Dispositivo de proyección de imagen de vivo a largo plazo para mejor manipulación Experimental de larvas de pez cebra

Resumen

Este manuscrito describe la zWEDGI (pez cebra herir y el dispositivo de captura para el crecimiento y la proyección de imagen), que es un dispositivo compartimentado diseñado para orientar y restringir las larvas de pez cebra. El diseño permite el corte transversal de la cola y a largo plazo colección de imágenes de alta resolución microscopia fluorescente de la cicatrización de heridas y regeneración.

Resumen

Las larvas de pez cebra son un organismo modelo importante para la biología del desarrollo y la cicatrización de heridas. Además, la larva de pez cebra es un sistema valioso vivo alta resolución imagen microscópica de fenómenos biológicos dinámicos en el espacio y tiempo con resolución de celular. Sin embargo, el tradicional método de encapsulación de agarosa para la proyección de imagen vivo puede impedir desarrollo larval y crecimiento del tejido. Por lo tanto, este manuscrito describe la zWEDGI (pez cebra herir y el dispositivo de captura para el crecimiento y la proyección de imagen), que fue diseñado y fabricado como un dispositivo funcionalmente compartimentado para orientar las larvas para microscopía de alta resolución permitiendo corte transversal de la aleta caudal dentro del dispositivo y desarrollo posterior cola libre y nuevo crecimiento. Este dispositivo permite herir y la proyección de imagen a largo plazo manteniendo la viabilidad. Dado que el molde de zWEDGI es impreso en 3D, la personalización de sus geometrías hacen fácilmente modificadas para aplicaciones diversas de pez cebra. Además, el zWEDGI ofrece que numerosas ventajas, como el acceso a la larva durante la experimentación para herir o para la aplicación de reactivos, paralelo orientación de múltiples larvas para la proyección de imagen optimizada y reutilización del dispositivo.

Introducción

La capacidad regenerativa de las larvas de pez cebra Danio rerio hacen un organismo modelo ideal para examinar la herida así como sanación y regeneración^1,2,3,4. Acceso a un conjunto de líneas de pez cebra transgénico y transparencia anatómica de pez cebra más mejorar su utilidad para los estudios en vivo de eventos de respuesta herida, así como a más largo plazo de procesos regenerativos⁴. Estudio de estos procesos biológicos usando microscopía de fluorescencia Time-lapse alta resolución por lo tanto exige un dispositivo de pez cebra imagen vivo que permite gran estabilidad y un mínimo movimiento de la larva de pez cebra manteniendo la viabilidad. Es clave que el dispositivo permite herir eficaz mientras cura y regeneración ocurrir inafectado por el dispositivo.

El método de estabilización imagen vivo estándar de incrustar la larva en agarosa durante proyección de imagen vivo restringe el crecimiento y regeneración⁵ la herida y puede aumentar las tasas de mortalidad ya que las larvas comienzan a mostrar signos de necrosis cardiaca de estrés y el tejido después de cuatro horas⁴. Por lo tanto, retiro de agarosa de regiones de interés es a menudo necesario para permitir el desarrollo normal y regeneración⁶, exponer las larvas a posibles daños como la agarosa es corta. Además, con la agarosa incorporación técnica, el usuario debe orientar las larvas en el corto tiempo antes de que la agarosa solidifica^5,6,7. Rápidamente no sólo manipular la larva requiere habilidad del usuario, también corre el riesgo de daño a la larva. Aunque se han descrito métodos para estabilizar la larva viva imagen para sortear estos inconvenientes, tales como agar rugoso pozos³ o divets⁸, el uso de vacío de silicona grasa para crear una cámara de proyección de imagen con tubería de PVC u otros materiales⁶tubo rotatorio⁹, muchos de estos métodos son de mano de obra intensiva, desordenada, a menudo no reutilizables y no permitir manipulación ambiental (tratamientos, hiriendo la droga etcetera.) después de que el pescado se ha montado.

Por lo tanto, el dispositivo de zWEDGI (figura 1) fue diseñado para superar algunos de los inconvenientes del agar de montaje para a largo plazo en la proyección de imagen de larvas de pez cebra permitiendo la manipulación de la muestra. La zWEDGI consiste en tres cámaras compartimentadas semi abiertos (figura 1A) para permitir la carga, sujeción, hiriendo y proyección de imagen de las larvas de pez cebra de fertilización después de 2 a 4 días. El dispositivo está fabricado de polidimetilsiloxano (PDMS) y coloca sobre el cubreobjetos de un plato de 60 mm cristal inferior. El diseño presentado aquí fue pensado para estudios de curación de herida, sin embargo el uso de un diseño modular y tecnologías de fabricación estándar hacer el diseño de zWEDGI modificable y susceptible a una variedad de procedimientos experimentales, especialmente para los procedimientos que requieren moderación mínima manipulación experimental y la proyección de imagen a largo plazo.

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Protocolo

Nota: el diseño de la base zWEDGI se formuló para larvas de peces cebra que son fertilización después de 2 a 4 días (PD) y seguir las instrucciones del centro de recursos de animales de investigación de la Universidad de Wisconsin-Madison.

1. diseño e impresión 3D de moldes

1. modelo el PDMS componente del dispositivo deseadas geometrías y atributos en un 3D modeling software ⁵. Crear un montaje de un molde en blanco y la parte PDMS y generar un molde negativo de la parte PDMS creando una cavidad en el molde correspondiente a la parte PDSM. Guardar el molde como un fichero .stl para impresión 3D (paso 1.1, figura 2).
   Nota: Un archivo de formato (.stl) de estereolitografía del diseño de molde aquí presentado ( figura 1) está disponible para su descarga en https://morgridge.org/designs/.
Moldes de
2. imprimir mediante una impresora 3D de fotopolímero ( figura 2, paso 1.2). Hacer moldes múltiples en una sola impresión, si es posible, así que más de un dispositivo puede ser moldeado con un único lote de PDMS.
   Nota: El ejemplo mostrado fue impreso en modo de alta resolución con un 0,075 mm viga diámetro y 0.05 mm grueso de la capa, usando el polímetro resina ⁵.
   1. Moldes limpio usando un pincel fino, alcohol desnaturalizado en una botella de spray y aire comprimido para fregar suavemente y quitar la resina sin polimerizar. Retire cualquier material de las regiones de microchannel.
   2. Después de la curación los moldes en un aparato de curación post UV de 60 minutos de cada lado como renunciar es tóxico para las larvas de pez cebra ¹⁰.
3. De la arena al lado de la cavidad del molde con papel de lija de grano 200 sobre una superficie plana hasta que todas las superficies de sellado están en contacto con el papel de lija (cargar geometrías de canal y el perímetro del molde). Lije ligeramente con papel de arena de grano de 400 y 600, progresivamente, para producir superficies lisas al ras a través de todas las vistas de geometría ( figura 2, paso 1.3). Medir la profundidad de la cavidad después de lijar con un indicador de dial para verificar que está cerca de la profundidad diseñada.
   1. Limpiar moldes y discos (1 ¾ pulgadas de diámetro x 1/4 pulgada vidrio de borosilicato grueso o acrílico; una copa cubierta por moho) colocando en un ultrasonido limpiador lleno con agua durante 30 minutos o lavándolas bajo el chorro de agua.
   2. Secarlo con aire comprimido y limpiar tanto los moldes, cubre con alcohol isopropilico y aire comprimido filtrado. Utilice un banco limpio como un lugar para la fabricación de los dispositivos para minimizar la contaminación del aire desechos. Deje los moldes limpios y vidrio cubre el Banco limpio o un plato de petri cubierto hasta que sea necesario.

2. Fabricación de PDMS de zWEDGI dispositivo de

1. hace el PDMS por 184 vertiendo silicona elastómero polydimethylsiloxane (PDMS) en una proporción de 5:1 (base activador) en un vaso de plástico. Mezclar bien durante 2 min con un palo de madera del arte, revuelve el gel sobre sí mismo, como amasar pan. Para 5 moldes, utilizar 10 g de base y 2 g de activador.
   1. Gas de la mezcla en un desecador de vacío de 25-45 min hasta que todas las burbujas hayan desaparecido.
   2. Llenan la cavidad de cada uno de los moldes impresos 3D de aproximadamente 0,75 mL de PDMS utilizando una jeringa de 10mL hasta que el molde se desborda ligeramente con un menisco ( figura 2, punto 2.1).
   3. Gas de los moldes llenados por 45 min eliminar burbujas adicionales que pueden haberse formado cuando.
2. Aplicar un disco de cubierta de vidrio en la parte superior del molde lleno de PDMS, presionando el disco a un ángulo para evitar que las burbujas atrapadas ( figura 2, paso 2.2). Permite exceso PDMS ser expulsados como se aplica la cubierta del disco de cristal.
Pinza de carraca pequeña de
3. uso sostener firmemente el disco de tapa para el molde.
   Nota: Esto crea una superficie plana una vez que el PDMS se cura y se produce a través de agujeros donde las geometrías 3D impresas queden al ras con el resbalón de la cubierta de vidrio. Alternativamente, para aumentar el número de dispositivos que pueden ser curadas al mismo tiempo, construir un dispositivo de abrazadera múltiple (por ejemplo. figura 2, paso 2.3).
4. Curar el dispositivo PDMS en los moldes sujeta a 100 ^o C en un horno durante 90 minutos ( figura 2, paso 2.4). Retire los moldes del horno y deje para enfriar hasta que pueda ser fácilmente manejados. Si el dispositivo de sujeción es de metal, retire el conjunto de disco de molde y cubierta de la abrazadera para evitar que el metal sigan PDMS debido al calor residual de la curación.
   Nota: El dispositivo es más fácil de desmoldar mientras que aún un poco caliente y no completamente curado. Sin embargo, una vez se retira el molde del horno y se retira el disco de la tapa, el dispositivo puede reposar un par de días antes de proceder a desmoldear. Si el dispositivo es demolded poco después de sacar del horno de curado, colóquela en una placa Petri cubierta para reducir contaminantes mientras hace lo que le permite curar completamente.

3. ZWEDGI plasma pegado a un plato de vidrio

1. abrazadera el molde que contiene el dispositivo PDMS en una prensa de banco para que el molde ' geometrías s enfrentan, paralelo a la banca de la estación de trabajo.
   1. Inicio para quitar el dispositivo PDMS desenganchando la lengüeta de extracción PDMS del molde con unas pinzas de punta plana. Trabajo todo el perímetro del molde con las pinzas (como eliminación de una torta de un pan ( figura 2, paso 3.1)).
   2. Uso filtrado de aire comprimido y pinzas para tirar suavemente el dispositivo fuera del molde sujetando la lengüeta y soplando aire en el dispositivo. Trabajar lentamente, permitiendo que el aire para ayudar a independiente el PDMS del molde, teniendo mucho cuidado con las puntas de las pinzas en las secciones de túnel finas.
2. Coloque el PDMS dispositivo boca abajo en el interior de la cubierta de un plato de fondo de cristal para las cuñas restricción del túnel son tocar el plástico (paso 3.2, figura 2).
3. Coloque la cubierta de plato con zWEDGI boca abajo y el correspondiente plato de fondo de cristal en un plasma limpiador con el vidrio interno hacia arriba ( figura 2, paso 3.3).
   1. Evacuar el plasma limpieza de cámara hasta que la presión alcanza 500 mTorr.
   2. Conjunto potencia de radio frecuencia (RF) a alta. Dejar expuesto el aparato y el plato a la frecuencia de RF de aproximadamente 2 minutos de presurizar la cámara lentamente y devolver el aparato y el plato a una campana limpio.
4. Retire el dispositivo PDMS de plato cubierta. El zWEDGI PDMS para la orientación correcta sobre el vidrio se voltea colocándola con cuidado en el centro del plato de fondo de vidrio ( figura 2, paso 3.4)
   1. con el extremo posterior de la pinza, pulse suavemente la PDMS dispositivo para asegurar las burbujas de aire quedan atrapados no debajo. Aplique presión alrededor del minuto geometrías de los canales de micro y suavizar el PDMS en los bordes ( figura 5).
      Nota: Contacto total entre el vidrio y el PDMS asegura mejor adherencia de la vinculación de plasma. El dispositivo zWEDGI puede ser plasma consolidado en otros formatos de plato con fondo de vidrio, como un cristal con fondo de pozo de 6 plate ( figura 2).
   2. Coloque una cubierta sobre el plato del dispositivo antes de retirar de la campana limpio.
      Nota: Una vez que los dispositivos fijados al vidrio, el protocolo puede pausarse hasta que están listos para uso.

4. Preparación y carga de larvas del canal

Nota: cría de pez cebra General se llevó a cabo por el libro de pez cebra, disponible en línea en http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html. Embriones y pez cebra adulto se mantuvieron como se describió anteriormente ¹. Se utilizó la cepa de tipo salvaje AB. Seguir la institución ’ s protocolo de cuidado Animal para obtener información específica sobre los requisitos para las larvas energizadas la proyección de imagen.

1. Enjuagar los canales con un mínimo de etanol al 70% 100 μl por canal, utilizando una micropipeta para aclarar a través de la restricción del túnel. Eliminar el etanol y enjuague 2 ó 3 veces con agua bidestilada. Deje secar al aire.
2. Llene los canales con leche descremada (en una concentración de 1% diluido en agua) por 10 min a temperatura ambiente para minimizar la adherencia de las larvas al cubreobjetos de cristal del plato. Luego, sumerja suavemente el dispositivo varias veces en agua bidestilada para enjuagar. Deje secar al aire boca abajo.
   Nota: Protocolo puede hacer una pausa aquí. Esta preparación de dispositivo zWEDGI se puede hacer varios días antes de usar. Almacén cubierto a temperatura ambiente.
3. Preparar bajo el 1% de punto fusión (LMP) agarosa combinando 100 μl 2% fundido LMP agarosa con 100 μl 2 x Tricaine (Tricaine - etil 3-aminobenzoato de 0,4 mg/mL) en tampón de E3 ¹¹ pre-calentado a 38 ^o C. mantener el 1% solución a 38 ^o C en un bloque caliente para evitar la gelificación de agarosa/tricaine.
   Nota: Para microscopía multifotón ¹¹, utilice cualquiera de los dos variantes no pigmentadas de pez cebra (como casper ¹²) o mantener las larvas en el E3 que contiene 0,2 mM N-phenylthiourea para evitar la formación de pigmento ¹¹ para minimizar la absorción de las longitudes de onda infrarrojo cercanos por el pigmento.
   PRECAUCIÓN: N-phenylthiourea es tóxico. Seguir la institución ' reglas de s para la eliminación de.
Las larvas de
4. Anesthetize en E3 tampón que contiene 0,2 mg/mL Metanosulfonato (Metanosulfonato/E3) ¹¹. Espere hasta que las larvas son inmóviles y no responde a un estímulo táctil.
5. Mojar previamente los canales con unos pocos microlitros de Metanosulfonato/E3.
   1. Pick up una sola larva utilizando una pipeta de amplio orificio. Depositar las larvas en el canal de carga ( Figura 3A). Utilizando una pipeta o una herramienta similar, orientar la larva en la cámara de carga tal que el lado dorsal enfrenta el borde recto de la cámara de carga y las caras de cola hacia el túnel de restricción ( figura 3B).
   2. Cuidadosamente retirar el líquido de la cámara herida, permitiendo que la larva en el túnel de restricción ( figura 3). Eliminar la mayor parte del líquido manteniendo humedad alrededor de la larva ( figura 3D). Este proceso puede ser asistido por inclinar el plato ligeramente hacia la cámara hirió a.
6. Colocar 1% agarosa LMP en Metanosulfonato/E3 (~ 38 ^o C) sobre la larva de ' cabeza, llenando la cámara de carga ( figura 3E). Permita que la agarosa se solidifique con la larva en la posición correcta. Añadir Metanosulfonato/E3 a la cámara herida según sea necesario para mantener la hidratación. Repita este proceso para los restantes 2 canales de carga.
7. Con una aguja de jeringa, retire con cuidado cualquier agarosa que se filtraron a través del túnel de restricción en el compartimiento de la herida ( figura 3F). Añadir Metanosulfonato/E3 adicional ya sea a poco más de la agarosa (para herir, la proyección de imagen a corto plazo o herida tratamiento aislamiento) o para cubrir la placa de cultivo (para la proyección de imagen a largo plazo). Vuelva a colocar la tapa del plato de cultura para evitar la evaporación. Las larvas pueden ser reflejadas en este punto (permaneceran) o heridas.

5. Las larvas de la herida y proyección de imagen

1. utilizando una hoja de bisturí estéril, transecto la aleta de la cola posterior a la notocorda ¹¹ en la cámara de la herida ( figura 3 G, H). Añadir Metanosulfonato/E3 adicional si es necesario y vuelva a colocar la tapa del plato de cultura.
   Nota: Alternativamente, dependiendo de la ventana de tiempo de desarrollo de interés, las larvas pueden heridas, permitió recuperar en E3 y mantenidas en una incubadora (28.5 ^o C) hasta el tiempo de proyección de imagen deseado, momento en el que puede ser cargados en canales como descrito arriba.
2. Instalar el dispositivo de zWEDGI con larvas anestesiados en un microscopio invertido en una etapa de inserción que tendrá en cuenta el plato de fondo de vidrio de 60 mm. Busque la cola de la larva en el canal superior, rotando el plato según sea necesario para obtener la cola en la posición deseada. La imagen como sea necesario para el experimento específico.
   Nota: La zWEDGI es ampliamente aplicable para la alta resolución microscopia ligera, incluyendo widefield fluorescencia y microscopía de escaneo láser. Hay una serie de consideraciones de parámetro cuando proyección de imagen las larvas de pez cebra, pero determinados parámetros de la proyección de imagen son instrumento, la muestra y el experimento dependiente. Aquí, la cola larvaria era reflejada en una estructura de encargo microscopio multifotón ^{5 , 11} utilizando los siguientes parámetros: 40 X largo trabajo distancia agua objetivo de inmersión, 890 excitación láser de nm, 445/20 nm emisión filtro y resolución de 512 x 512.

6. Final del experimento

1. quitar el plato de zWEDGI de microscopio. Eutanasia a las larvas, colocando el zWEDGI en un baño de agua con hielo o a 4 ^o C por al menos 20 min y evaluar ausencia de latidos del corazón y la circulación de.
   Nota: Ya que las larvas se mantienen en compartimientos separados, las larvas pueden individualmente recuperar tirando suavemente sobre el agar con pinzas o con pipeta. El agar se puede quitar de la región de cabeza y la larva utilizado para procedimientos adicionales, tales como la fijación de anticuerpos o procesado para la extracción de ARN o proteína.
2. Después del retiro de las larvas y de agar, limpiar lo zWEDGI con etanol y agua destilada, como se describe en el paso 4.1 y boca abajo al aire seco. Almacén cubierto en un lugar fresco y seco. Vuelva a cubrir con leche descremada (paso 4.2) según sea necesario antes del próximo uso.
   Nota: zWEDGIs puede volver a utilizar varias veces, hasta que el PDMS empezará a salir del cristal.

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Resultados

El dispositivo de microfluidos zWEDGI PDMS es un dispositivo funcionalmente compartimentado diseñado para dar cabida a cuatro funciones principales (continuación) asociadas a la proyección de imagen viva de la aleta caudal hiriendo a curación y regeneración en las larvas de pez cebra. PDMS fue elegido para la fabricación de zWEDGI ya que no sólo es fácilmente disponible y un estándar de industria de biocompatibilidad, pero también funciona bien en moldes. Además, PDMS hace el d...

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Discusión

El propósito del aparato zWEDGI es capturar 3D lapso por estabilizar y orientar el pescado dentro de la pequeña distancia de un objetivo de microscopio de alta resolución de imagen. Cumpliendo con estas especificaciones de diseño, es también una mejora sobre la preparación tradicional de base de agar para la proyección de imagen vivo. Hay tres pasos fundamentales (abajo) en la fabricación de la zWEDGI, que, si no hecho correctamente, puede resultar en aparatos defectuosos:

Preparación...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fabricate molds
Solidworks Professional Accedemic Research 3D modeling software	Dassault Systemes	SPX0117-01	Fisher Unitech
Viper Si2 SLA 3D printer	3D Systems Inc.	23200-902	3D Systems Inc.
Accura 60 photopolymer resin	3D Systems Inc.	24075-902	3D Systems Inc.
denatured alcohol	Sunnyside	5613735	Menards
UV post cure apparatus	3D Systems Inc.	23363-101-00	3D Systems Inc.
TouchNTuff nitrile gloves	Ansell	92-600	McMaster Carr
220B, 400B, 600 grit T414 blue-bak sandpaper	Norton	66261139359, 54, 52	MSC
borosilicate glass disc, 2" diameter	McMaster-Carr	MIL-G-47033	McMaster-Carr
ultrasonicator cleaner	Branson	1510R-MTH
isopropyl rubbing alcohol 70%	Hydrox	54845T43	McMaster-Carr
10oz clear plastic cup	WNA Masterpiece	557405	Amazon
6"craft stick	Perfect Stix	Craft WTD-500	Amazon
Name	Company	Catalog Number	Comments
Fabricate zWEDGI PDMS device
Sylgard 184 silicon elastomeric kit	Dow-Corning	4019862	Ellworth Adhesives
10mL syringe	Becton Dickinson	305219	Vitality Medical Inc
desiccator	Bel-Art Scienceware	F42027-0000	Amazon
4 in ratcheting bar clamp	Pittsburgh	68974	Harbor Freight
lab oven	Quincy Lab Inc.	20GC	Global Industrial
tweezer set	Aven	549825	McMaster-Carr
compressed air filtered nozzle	Innotech	TA-N2-2000FT	Cleanroom Supply
vacuum bench vise	Wilton Tool Group	63500	MSC Industrial
55mm glass bottom dish; 30mm micro-well #1.5 cover glass	Cellvis	D60-30-1.5-N	Cellvis
plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC-001	Harrick Plasma
Name	Company	Catalog Number	Comments
Loading Larvae
Pipetteman, P200	Gilson	F123601
100% ethanol (diluted to 70% with water prior to use)	Pharmco-aaper	111000200
Transfer pipette	Fisherbrand	13-711-5A	Fisher Scientific
powdered skim milk		2902887	MP Biomedicals
double distilled water
N-phenylthiorurea	Sigma-Aldrich	P7629	Sigma-Aldrich
tricaine (ethyl 3-aminobenzoate)		C-FINQ-UE	Western Chemical
low melting point agarose	Sigma-Aldrich	A0701	Sigma-Aldrich
heat block (dry bath incubator)	Fisher Scientific	11-718-2	Fisher Scientific
E3 buffer
large orifice pipette tip, 200 uL	Fisherbrand	02-707-134	Fisher Scientific
General purpose pipette tip, 200 uL	Fisherbrand	21-197-8E	Fisher Scientific
#15 scalpel blade	Feather	2976	Amazon
25G syringe needle	BD	BD305122	Fisher Scientific
Name	Company	Catalog Number	Comments
Imaging
inverted microscope
Imaris imaging software	Bitplane