior de la columna y dejar que pase el buffer. Deseche el efluente y cambie el tubo de recogida.
5. Cargar la suspensión de células marcadas con anticuerpos en la columna MS preparada. Recoja el flujo que contiene las células no etiquetadas.
6. Lavar la columna MS con 500 μl de tampón de MCS desgasificado 3x. Recoja las células no marcadas que pasan a través y se combinan con el flujo a través del paso anterior.
7. Retire la columna MS del separador magnético y colóquela en un nuevo tubo de recogida. Pipetee 1 mL de tampón MCS en la columna MS. Inmediatamente vaciar la fracción con las células marcadas magnéticamente firmemente, pero lentamente, aplicando el émbolo suministrado con la columna para no permitir el exceso de gas en la columna.
   NOTA: El número de células aisladas variará según el sitio. El número medio de células CD34 ⁺ APC aisladas de la población SVF porMg de tejido son: aPVAT = 2,6 pm 0,43x10 ^ { ^2} , mPVAT = 9,6 pm 1,4x10 ^ { ^2} , GON = 1,3 pm 0,22x10 ^ { ^3} .
8. Girar las células durante 5 min a 300 × gy 4 ° C. Incubar la fracción CD34 ⁺ recogida en 10 μl de una solución 1: 200/1 x 10 ⁶ células de conejo anti-PDGFRα durante 30 minutos a 4 ° C.
   1. Centrifugar las células de nuevo durante 5 min a 300 xg y 4 ° C. Incubar células marcadas con 4 μ l de anti-conejo IgG microbolas y 96 μ l de tampón MCS, repitiendo los pasos 3.3 a 3.7 para aislar.
      NOTA: El número de células aisladas variará según el sitio. El número promedio de PDGFRα ⁺ APC aislado de la población de CD34 ⁺ por mg de tejido es: aPVAT = 2,4 ± 0,64, mPVAT = 8,4 ± 2,4, GON = 10,4 ± 1,9, que es 0,5 - 10% de la población previamente aislada.

4. Cultivo celular y inducción de la adipogénesis

1. Cultura la SVFY APC en placas de cultivo de tejidos de 6 pocillos en medios basales con reemplazo cada 2 días. Después de 3 pasos en serie, se plaquean en placas de cultivo de tejidos negros de 96 pocillos a 1x10 ^ { ^2} células / pocillo para ensayos de proliferación, que se evalúan a las 8, 24, 48 y 96 h ya 50.000 células / pocillo en placas de 24 pocillos o 10.000 células / pocillo en placas de cultivo de tejidos de 48 pocillos para ensayos de adipogénesis, que son cualitativos y cuantitativos.
2. Suplemento de los medios basales APC durante 48 horas post-confluencia y antes de la inducción con la proteína 4 morfogénica del hueso (3,3 nmol / L) como se indica ¹⁰ para la diferenciación. Inducir las células después de 48 h de 100% de confluencia (día 0) utilizando los medios de inducción de APC para incubar las células.
3. Después de 48 h, cambiar el medio para mantener las células en medios de inducción de APC sin IBMX y dexametasona, durante 14 días con cambios en los medios cada 48 h.
4. Aislamiento MCS validado por FACS.
   1. Tomar una sub-muestra de 50 μl (50.000 células) de separación magnéticaY lavar con solución de FACS.
   2. Centrifugar las células y resuspender en 100 μ l de una solución 1: 1.000 de burro anti-conejo IgG Dylight 405 para etiquetar el PDGFRα ⁺ células. Incubar durante 30 minutos protegido de la luz ya 4 ° C.
   3. Lavar las células y resuspender en 200 μl de solución de formaldehído al 2% hasta el momento del análisis utilizando filtros de 488 nm (FITC) y 405 nm (Dylight 405) en un citómetro de flujo.
      NOTA: La acumulación de lípidos por células cultivadas se evalúa cuantitativamente usando un ensayo de fluorescencia de adipogénesis lipófila en un lector de microplacas que mide la fluorescencia y usando preadipocitos como calibradores para la acumulación de lípidos. La acumulación de lípidos también se mide cualitativamente mediante la tinción de colorantes de lípidos y la formación de imágenes realizadas en un microscopio invertido equipado con una cámara, haciendo que el porcentaje de células totales que contienen o no contienen lípidos observables. Cualquier lector de placas que sea capaz de medir la fluorescencia con excitación a 485 nm y emisión a 572Nm es adecuado para el análisis, así como cualquier microscopio con una cámara capaz de capturar imágenes digitales.

Resultados

La capacidad proliferativa de los preadipocitos y el potencial adipogénico de los precursores de adipocitos son características que se mantienen in vitro ¹¹ . Se evaluó la proliferación in vitro de SVF y APC aisladas a partir de aPVAT, mPVAT y GON de ratas macho a las 8, 24, 48 y 96 h después de la galjanoplastia usando un ensayo de ADN cuantitativo. No se observaron diferencias de sitio en la tasa de expansión de SVF en ningún momento, ex...

Discusión

El foco central del presente experimento es el aislamiento, la expansión y la inducción adipogénica de APC a partir de depósitos de PVAT. Aquí presentamos un protocolo para el aislamiento de APC basado en la identificación de células que expresan los marcadores de superficie CD34 y PDGFRα. Estas proteínas de superficie se identificaron previamente en APC con altas tasas de proliferación y el potencial para diferenciarse en adipocitos blancos o marrones en varios depósitos adiposos ¹⁴ <...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tissue Dissection
Dissecting Dishes	Handmade with Silicone
Culture Petri Dish	Pyrex		7740 Glass
Silicone Elastomer	Dow Corning	Sylgard 170	Kit
Braided Silk Suture	Harvard Apparatus	51-7615	SP104
Stereomicroscope MZ6	Leica		10447254
Stereomaster Microscope Fiber-Optic Light Source	Fisher Scientific	12562-36
Vannas Scissors	George Tiemann & Co	160-150
Splinter Forceps	George Tiemann & Co	160-55
Tissue Scissors	George Tiemann & Co	105-400
KRBB Solution
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	7647-14-5
Potassium Chloride	Sigma-Aldrich	7447-40-7
Magnesium Sulfate	Sigma-Aldrich	7487-88-9
Potassium Phosphate Dibasic	Sigma-Aldrich	7758-114
Glucose	Sigma-Aldrich	50-99-7
Antibiotic/Antimicotic	Corning	30-004-CI
HEPES	Corning	25-060-CI
Tissue Digestion
Collagenase Type 1	Worthington Biochemical	LS004196
Bovine Serum Albumin (BSA)	Fisher Scientific	9048-46-8
Red Blood Cell Lysis Buffer	BioLegend	420301	1X Working Solution
Water Bath	Thermo-Fisher Scientific	2876	Reciprocal Shaking Bath
Biosafety Cabinet	Thermo-Fisher Scientific	1385
Rotisserie Incubator	Daigger	EF4894C
100 µm Cell Strainer	Thermo-Fisher Scientific	22-363-549	Yellow
40 µm Cell Strainer	Thermo-Fisher Scientific	22-363-547	Blue
Hemocytometer	Cole-Parmer	UX-79001-00
Trypan Blue	Sigma-Aldrich	93595
Cell Isolation
OctoMACS Kit	Miltenyi Biotech	130-042-108
(DMEM):F12 Medium	Corning	90-090	Medium Base
Fetal Bovine Serum (FBS)	Corning	35016CV	USA Origins
Normal Donkey Serum	AbCam	AB7475
Anti-CD34	Santa Cruz	SC-7324	FITC-conjugated
Anti-PDGFRα	Thermo-Fisher Scientific	PA5-17623
Donkey Anti-Rabbit IgG	Jackson ImmunoResearch	712-007-003
Phosphate-Buffered Saline (PBS) 10X	Corning	46-013-CM	1X Working Solution
EDTA	Fisher Scientific	15575020
Cell Culture
CO2 Cell Incubator	Thermo-Fisher Scientific	51030285	Heracell 160i
6-Well Plates	Corning	3516	TC-Treated
48-Well Plates	Corning	3548	TC-Treated
96-Well Plates, Black Wall	Corning	353376	TC-Treated
Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich	144-55-8	TC-Treated
Fetal Calf Serum (FCS)	Corning	35011CV	USA Origins
Ascorbic Acid	Sigma-Aldrich	50-81-7
Biotin	Sigma-Aldrich	58-85-5
Pantothenate	Sigma-Aldrich	137-08-6
L-Glutamine	Corning	61-030
Bone Morphogenic Protein 4 (BMP4)	Prospec Bio	CYT-081
Epidermal Growth Factor (EGF)	PeproTech	400-25
Leukemia Inhibitory Factor	PeproTech	250-02
Platelet-derived Growth Factor BB	Prospec Bio	CYT-740
Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)	PeproTech	450-33
Insulin	Corning	25-800-CR	ITS Solution
IBMX	Sigma-Aldrich	28822-58-4
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	50-02-2
T3 (Triiodothyronine)	Sigma-Aldrich	6893-023
Cell Analysis
CyQUANT Proliferation Assay	Thermo-Fisher Scientific	C7026
AdipoRed Fluorescence Assay Reagent	Lonza	PT-7009
Oil Red O Lipid Dye Reagent	Sigma-Aldrich	O1391	In Solution
M1000 Microplate Reader	Tecan
Eclipse Inverted Microscope	Nikon
Digital Sight DS-Qil Camera	Nikon